CN103382475B - 植物耐旱耐碱相关的dna片段及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物耐旱耐碱相关的DNA片段及其应用。该DNA片段来源于旋蒴苣苔(Boea hygromettica(Bunge)R.Br)，由序列表序列1中第7位至第6375位核苷酸序列组成。在25%的PEG渗透胁迫下，转化该DNA片段的T3代纯合转基因拟南芥植株的主根明显长于野生型拟南芥；在pH8.0的碱性胁迫下，侧根数明显多于野生型拟南芥，且地上部分生长相对较旺盛。本发明对培育耐旱耐碱作物、林草新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，为培育高耐逆性植物提供模式植物和农作物所不能提供的特异性抗逆资源基因。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的一种植物耐旱耐碱相关的DNA片段及其应用。
背景技术
“有收无收在于水”，目前干旱已成为困扰世界粮食生产的主要问题之一。干旱对植物造成的伤害是多方面的，影响植物的各种生理过程。近年来人们通过各种方法鉴定和定位了很多与抗旱相关的基因，并通过基因工程的方法，获得了一些在一定程度上抗旱的转基因植物，但是，随着全球气候的恶化，要从根本上大幅度地提高作物的抗旱性，避免减产甚至由于农作物的死亡而造成的绝收，就必须找到更多能够抗严重干旱的基因，确定它们在抵御干旱和脱水中的功能，分析它们之间的协同作用与调控特点，才能更有效地应用于提高作物抗旱性的育种和栽培。因此，这种能够忍耐极度干旱的植物资源成为了研究的目标。寻找抗严重干旱的基因，研究基因间互作和调控机制，培育优质的抗旱性转基因农作物，不仅是提高我国粮食生产的需要，也是抵御美国廉价转基因作物的战略需求。
更苏植物能够忍耐极度干旱的环境，萎而不死，以类似于休眠的方式度过不良环境，在水分充足的条件下又可以恢复正常生长。但是，大多数更苏植物是比较低等的苔藓、裸子植物，亲缘关系与粮食作物距离相对较远，抗旱机制也比较特殊，在转基因技术上存在很大的困难。旋蒴苣苔(Boea hygrometrica(Bunge)R.Br)属于苦苣苔科旋蒴苣苔属，是更苏植物中少有的在我国分布的被子植物之一。旋蒴苣苔具有分布广、适应性强（耐旱、耐热、耐碱、耐高钙）和基因组小等特点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种DNA片段，该DNA片段的名称为Bh1-4，来源于旋蒴苣苔(Boea hygrometrica(Bunge)R.Br)，可用于培育耐旱耐碱转基因植物，所述DNA片段为如下1）-4)DNA分子中的任意一种：
1）由序列表序列1中第7位至第6375位核苷酸序列组成的DNA分子；
2）与1）限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交的DNA分子；
4）序列表序列1的第7位至第6375位核苷酸序列所示DNA片段中的任意一段具有转录水平调控元件功能的DNA分子，或由序列表序列1的第7位至第6375位核苷酸序列所示DNA片段中的任意一段具有编码植物耐逆性相关蛋白的功能的DNA分子或具有产生非编码RNA功能的DNA分子；所述调控元件可为启动子或增强子，所述非编码RNA可为siRNA或miRNA；
所述耐逆性为耐旱性和/或耐碱性。
序列表序列1由6381个碱基组成，其中，第1位至第6位核苷酸序列和第6376位至6381位核苷酸序列为限制性内切酶BamH I的识别序列。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1% SDS和1×SSC，0.1% SDS各洗膜一次。
含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA片段的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述DNA片段构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的DNA片段构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
所述重组载体可为将所述DNA片段***载体pCLD04541得到表达所述DNA片段的重组载体，具体可为将所述DNA片段***载体pCLD04541的BamH I位点得到的表达所述DNA片段的重组载体。
本发明保护扩增所述DNA片段全长或其任意片段的引物对，该引物对可用于获得所述DNA片段的全长或其任意片段，或用于鉴定目的植物的基因组中是否导入了所述DNA片段的全长或其任意片段；
