CN103383395B

CN103383395B - 一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒

Info

Publication number: CN103383395B
Application number: CN201310289479.0A
Authority: CN
Inventors: 马胜林; 王孝举; 吴国君; 夏冰; 陈雪琴; 王闻哲
Original assignee: Hengdian Group Jiayuan Chemical Industry Co ltd; Hangzhou First Peoples Hospital; Zhejiang Academy of Medical Sciences
Current assignee: Hengdian Group Jiayuan Chemical Industry Co ltd; Hangzhou First Peoples Hospital; Zhejiang Academy of Medical Sciences
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103383395A

Abstract

本发明公开了一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联抗原蛋白的微球、生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白、反应缓冲液和稀释缓冲液，抗原蛋白为p62、NY-ESO-1、p53和CAGE中的至少两种，其中，偶联不同抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码；二抗为抗人免疫球蛋白G。本发明用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，在液相芯片的技术平台上，实现了对血清中四种抗体的联合检测，且以p62抗体、NY-ESO-1抗体、p53抗体和CAGE抗体为标志，检测准确性高，为肺癌的早期诊断提供了新的思路。

Description

一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒

技术领域

本发明涉及医药生物领域，尤其涉及一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒。

背景技术

近年来，我国癌症的发生率呈明显上升趋势，占死亡原因的20%以上，居各类死因之首。世界卫生组织预测，到2020年，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数达1200万，且绝大多数发生在发展中国家。如果不采取任何有效的预防与控制措施，预计到2020年，我国每年的新发生癌症总数和癌症死亡总数将达300万左右，患病总数将达660万。

肺癌目前是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近20年来，由于大力推行戒烟，欧洲和美国等西方国家男性肺癌的发病率已开始下降，但女性肺癌的发病率却持续上升。我国是香烟生产和销售大国，不论男性还是女性，肺癌的发病率均呈持续上升趋势，尤以女性发病率上升更快。临床研究表明，原位癌治愈率接近100%，Ⅰ期肺癌患者的5年生存率达60%～90%，而IIIb和Ⅳ期患者的5年生存率仅5%～20%，因此，早期诊断早期发现，早期治疗是降低肺癌死亡率，延长生存期的关键。然而，由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14%左右。因此，如何提高肺癌早期诊断水平已成为肺癌防治工作者面临的严肃而紧迫的任务。

血清中的肿瘤抗原等标志物能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤发生还未能被临床检查手段检测到的早期，机体免疫***就可监测到低水平表达的肿瘤抗原的存在，并引发免疫反应，产生大量的抗体，起到有效的生物信号放大作用。

对比临床常用的肿瘤标记物蛋白，自身抗体的检测在肿瘤诊断中占极大的优势。第一，可以对肿瘤进行早期诊断，便于早期治疗，提高治愈率。多项研究表明在影像学检查确诊实体癌数月至数年前即可检测到自身抗体的存在，甚至在肿瘤确诊前2-10年就可检测到血清中有针对肿瘤抗原的抗体。第二，自身抗体比相应肿瘤抗原滴度高，针对单一抗原的自身抗体通过免疫反应大量扩增，在血清中大量白蛋白存在干扰的情况下，较其它标志物更易检测到。因此分析肿瘤患者免疫***的改变，而不是肿瘤蛋白本身成为一个非常重要的研究途径。第三，标本易获得，检测结果相对稳定。肿瘤抗原一旦被分泌入血，可能很快地被降解或清除，而自身抗体不像其它多肽一样易受蛋白酶水解作用，可在相当长一段时间内在血清中稳定、持续存在，并且自身抗体的半衰期很长，大约是7天，每小时的波动很小，理化性质稳定，在-80C长期保存对其活性几乎无影响。第四，其操作所用的试剂和技术简便易行，重复性好，通过常规的酶联免疫吸附试验（ELISA）或酶联免疫分析（EIA）就可以检测。

肿瘤发生是一个多基因、多步骤的癌变过程，尽管肿瘤自身抗体是肿瘤诊断的理想候选指标，仅靠一个指标进行诊断，常常会导致假阳性和假阴性，所以，单个肿瘤自身抗体检测必然存在一些局限性，影响肺癌的临床诊断。其一，在特定肿瘤中，单一的肿瘤自身抗体的阳性率通常只有10%，在最理想的肿瘤群体中也仅为20-30%；其二，肿瘤发病中的很多生物途径为多种疾病（包括肿瘤以及其他自身免疫性疾病）所共有，一般情况下，同种肿瘤可异常地产生一种或多种肿瘤自身抗体，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型既可检出共同的肿瘤抗体，也可检出不同的肿瘤抗体。

