CN103389375A

CN103389375A - 一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒

Info

Publication number: CN103389375A
Application number: CN2013102900791A
Authority: CN
Inventors: 王孝举; 吴国君; 马胜林; 汪成发; 夏冰; 陈雪琴
Original assignee: Hengdian Group Jiayuan Chemical Industry Co ltd; Hangzhou First Peoples Hospital; Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Hengdian Group Jiayuan Chemical Industry Co ltd; Hangzhou First Peoples Hospital; Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103389375B

Abstract

本发明公开了一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒，包括：包被捕获抗体的微球、生物素标记的检测抗体、耦连Halotag Amine(O₂)ligand的微球、抗原蛋白、链霉亲和素-藻红蛋白和生物素标记的抗人免疫球蛋白G；其中，捕获抗体为CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl和ADAM8捕获抗体中的至少一种；检测抗体为CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl和ADAM8检测抗体中的至少一种，且与捕获抗体相对应；抗原蛋白为p62、CTAG、p53和CAGE中的至少一种；带有不同捕获抗体或抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码。本发明对抗原和自身抗体并行检测，准确率高。

Description

一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒

技术领域

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒。

背景技术

目前肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤。近20年来，由于大力推行戒烟，欧洲和美国等西方国家男性肺癌的发病率已开始下降。但女性肺癌的发病率却持续上升。我国是香烟生产和销售大国，不论男性还是女性。肺癌的发病率均呈持续上升趋势，尤以女性发病率上升更快。临床研究表明，原位癌治愈率接近100%。Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%～90%，而IIIb和Ⅳ患者的5年生存率仅5%～20%。提示早期诊断是改善肺癌预后的关键。据美国国立癌症研究所的统计资料显示，如果能在肺癌Ⅰ期作出诊断，其五年生存率可达90%以上；而在Ⅱ期以后，则五年生存率急剧降至20%以下；发展第Ⅲ、Ⅳ期，手术不但无益，而且还有可能促使肿瘤加快扩散，加速死亡。因此，如何提高肺癌早期诊断水平已成为肺癌防治工作者面临的严肃而紧迫的任务。

现今为止对肺癌的检测手段依赖于CT、MR、PET等影像检测仪器，但这些影像手段一般只能发现1-2cm以上的肿瘤，而肿瘤从病变到生长到1-2cm，一般要经过2-5年甚至更长的时间，因此癌症早期漏诊率高达80-90%。

目前，早期诊断癌症通常是通过验血寻找肿瘤标志物，特别是其中的蛋白标志。血清肿瘤标志物的测定方法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等。然而，这些方法都是单指标的检测方法：而对肿瘤进行单一标志物的检测始终存在着特异性不强、灵敏度低等不足，特别是对早期肿瘤的检出率不高，因此可能会造成部分患者漏诊。

血清中的肿瘤抗原等标志物能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤发生还未能被临床检查手段检测到的早期，机体免疫***就可监测到低水平表达的肿瘤抗原的存在，并引发免疫反应，产生大量的抗体，起到有效的生物信号放大作用。

对比临床常用的肿瘤标记物蛋白，自身抗体的检测在肿瘤诊断中占极大的优势。如，可以对肿瘤进行早期诊断，便于早期治疗，提高治愈率。多项研究表明在影像学检查确诊实体癌数月至数年前即可检测到自身抗体的存在，甚至在肿瘤确诊前2-10年就可检测到血清中有针对肿瘤抗原的抗体，同时自身抗体比相应肿瘤抗原的滴度高。

尽管如此，自身抗体的检测也有其局限性，比如在一般情况下，同种肿瘤可异常地产生一种或多种肿瘤自身抗体，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型既可检出共同的肿瘤抗体，也可检出不同的肿瘤抗体。

因此，如何将自身抗体和肿瘤抗原的检测联合起来，筛选出适合的肿瘤标记物组合，对提高肿瘤诊断的敏感性和准确性具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒，对血清中的抗原和抗体并行检测，不存在交叉反应，准确率高，可高通量、快速的实现早期肺癌的诊断。