所述PCR引物对可由序列表序列2、3、5或7所示的单链DNA与序列表序列4、6或8所示的单链DNA组成；具体可由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成，或由序列表序列6所示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。
用于鉴定所述DNA片段表达的PCR引物对，由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成，所述表达具体可为转录水平的表达。
本发明保护所述DNA片段在培育耐逆性植物中的应用；所述耐逆性可为耐旱性和/或耐碱性。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述DNA片段导入目的植物，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物，所述耐逆性可为耐旱性和/或耐碱性。
在上述方法中，所述目的植物可为双子叶植物或单子叶植物。
在上述方法中，所述双子叶植物具体可为拟南芥。
上述耐碱性具体可为耐pH8.0的碱性环境。
耐逆性实验证明，转化Bh1-4片段（即序列表序列1中第7位至第6375位核苷酸序列所示DNA片段）的T3代纯合转基因植株在25%的PEG渗透胁迫下，转基因株系主根明显长于野生型和转空载体对照；在pH8.0的碱性胁迫下，转基因株系侧根数明显多于野生型，且地上部分生长更旺盛。
本发明对培育耐旱耐碱作物、林草新品种具有重要的理论及实际意义，可应用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，为培育高耐逆性植物提供模式植物和农作物所不能提供的特异性抗逆资源基因。
附图说明
图1为重组根癌农杆菌的PCR鉴定电泳图。其中，图A为引物M13F-47和1-4R的扩增结果，从左至右的泳道依次为：为以质粒pCLD04541-Bh1-4为模板的扩增条带（425bp）、以根癌农杆菌GV3101菌液为模板的扩增产物、以重组根癌农杆菌GV3101/pCLD04541-Bh1-4为模板的扩增条带（425bp）和分子量标准；图B和C为以pCLD04541-Bh1-4为模板用不同的引物对进行扩增获得的条带，其中的泳道M为分子量标准，泳道1为以M13F-47和1kR为引物的扩增条带（1328bp），泳道2为以1KF和3kR为引物的扩增条带（3277bp），泳道3为以3kF和4kR为引物的扩增条带（1747bp），泳道4为以4kF和M13R-48为引物的扩增条带（2474bp）；图D为以M13F-47和M13R-48为引物的扩增结果，从左至右的泳道依次为：分子量标准、以pCLD04541为模板的扩增条带（275bp）、以根癌农杆菌GV3101为模板的扩增结果和以重组根癌农杆菌GV3101/pCLD04541为模板的扩增条带。
图2为转基因拟南芥株系植株的PCR鉴定电泳图。其中，M为分子量标准，+为pCLD04541-Bh1-4阳性对照，WT1和WT2为野生型拟南芥Col-0阴性对照，1-6分别为2个转基因株系内的部分植株。
图3为转空载体对照植株的PCR鉴定电泳图。其中，M为分子量标准，+为pCLD04541阳性对照，WT为野生型拟南芥Col-0阴性对照，CKL为转空载体对照植株。
图4为PEG渗透胁迫前后转基因拟南芥株系植株的生长状态。其中，左图为PEG渗透胁迫前在MS培养基上的生长状态，右图为25%PEG渗透胁迫12天的生长状态，WT为野生型拟南芥对照，L为转基因拟南芥株系植株，CK为转空载体对照植株。
图5为pH8.0碱性胁迫前后转基因拟南芥株系植株的生长状态。其中，左图为pH8.0碱性胁迫前在1/2MS培养基上培养4-5天的生长状态，右图为pH8.0碱性胁迫27天的生长状态，WT为野生型拟南芥对照，L1和L2分别为2个转基因拟南芥株系的植株。
图6为转基因拟南芥的RT-PCR电泳图。其中，WT为野生型拟南芥对照，L1和L2分别为2个转基因拟南芥株系的植株，18S为扩增内参基因表达产物的结果，Exon1为扩增外源片段Bh1-4表达产物的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
载体pCLD04541：中国科学院植物研究所，文献：Ian Bancroft,Karina Love,Elisabeth Bent,Sarah Sherson,Clare Lister,Christopher Cobbett,Howard M.Goodman and Caroline Dean.A strategy involving the use of high redundancy YACsubclone libraries facilitates the contiguous representation in cosmid and BACclones of 1.7Mb of the genome of the plant Arabidopsis thaliana.Weeds World4,1–9(1997).