近年来的研究倾向于针对联合抗体谱进行癌症检测。Chapman等运用ELISA对肺癌（包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌）患者与正常对照人群血清中针对7种肿瘤抗原（p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5）的血清抗体进行检测，结果显示单一抗体检出阳性率在5%-36%之间，诊断的特异性达到96%-100%，而7种抗体联合检测的敏感性可达76%，特异性为92%。这充分说明肿瘤标志物的单项检测，特异性较高，但敏感性和准确性较低；联合检测后，虽然特异性有所降低，但敏感性和准确性均有很大的提高。

因此联合检测多种肿瘤相关的自身抗体，形成肿瘤本身独有的自身抗体“指纹图谱”，将诊断及预后的特异性和敏感性提高到单一个体所无法达到的水平，由于这些自身抗体通常在临床症状前出现，因而具有重要的诊断和预后判断价值。

发明内容

本发明提供了一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，实现了血清中多种抗体的联合检测，对肺癌的检测准确性高。

一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联抗原蛋白的微球、生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白、反应缓冲液和稀释缓冲液，抗原蛋白为p62、NY-ESO-1、p53和CAGE，其中，偶联不同抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码；二抗为生物素标记的抗人免疫球蛋白G。

CAGE：肿瘤相关基因，属于癌-睾丸(cancer-testis CT)抗原家族成员，是2002年Cho等人采用重组克隆表达抗原的血清学分析技术，筛查睾丸组织cDNA文库时发现的一个新的癌-睾丸抗原编码基因。

p62：核孔蛋白，是相对分子质量约为62×103的1个肿瘤相关抗原，属于***2（IGF2）mRNA结合蛋白家族的一员，又称MP2/IGF2BP2。

NY-ESO-1：是1997年chen等利用SEREX技术从食管癌cDNA文库中筛选得到的肿瘤抗原，属CTA（cancer-testis antigen）家族，该家族成员只在睾丸组织和一些肿瘤组织中表达。

p53：p53基因是一种抗癌基因，定位于人类染色体17p13.1，编码393个氨基酸组成的分子量为53kD的核内磷酸化蛋白，被称为p53蛋白。

本发明以抗原蛋白p62、NY-ESO-1、p53和CAGE产生的自身抗体作为检测对象，在本发明的液相芯片试剂盒中，抗原蛋白和二抗均能够特异的与相应的肺癌血清中的抗体（p62抗体、NY-ESO-1抗体、p53抗体或CAGE抗体）结合，而链霉亲和素-藻红蛋白能够与生物素高度特异性的结合，因此，最终可以形成针对肺癌血清抗体的“微球-抗原蛋白+血清抗体+二抗+链霉亲和素-藻红蛋白”复合物，通过仪器检测，根据微球色彩不同确定反应类型，以绿色激光激发藻红蛋白，测定微球上结合的报告荧光分子的数量，用于间接确定微球上结合的肺癌血清抗体的含量。

所述的反应缓冲液可以为1%PBSB。

所述稀释缓冲液可以为1%PBSB。

所述抗原蛋白为p62、NY-ESO-1、p53和CAGE。

所述抗原蛋白可通过HaloTag^TM可互换标记技术与微球进行连接。

p62蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码p62蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；NY-ESO-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码NY-ESO-1蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示；p53蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码p53蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示；CAGE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；，编码CAGE蛋白的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述二抗为羊抗人免疫球蛋白G，实验发现鼠源抗体会产生交叉反应，而羊源的抗体则能够克服该缺陷。

所述微球可采用常规的液相芯片用的微球即可。

制备偶联抗原蛋白的微球时，抗原蛋白的加入量为5～10μg/6.25×10⁶个微球，优选为6.25μg/6.25×10⁶个微球。

每种偶联抗原蛋白的微球的浓度为1.2～1.8×10⁴个/μl，优选为1.2×10⁴个/μl。

生物素标记的二抗的浓度为0.1～0.125μg/ml，优选为0.1μg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，实现了对血清中四种抗体的联合检测，且以血清中的p62抗体、NY-ESO-1抗体、p53抗体和CAGE抗体为标志，检测准确性高，为肺癌的诊断和预后提供了新的工具和思路。

本发明用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒基于液相芯片的技术平台，能够高通量的对微量样本进行快速的检测，液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于反应进行，灵敏度高，信噪比好。

附图说明

图1为肺癌患者以及健康对照中的单分子自身抗体的分布；

图2为3种生物统计学算法（CCP，DLDA，BCCP）分析本发明液相芯片试剂盒检测的准确性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1液相芯片试剂盒的制备

试剂和溶液

（1）0.1M NaH₂PO₄，pH6.2：称量3.5814g NaH₂PO₄于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.2后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

（2）0.05M MES，pH5.0：称量0.976g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至5.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

（3）0.1M MES（2-（N-吗啉代）乙磺酸），pH6.0：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至6.0后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