一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒，包括：包被捕获抗体的微球、生物素标记的检测抗体、耦连Halotag Amine(O₂)ligand的微球、抗原蛋白、链霉亲和素-藻红蛋白和生物素标记的抗人免疫球蛋白G；其中，

捕获抗体为CRP捕获抗体、Prolactin捕获抗体、CEA捕获抗体、NSE捕获抗体、CK19捕获抗体、Axl捕获抗体和ADAM8捕获抗体中的至少一种；

检测抗体为CRP检测抗体、Prolactin检测抗体、CEA检测抗体、NSE检测抗体、CK19检测抗体、Axl检测抗体和ADAM8检测抗体中的至少一种，且与捕获抗体相对应；

抗原蛋白为p62、CTAG、p53和CAGE中的至少一种；

带有不同捕获抗体或抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码。

NSE：神经特异性烯醇化酶，烯醇化酶是一种糖酵解酶，普遍存在于哺乳动物的组织中，以系列同工酶二聚体的形式存在(αα、αβ、ββ、和γγ)。

CK19：Cyfra21-1，细胞角蛋白19片段，是分子量约30kDa的上皮细胞角蛋白的可溶性成分之一，是一种非常好的鉴别肺良恶性疾病的标志物，尤其对肺鳞癌的检测效果更好。

CEA：癌胚抗原，是一种存在于多种肿瘤细胞中的肿瘤抗原，肺癌细胞能直接产生CEA。

CRP：C反应蛋白，作为一种急性时相蛋白，受年龄、免疫状况、药物等因素影响较小，其对临床各种急、慢性感染，组织损伤等疾病的诊断、疗效观察及预后判断的意义已被人们所认识。

Axl：又被称为UFO，ARK，或Tyro7，最早是在白血病中作为一个转化基因被发现的。该蛋白由894个氨基酸组成，分子量为140KD，大致均匀分布在细胞膜的两侧。

ADAM8：解整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteases，ADAMs)是近年来发现的一类与细胞膜结合糖蛋白家族，参与细胞-细胞的黏连、细胞-基质的黏连、细胞融合、细胞外基质的降解及信号传导等过程。

Prolactin：泌乳素，为垂体前叶分泌的一种多肽蛋白激素，也叫催乳素(PRL)。

CAGE：肿瘤相关基因，属于癌-睾丸(cancer-testis CT)抗原家族成员，是2002年Cho等人采用重组克隆表达抗原的血清学分析技术，筛查睾丸组织cDNA文库时发现的一个新的癌-睾丸抗原编码基因。

p62：核孔蛋白，是相对分子质量约为62×10³的1个肿瘤相关抗原，属于***2(IGF2)mRNA结合蛋白家族的一员，又称MP2/IGF2BP2。

CTAG：NY-ESO-1，是1997年chen等利用SEREX技术从食管癌cDNA文库中筛选得到的肿瘤抗原，属CTA(cancer-testis antigen)家族，该家族成员只在睾丸组织和一些肿瘤组织中表达。

本发明以七种自身抗原以及四种抗原产生的自身抗体作为检测对象，本发明的液相芯片试剂盒中，捕获抗体和检测抗体均能特异的与相应的肺癌血清标志物(即CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl或ADAM8)结合，而链霉亲和素-藻红蛋白能够与生物素高度特异性的结合，因此可形成针对肺癌血清标志物的“微球-捕获抗体+血清标志物+检测抗体+链霉亲和素-藻红蛋白”复合物；另外，抗原蛋白和抗人免疫球蛋白G均能够特异的与相应的肺癌血清中的抗体(p62抗体、NY-ESO-1抗体、p53抗体或CAGE抗体)结合，而抗人免疫球蛋白G被藻红蛋白标记，因此可形成针对肺癌血清抗体的“微球-抗原蛋白+血清抗体+抗人免疫球蛋白G+链霉亲和素-藻红蛋白”复合物，