根癌农杆菌GV3101（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101）：中国科学院植物研究所，文献：Binary Agrobacterium vectors for plant transformation,MBevanin,Nucleic Acids Research(1984)12(22):8711-8721。
哥伦比亚生态型拟南芥Col-0（ecotype columbia，Arabidopsis thaliana）：中国科学院植物研究所，文献：Arabidopsis,a useful weed.Meyerowitz EM,Cell(1989)56:263-270。
实施例1、利用DNA片段Bh1-4培育耐旱耐碱转基因植物
1、构建植物表达载体
制备序列表序列1所示的长为6381bp的DNA片段，用限制性内切酶BamH I酶切后与经BamH I酶切的pCLD04541的载体骨架相连接，获得重组植物表达载体pCLD04541-Bh1-4，经测序证实，该重组植物表达载体为载体pCLD04541的BamH I酶切位点处***了序列表序列1的第7位至第6375位核苷酸序列所示的DNA片段（命名为Bh1-4片段）。
2、制备重组根癌农杆菌
将步骤1制备的重组植物表达载体pCLD04541-Bh1-4在2.2kv电压下电击转化根癌农杆菌GV3101，经PCR和测序证实，获得了含有质粒pCLD04541-Bh1-4的根癌农杆菌GV3101，将该重组根癌农杆菌命名为GV3101/pCLD04541-Bh1-4。
同时，以相同方法将载体pCLD04541电击转化根癌农杆菌GV3101，经PCR和测序证实，获得了含有质粒pCLD04541的根癌农杆菌GV3101，将该重组根癌农杆菌命名为GV3101/pCLD04541。
鉴定上述两种重组根癌农杆菌的PCR引物及扩增结果如表1和图1所示。
表1.重组根癌农杆菌PCR鉴定所用的引物及结果
3、获得转基因拟南芥植株
将步骤2获得的重组根癌农杆菌GV3101/pCLD04541-Bh1-4转化野生型的哥伦比亚生态型拟南芥Col-0（ecotype columbia，Arabidopsis thaliana），获得转基因拟南芥，具体方法如下：
1）将重组根癌农杆菌GV3101/pCLD04541-Bh1-4接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；
2）将步骤1）的菌液转至YEP液体培养基（含50μg/ml庆大霉素和50μg/ml利福平）中，28℃、300rpm培养约24小时（菌液OD600达到0.8）；
3）收集菌体,4℃、4000g离心10min，用5%的蔗糖溶液稀释至OD600约为1.0；
4）将野生型拟南芥Col-0整株与花盆一起倒扣在盛有步骤3）的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24小时后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T0代种子；
5）将步骤4）获得的T0代种子播种于含卡那霉素50mg/L的MS固体培养基上培养，筛选出抗性植株（大部分非转基因植株黄化死去，而转基因植株能够正常生长），移栽至土壤中种植，单株收获抗性植株上所结的T1代种子。
按照同样的方法种植筛选T1代种子，移栽卡那霉素抗性分离比为3:1的T1代株系3个，并单株收获T1代株系内各单株上所结T2代种子，随机取8个T2代株系种子按照同样的方法进行卡那霉素抗性筛选，得到3个T2代不再产生卡那霉素抗性分离的纯合转基因株系。单株收获T2代为纯合转基因株系的T3代种子，进行下述步骤5的耐逆性鉴定。
同时，以相同的方法转化空载体pCLD04541作为空载体对照，得到T2代纯合的转空载体对照株系1个。
T0代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T1代表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株；T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株；株系表示由上一代的同一植株自交所产生的种子或植株群体。
4、转基因拟南芥植株的PCR鉴定
取步骤3得到的3个T2代不再产生卡那霉素抗性分离的纯合转基因株系T3代植株叶片，提取基因组DNA，用表1中的引物M13F-47和1-4R进行PCR扩增，结果全部呈阳性，而野生型拟南芥呈阴性，部分植株的PCR产物电泳结果如图2所示。
同时，用引物对M13F-47和M13F-48对步骤3得到的T2代纯合转空载体对照株系T3代植株进行PCR检测，结果全部呈阳性；而阴性对照野生型拟南芥呈阴性，结果如图3所示。
5、转基因拟南芥植株的耐逆性鉴定
1）耐旱性鉴定
从步骤3的3个T2代不再产生卡那霉素抗性分离的纯合转基因株系（命名为L1、L2和L3）中随机取T3代种子，同时取野生型拟南芥（WT）种子及纯合转空载体对照株系的T3代种子30-50粒，同时播种于同一MS固体培养基竖板上正常培养4-5天，再将幼苗移至同一被25%PEG8000浸泡过的MS固体培养基竖板上（即每100mL不加糖的MS培养液溶解25g PEG8000，得到25%的PEG溶液，按照3:2的体积比将25%的PEG溶液倒入MS固体培养基上，浸泡12-14h，然后倒掉PEG溶液吹干）上，正常培养12天后，统计主根长，实验设3次重复，结果如表2所示，其中，移苗前后竖板上植株的生长情况如图4所示。
表2.转基因拟南芥植株抗旱性鉴定的主根长统计结果（单位：cm）
| 植株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
| 转基因拟南芥 | 3.47±0.43 | 3.75±0.5 | 5.07±0.67 | 4.1±0.85 |