（4）0.1M MES，pH4.5：称量1.952g MES于90mL ddH₂O中，NaOH调节pH至4.5后，定容至100mL，0.22um滤膜过滤；

（5）PBS：NaCl，137mM；KCl，2.7mM；Na₂HPO₄，8.1mM；KH₂PO₄，1.5mM；pH7.2-7.4，0.22um滤膜过滤；

（6）1%PBSB：0.1%PBS中含0.02%Proclin300，0.22um滤膜过滤；

（7）0.1%PBST：0.1%PBS中含0.1%tween-20，0.22um滤膜过滤；

（8）1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）；

（9）N-羟基硫代琥珀酰亚胺（S-NHS）。

1、用于检测自身抗体的液相芯片试剂盒，包括有：

1）偶联有Halo amine(O2)ligand的55#、47#、27#、33#微球；

2）含Halo Tag的融合蛋白：p62、NY-ESO-1、p53、CAGE；

3）链霉亲和素-藻红蛋白；

4）羊抗人IgG-生物素：浓度为0.1μg/ml；

5）反应缓冲液：1%PBSB；

6）稀释缓冲液：1%PBSB；

7）封口膜；

8）96孔板。

制备上述液相芯片试剂盒，包括如下步骤：

1、重组蛋白诱导表达与纯化

试剂和溶液：

KRX重组菌（分别含有如SEQ ID NO.1～4所示的基因，-80℃保存）

酵母粉（OXOID）

蛋白胨（OXOID）

Halo tag protein purfication resins（Promega）

Protease inhibitor（Roche）

Lysozyme（TOPBIO）

DNase I

TEV protease（Promega）

His link树脂（Promega）

纯化柱（BIO-RAD）

CA-630（Sigma）

LB培养基（10.0g蛋白胨，5.0g酵母粉，5.0gNaCl，调PH至7.0～7.5定容至1L，120°高压灭菌20min）

缓冲液1（50mM Hepes，PH7.5，150mM NaCl，1mM DTT）

缓冲液2（50mM Hepes，PH7.5，150mM NaCl，1mM DTT，0.5mMEDTA，0.05%CA630）

实验步骤：

一、重组菌大量诱导表达

1、过夜扩增

从-80度冰箱拿出保存的KRX重组菌，加入到10ml含有0.2%葡萄糖的氨苄抗性LB培养基中，37℃275rpm过夜扩增。

2、扩大培养

将过夜的菌体按照1:100加入到1L含有氨苄抗性的LB培养基中37℃275rpm培养至OD=0.4-0,5，培养基中加入终浓度为0.05%的葡萄糖和鼠李糖，25℃225rpm培养过夜。

3、5000g离心15min收集菌体，100ml/管，做好标记置于-80°保存。

二、KRX重组菌细胞裂解

1、取1管-80°冻存的KRX重组菌，加入15ml缓冲液1重悬后分别加入100ul Protease inhibitor、10ul Lysozyme（100mg/ml）、10ul DNase I（5mg/ml）、100ul1%CA-630；重悬菌体，混匀后冰浴放置30min。

2、超声破碎菌体（超5s，停10s，85%功率，3min），冰上放置10min。

3、12000g，4°离心30min，取上清，取100ul上清到1.5ml离心管中（其中50ul标记为S，另外50ul+10ul1:100稀释的TEV酶标记为S-TEV）。

4、离心同时清洗Halo link：分别取1管2ml的Halo link beads，3300rpm离心5min弃上清，加入2ml洗涤缓冲液到beads中混匀后3300rpm离心5min弃上清，重复洗涤2次。

5、将清洗完毕的Halo link加入到离心的菌液上清中，室温混匀孵育结合2小时。

6、将上述混合液加入到纯化柱中重力过柱，收集滤液100ul（FT）；然后加入洗涤缓冲液10ml，重悬后室温混匀孵育10min，后弃滤液，重复洗涤4次。

7、关闭纯化柱，加入3ml的洗涤缓冲液，放1ml后关闭加入5ul TEV酶后封闭纯化柱，37°反应1h。

8、过柱收集滤液（E1-1），加入2ml纯化缓冲液到柱子中，封柱混匀10min，过滤收集滤液标记为（E1-2），后加入10ul His link树脂到混合均匀的E1-1和E1-2中，室温孵育1h，1000g离心收集上清标记为E2。