通过仪器检测，根据微球色彩不同确定反应类型，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球上结合的肺癌血清标志物和血清抗体的含量。

所述微球可采用常规的液相芯片用的微球即可。

所述捕获抗体为CRP捕获抗体、Prolactin捕获抗体、CEA捕获抗体、NSE捕获抗体、CK19捕获抗体、Axl捕获抗体和ADAM8捕获抗体中的至少两种。

所述捕获抗体为CRP捕获抗体和Prolactin捕获抗体。

制备包被微球时，捕获抗体的加入量为20～30μg/6.25×10⁶个微球。

优选的，所述抗原蛋白为CTAG。

每种包被捕获抗体的微球的浓度为1.2～1.8×10⁴个/μl，优选为1.2×10⁴个/μl。

耦连Halotag Amine(O₂)ligand的微球的浓度为1.2～1.8×10⁴个/μl，优选为1.2×10⁴个/μl。

每种生物素标记的检测抗体的浓度为0.8～1.2μg/ml，优选为1μg/ml。

生物素标记的抗人免疫球蛋白G的浓度为0.8～1.2μg/ml，优选为1μg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒基于液相芯片技术平台，可以对血清中CRP、Prolactin、CEA、NSE、CK19、Axl和ADAM8七种血清标志物以及p62抗体、CTAG抗体、p53抗体和CAGE抗体四种血清抗体中进行联合检测，通过对CTAG抗体、CRP和Prolactin进行联合检测，肺癌诊断的准确率高达91%，反应假阳性≤2%，对肺癌的诊断准确率高。

本发明用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒具有无副作用，高通量，敏感度高，重复性好，检测快速，准确，费用合算等优点。

附图说明

图1为检测CRP的标准曲线示意图；

图2为检测Prolactin的标准曲线示意图；

图3为检测CTAG自身抗体的标准曲线示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例作进一步的说明，但本领域的普通技术人员应当认识到，本发明并不限于这些实施例。

实施例1用于肺癌血清样本中CTAG抗体、CRP和Prolactin标志物检测试剂盒的制备

1、试剂和溶液

(1)0.1M NaH₂PO₄，pH6.2：称量3.5814g NaH₂PO₄于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.2后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

(2)0.05M MES，pH5.0：称量0.976g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至5.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

(3)0.1M MES，pH6.0：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

(4)0.1M MES，pH4.5：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至4.5后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

(5)PBS：NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na₂HPO₄，8.1mM；KH₂PO₄，1.5mM；pH7.2-7.4，0.22um滤膜过滤；