| 野生型拟南芥 | 2.97±0.34 | 2.72±0.23 | 3.17±0.58 | 2.95±0.22 |
| 转空载体对照 | 2.65±0.17 | 3.0±0.29 | 2.57±0.33 | 2.74±0.23 |
表2和图4的结果表明：进行25%PEG8000胁迫后，转基因拟南芥的主根明显长于野生型和转空载体对照植株。
2）耐碱性鉴定
取纯合转基因拟南芥株系L1和L2的T3代种子、野生型拟南芥（WT）种子及纯合转空载体对照株系的T3代种子各80-100粒，同时播种于同一1/2MS固体培养基（pH5.8）竖板上正常培养4-5天，再将幼苗移至同一移至pH8.0的1/2MS竖板上胁迫培养27d天后观察生长情况（结果如图5所示），同时统计侧根数，实验设3次重复，结果如表3所示。
表3.转基因拟南芥植株抗碱性鉴定的侧根数统计结果
| 植株 | 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值 |
| 转基因拟南芥 | 4.66±0.57 | 4.07±0.7 | 4.8±0.36 | 4.51±0.38 |
| 野生型拟南芥 | 2.33±0.57 | 2.75±0.43 | 1.97±0.21 | 2.35±0.39 |
| 转空载体对照 | 2.67±0.58 | 2.12±0.32 | 2.4±0.6 | 2.4±0.28 |
表3和图5的结果表明：在pH8.0碱性条件下转基因株系的侧根数明显高于野生型和转空载体对照，而且地上部分生长也比较旺盛，表明拟南芥转基因株系更加耐碱。
6、转基因拟南芥中外源片段Bh1-4的RT-PCR检测
取纯合转基因拟南芥株系L1和L2的T3代种子、野生型拟南芥（WT）种子及纯合转空载体对照株系T3代种子，在MS培养基上生长2周，收集各样品约30mg，提取总RNA，反转录得到cDNA，将反转录得到的cDNA稀释40倍作为模板，用引物Exon1F：5’-ggtttgttgggaagaagttgg-3’（如序列表序列9所示，对应序列表序列1的第1471-1491位）和Exon1R：5’-caaacggacgaactaacctatg-3’（如序列表序列10所示，对应序列表序列1的第1724-1703位）进行PCR检测，预测扩增产物的大小为254bp，以同一样品模板，18S-F:5’-cttagttggtggagcgatttg-3’和18S-R:5’-CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3’为引物，扩增18s内参基因表达产物的部分片段为对照，预测扩增产物的大小为148bp，结果如图6所示。
上述PCR反应的体系（10μl）：模板1μl，2×Taqmix 5μl，10μM引物各0.5μl，ddH20 3μl。
上述PCR反应的程序：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，共35个循环；最后再72℃延伸5min。
图6的结果表明，纯合转基因拟南芥株系表达了外源片段Bh1-4，而野生型拟南芥中没有表达，纯合转空载体对照株系的结果与野生型拟南芥相同。
实施例2、DNA片段Bh1-4的发现
1、旋蒴苣苔大片段双元细菌人工染色体基因组文库构建
提取耐旱植物旋蒴苣苔(Boea hygrometrica(Bunge)R.Br)叶片细胞的核、纯化核DNA，并用BamH I酶切，脉冲电泳分离不同长度的片段，切胶纯化获得50-80Kb的大片段DNA片段，分别与BamH I酶切并去磷酸化后纯化获得双元细菌人工染色体（BIBAC）线性载体pCLD04541连接，转化大肠杆菌DH10B构建BIBAC文库。
2、转化拟南芥
从BIBAC文库中，挑取单克隆，摇菌提质粒，电击转化根癌农杆菌GV3101后转化拟南芥。收获T1代种子，在带有卡那霉素抗生素的MS培养基上筛选到T1代阳性苗，收获T2种子后，播种并收获T3代，鉴定得到纯合子后，进行PEG抗旱性筛选和pH碱性环境筛选。结果，对转基因植物T3代小苗进行耐旱表型分析，发现其中转Bh1-4片段的株系具有明显的耐PEG渗透胁迫和pH8.0碱性环境的能力。
3、遗传学分析
随机取2个转Bh1-4片段株系的T2代种子播种在含卡那霉素的MS培养基上，分别统计阳性苗所占的比例，经过X2分析得出，对卡那霉素抗性的分离比是3:1，推测这两个转Bh1-4片段株系是单拷贝***的。对其进行遗传学分析和PCR鉴定的结果发现，有一个转基因株系从T1代到T3代具有遗传稳定性。
4、***序列的测定
对具有遗传稳定性的转基因株系进行***片段序列分析，最终结果表明，该转基因株系中***的来源于旋蒴苣苔基因组的Bh1-4片段的核苷酸序列如序列表序列1的第7位至第6375位所示。
Claims (8)
1.DNA片段，由序列表序列1中第7位至第6375位核苷酸序列组成的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段***载体pCLD04541得到的表达权利要求1所述的DNA片段的重组载体。
4.用于鉴定权利要求1所述DNA片段表达的PCR引物对，其特征在于：所述PCR引物对由序列表序列9所示的单链DNA和序列表序列10所示的单链DNA组成。
5.权利要求1所述DNA片段在培育耐逆性植物中的应用；所述耐逆性为耐旱性和/或耐碱性。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述DNA片段导入目的植物，得到耐逆性高于所述目的植物的转基因植物，所述耐逆性为耐旱性和/或耐碱性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
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Granted publication date: 20150114 Termination date: 20170503 |