2、蛋白与微球偶联

将纯化的p62、NY-ESO-1、p53、CAGE重组蛋白分别与55#、47#、27#、33#微球偶联。

试剂和溶液：

（6）1%PBSB：0.1%PBS中含0.02%Proclin300，0.22um滤膜过滤；

（7）0.1%PBST：0.1%PBS中含0.1%tween-20，0.22um滤膜过滤；

（8）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）

（9）N-羟基硫代琥珀酰亚胺（S-NHS）。

实验步骤：

（1）取出微球原液，涡旋20s，超声20s，取50ul（约6.25×10⁶个微球）于Axygen EP管中（标记微球型号和名称），14000x g，4mins；

（2）14000g，RT（室温），4min；

（3）小心吸去上清，为减少损失可残留少量上清；

（4）加入100ul dH₂O，分别涡旋和超声约20s；

（5）14000g，RT，4min；

（6）小心吸去上清，为减少损失可残留少量上清，加入80ul0.1MNaH₂PO₄，pH6.2，分别涡旋和超声约20s；

（7）迅速加入10ul S-NHS（ddH₂O溶解至50mg/mL），涡旋混匀；

（8）迅速加入10ul EDC（ddH₂O溶解至50mg/mL），分别涡旋和超声约20s；

（9）RT，避光旋转孵育20min（每隔10min涡旋一次）；

（10）14000g，RT，4min；

（11）小心吸去上清，加入0.05M MES，pH5.0至125μL，分别涡旋和超声约20s；

（12）14000g，RT，4min；

（13）小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次；

（14）小心吸去上清，用12.5ul 0.05M MES，pH5.0重悬微球，分别涡旋和超声约20s；

（15）加6.25ug实施步骤1纯化得到的蛋白于上述微球中，至终体积为250ul 0.05M MES，pH5.0，分别涡旋约20s；

（16）RT，避光旋转孵育2h；

（17）14000g，RT，4min；

（18）小心吸去上清，加入1mL0.01%PBST，分别涡旋和超声约20s；

（19）14000g，RT，4min；

（20）小心吸去上清，重复上述洗涤步骤一次；

（21）加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s；

（22）RT，避光旋转孵育30min，封闭微球表面残余的活化羧基位点；

（23）14000g，RT，4min；

（24）小心吸去上清，加入1mL1%PBSB，分别涡旋和超声约20s；

（25）小心吸去上清，加入1%PBSB至终体积为37ul，分别涡旋和超声约20s；

（26）取2ul于38ul1%PBSB中，涡旋20s，超声20s后，血球计数板计数，最终浓度（个/mL）。

（27）在Axygen离心管上标记微球浓度（1.2×10⁴个/μl）、偶联时间，然后放置4度避光保存。

实施例2肺癌检测试验

1、检测方法

（1）使用前先取出所有试剂，放置平衡至室温；

（2）-80℃取出患者（患肺癌）和健康人的血清，分别放置在冰上融化后，涡旋混匀，取V型96孔血凝板（96孔板）将血清稀释200倍，枪头上下混匀，尽量不产生气泡；

（3）取实施例1中的4种偶连抗原蛋白的微球，涡旋混匀20s，超声20s，按每孔2500个取适量于1000ul1%PBSB中，涡旋混匀20s，超声20s，终体积为10ul/孔；

（5）打开洗板机---Prime----rinse（channel2）----Prime---放置96孔板---Run5：MAGX3；

（6）立即加入稀释200倍的血清，30ul/孔；

（7）用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min；

（8）0.1%PBST洗三次，Run5：MAGX3；

（9）1%PBSB稀释羊抗人IgG-生物素（1：5000）和SAPE（1：500），50ul/孔；

（10）用铝箔纸包好96孔板，室温，震荡孵育反应60min；

（11）1%PBST洗三次，Run5：MAGX3；

（12）100ul/孔1%PBSB重悬微球，室温，震荡3-5min；

（13）于Luminex系列液相芯片分析仪上读取结果，仪器可自动绘制标准曲线，并计算出待测样本的测值。

2、结果分析

图1显示了48个早期肺癌以及48个健康对照中的单分子自身抗体的分布。

利用3种生物统计学常用的算法（CCP，DLDA，BCCP）分析，发现通过检测自身产生中的p62抗体、NY-ESO-1抗体、p53抗体和CAGE抗体，准确率可达72%。

Claims

1.一种用于检测肺癌自身抗体的液相芯片试剂盒，包括偶联抗原蛋白的微球、生物素标记的二抗、链霉亲和素-藻红蛋白、反应缓冲液和稀释缓冲液，其特征在于，

抗原蛋白为p62、NY-ESO-1、p53和CAGE，其中，偶联不同抗原蛋白的微球具有不同的颜色编码；

二抗为羊抗人免疫球蛋白G；

制备偶联抗原蛋白的微球时，抗原蛋白的加入量为5～10μg/6.25×10⁶个微球；

每种偶联抗原蛋白的微球的浓度为1.2～1.8×10⁴个/μl；

生物素标记的二抗的浓度为0.1～0.125μg/ml。