(6)1%PBSB：0.1%PBS中含0.02%Proclin300，0.22um滤膜过滤；

(7)0.1%PBST：0.1%PBS中含0.1%tween-20，0.22um滤膜过滤；

(8)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)；

(9)S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)。

2、用于肺癌早期诊断的液相芯片试剂盒，包括有：

(1)2-plex包被微球：含有包被CRP捕获抗体的34#微球、包被Prolactin捕获抗体的45#微球；不同种包被微球的浓度均为1.2×10⁴个/μl；

(2)耦联有HaloTag(O₂)amine ligand的55#和47#微球，耦联羊抗人IgG的42#微球；

(3)2-plex生物素标记检测抗体：分别用生物素标记的CRP检测抗体和Prolactin检测抗体的混合液；

(4)CTAG和Halo抗原蛋白；

(5)链霉亲和素-藻红蛋白；

(6)羊抗人免疫球蛋白G-生物素和人免疫球蛋白G；

(7)反应缓冲液：1%PBSB；

(8)稀释缓冲液：1%PBSB；

(9)封口膜；

(10)96孔板；

(11)质控液(CRP标准蛋白、prolactin标准蛋白)。

3、制备上述液相芯片试剂盒，包括如下步骤：

3.1按上述试剂盒的组成，每种捕获抗体包被相应的微球，制备方法相同：

（1）取45#、34#、42#微球(磁性微球，bio-rad)悬液，分别涡旋和超声20s后，各吸取200ul(6.25×10⁶个微球)至离心管中；

（2）14000g，离心4min，吸去上清；

（3）加入100ul ddH₂O，分别涡旋和超声20s；

（4）14000g，离心4min，吸去上清，加入160ul0.1M，pH6.2NaH₂PO₄，分别涡旋和超声20s；

（5）迅速加入20ul50mg/mL的S-NHS，涡旋混匀；

（6）迅速加入20ul50mg/mL的EDC，分别涡旋和超声约20s；

（7）避光旋转孵育20min，可每隔10min涡旋混匀一次；

（8）14000g，离心4min，小心吸去上清，加入250μL0.05M，pH5.0的MES，分别涡旋和超声约20s；

（9）14000g，离心4min，小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次；

（10）小心吸去上清，用50ul0.05M，pH5.0的MES重悬微球，分别涡旋和超声约20s；

（11）加25ug CRP捕获抗体(R&D Systems，产品编号为KXL0211061)、Prolactin捕获抗体(R&D Systems，产品编号为DJJ0111061)和山羊源的抗人免疫球蛋白G(Jackson ImmunoResearch Laboratories，货号：109-005-003)于对应型号微球中，加0.05M，pH5.0的MES至终体积为500ul，分别涡旋和超声约20s；

（12）避光旋转孵育2h；

（13）14000g，离心4min，小心吸去上清，加入1mL0.01%PBST，分别涡旋和超声约20s；

（13）14000g，离心4min，小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次；

（14）加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s；

（15）避光旋转孵育30min，封闭微球表面残余的活化羧基位点；

（16）14000g，离心4min，小心吸去上清，加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s；

（17）小心吸去上清，加入1%PBSB至终体积为200ul，分别涡旋和超声约20s；

（18）取2ul于38ul1%PBSB中，分别涡旋和超声约20s后，血球计数板计数；

（19）在离心管上标记微球浓度、耦联日期，然后放置4度避光保存；

3.2按上述试剂盒的组成，Halo Tag(O₂)Amine ligand耦联相应的微球，制备方法相同：

①取出55#、47#微球原液，分别涡旋和超声约20s，取200ul(约6.25×10⁶个)于离心管中，14000g，离心4min；

②轻轻吸去上清，加1ml0.1M，pH6.0的MES分别涡旋和超声约20s；

③14000g，离心4min，去上清；

④加40ul5mg/mLHalo Tag(O₂)Amine ligand，补充0.1M，pH6.0的MES至终体积450ul，涡旋混匀；

⑤加入50ul50mg/mL EDC(现配现用，0.1M，pH6.0的MES溶解)，分别涡旋和超声约20s；

⑥避光旋转孵育2h；

⑦加入500ul0.1M，pH4.5的MES，涡旋20s，14000g，离心4min；

⑧轻轻吸去上清，用500ul0.1M，pH4.5的MES洗两次；

⑨14000g，离心4min，小心吸去上清后，加0.1M，pH4.5的MES至终体积200ul，分别涡旋和超声约20s；

⑩取2ul于38ul1%PBSB中，分别涡旋和超声约20s后，血球计数板计数；

离心管上标记微球浓度、ligand耦联日期，然后放置4度避光保存；

实施例2本发明液相芯片试剂盒用于肺癌的检测

（1）使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温；

（2）取2-plex Halo Tag(O₂)Amine ligand耦连微球，涡旋混匀20s，超声20s，按每孔2500个微球取适量于500ul1%PBSB中；

（3）避光封闭1h；

（4）14000g，离心4min，吸取上清后加入对应蛋白，其中，CTAG(CreativeBiomart，货号CTAG1B-1512H)、Halo各0.2ug/孔，补充1%PBSB至终体积为500ul；

（5）室温避光孵育1h；

（6）将上述微球涡旋和超声约20s后，分装到96孔板中，10ul/孔；

（7）准备CRP(R&D Systems，产品编号为1229006)、Prolactin(R&DSystems，产品编号为1175435)、人IgG标准蛋白，取8个离心管分别标记上S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8，2倍梯度系列稀释，具体如表1：

表1

其中标准蛋白用1%PBSB作为稀释液，人IgG用不含IgG的血清基质作为稀释液，且为4倍稀释。

（9）打开洗板机---Prime----rinse(channel2)----Prime---放置96孔板----Run5：MAGX3；

（10）取2-plex捕获抗体包被微球，涡旋并混匀20s，按每孔2500个微球加入到1%PBSB中；

（11）立即加入稀释后的标准品，各30ul/孔；

（12）用铝箔纸包好平板，震荡孵育反应60min；

（13）0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3；

（14）以1：180的比例用1%PBSB稀释2-plex生物素标记检测抗体(生物素标记的CRP检测抗体，产品编号为DY2648，R&D system，生物素标记的Prolactin检测抗体，产品编号为DY682，R&D system)，各检测抗体的浓度均为1ug/ml，分装成50ul/孔；

（15）用铝箔纸包好平板，震荡孵育反应60min；

（16）0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3；

（17）1%PBSB稀释抗人IgG-生物素(浓度为1ug/ml)和SAPE(浓度为1ug/ml)，分装成50ul/孔；

（18）用铝箔纸包好平板，震荡孵育反应60min；

（19）0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3；

（20）100ul/well1%PBSB重悬微球，RT，震荡3-5min；

（21）于液相芯片分析仪上读取结果，仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样本的测值。

3.4结果分析

制作标准曲线时，CRP、Prolactin和人IgG标准物的预测浓度、实测浓度和MFI值参见表2，CRP、Prolactin和自身抗体的检测曲线如图1～3所示。

经计算得到，

CRP的标准曲线为：FI=99.8135+(4893.65-99.8135)/((1+(Conc/13.9421)^-0.878012))^1.02009；

Prolactin的标准曲线为：FI=7.03791+(852.475-7.03791)/((1+(Conc/25.6551)^-1.09938))^0.920591；

自身抗体的标准曲线为：FI=15.1731+(12382-15.1731)/((1+(Conc/517.673)^-1.2711))^0.857029。

表2标准物的标准曲线的制作

从附图和上述表中可以看出，CRP，Prolactin以及CTAG各指标标准曲线的线性在检测的浓度范围内R²≥0.99，用试剂盒测定外来质控品，相对误差≤±5%，四个指标联合可使肺癌诊断的准确率高达91%，反应假阳性≤2%。检测所需的血清量极少(2微升)，并且可以在三个小时内完成。

Claims

1.一种用于肺癌诊断的液相芯片试剂盒，包括：包被捕获抗体的微球、生物素标记的检测抗体、耦连Halotag Amine(O₂)ligand的微球、抗原蛋白、链霉亲和素-藻红蛋白和生物素标记的抗人免疫球蛋白G；其中，

抗原蛋白为p62、CTAG、p53和CAGE中的至少一种；

带有不同捕获抗体或抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码。

2.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为CRP捕获抗体、Prolactin捕获抗体、CEA捕获抗体、NSE捕获抗体、CK19捕获抗体、Axl捕获抗体和ADAM8捕获抗体中的至少两种。

3.如权利要求2所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为CRP捕获抗体和Prolactin捕获抗体。

4.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，制备包被微球时，捕获抗体的加入量为20～30μg/6.25×10⁶个微球。

5.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，所述抗原蛋白为CTAG。

6.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，每种包被捕获抗体的微球的浓度为（1.2～1.8）×10⁴个/μl。

7.如权利要求1所述的液相芯片试剂盒，其特征在于，耦连HalotagAmine(O₂)ligand的微球的浓度为（1.2～1.8）×10⁴个/μl。

8.如权利要求1所述的液相芯片，其特征在于，每种生物素标记的检测抗体的浓度为0.8～1.2μg/ml。