CN102154337A

CN102154337A - 一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用

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Publication number: CN102154337A
Application number: CN 201010590833
Authority: CN
Inventors: 郭兴启; 李玉真; 张良; 张伟; 吴长艾
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2010-12-07
Publication date: 2011-08-17
Anticipated expiration: 2030-12-07
Also published as: CN102154337B

Abstract

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明采用同源克隆和RACE技术获得一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，将该基因的cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体，转化本生烟，使该基因在烟草中过量表达。实验证实，转基因烟草植株产量较非转基因烟草植株显著提高，表现为叶片面积增大、分蘖数增多、果荚数增加、结实率提高。因此，利用该基因在增加产量方面的特性，通过基因工程手段改善作物产量性状，提高作物产量具有重要的现实意义。

Description

一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的克隆、重组及在提高转基因烟草产量方面的应用，属于分子生物学和生物技术领域。

(二)背景技术

随着世界人口的不断激增，人们对粮食的需求也在急剧增加。同时人类对资源环境的肆意开发，生态平衡逐渐遭到破坏，粮食生产也受到很大影响。在我国，经济水平的不断提高及城市化、工业化进程的不断加快，农业人口及可用耕地面积所占比例正逐年下降，因此，如何提高粮食产量来满足人们日益增长的基本生活物质需求是人们当前亟待解决的问题。

传统的提高粮食产量的方法有扩大种植面积、改善栽培管理技术、田间套种、选育优良品种等。由于人们对土地资源的不断开发，可耕地面积逐年下降，通过扩大种植面积提高作物产量已不再是行之有效的方法。而通过改善栽培管理技术提高作物产量往往收效甚微。目前提高作物产量的方法主要是选育优良品种，结合先进的栽培管理技术。传统的选育方法主要是将杂交选育与形态改良相结合，利用杂交优势来选育新品种。如三系杂交水稻的选育。然而由于种间不亲和性的限制，许多种间高产性状无法通过杂交选育的方式得以充分利用。另外，传统的选育方法具有育种周期长，工作量大，成本高等缺点。因此，应用传统育种方法来提高作物产量在一定程度上受到限制。随着近代分子生物学与基因工程技术的飞速发展，通过转基因技术与传统选育方法相结合来选育新品种已经成为一种行之有效的方法。转基因技术具有快速、高效等优点，一方面可以大大缩短选育新品种的周期，另一方面能克服种间的生殖隔离障碍，实现种间遗传物质交换，将种间优良基因充分挖掘和利用。此外，利用转基因育种技术可针对性的改良作物性状，以达到提高作物产量的目的。

在我国，棉花是除粮食以外最为重要的经济作物。早在1995年，我国就通过转基因技术成功培育出Bt抗虫棉，其推广应用使得棉花产量大幅度提高，极大的推进了棉花产业的发展。但近年来，我国棉花的消费需求正呈持续快速增长趋势。相关资料表明，我国国内棉花资源已不能满足棉纺织业的需求，只能通过进口来达到供求平衡。因此加速提高棉花产量是十分必要的。通过基因工程技术的手段研究棉花中影响产量的基因的功能，对于棉花产量性状的遗传改良具有非常重要的现实意义。然而，目前关于棉花产量性状的研究多集中于产量相关性状的QTL定位及聚类分析方面，对于棉花产量相关基因的研究应用很少。

MAPK级联途径是真核生物中进化极为保守的细胞信号转导途径。研究表明，植物中MAPK参与细胞***、生长发育、胁迫反应等过程，如Ma等(2009)通过对烟草BY-2细胞的研究发现，MAPK主要在细胞***中期，通过激活大量与细胞周期进程相关的底物来调节成膜体中细胞板的形成以影响细胞周期进程。而Jens等人(2010)通过对模式植物拟南芥的研究进一步证实，MAPK在细胞***过程中所具有的重要作用，并指出MAPK6在拟南芥早期根的生长发育阶段通过影响细胞***来影响根的发育。另外有研究表明，植物中一些MAPK能够参与生长素信号途径，从而调节植物生长发育过程。然而，目前关于棉花MAPK与产量关系方面的研究很少，国内外尚没有关于利用棉花MAPK提高作物产量的报道。

本发明中，我们用常规方法在棉花(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)中克隆得到一个MAPK基因，构建真核表达载体后转入本生烟(Nicotiana benthamiana)，使之高效表达。研究发现，转基因烟草植株产量较非转基因烟草植株显著提高，表现为叶片面积增大、分蘖数增多、果荚数增加、结实率提高。因此，利用该基因在增加产量方面的特性，通过基因工程手段改善作物产量性状，提高作物产量具有重要的现实意义。这一策略的应用不仅能为植物产量性状的改良提供新的基因源，而且对于培育其它可提高产量的种质材料提供了理论基础。

经检索，国内外文献和专利中尚没有关于该棉花产量相关基因GhMAPK6的报道。

(三)发明内容

本发明的目的旨在提供一种可提高棉花产量的相关基因GhMAPK6，同时提供一种该基因在提高转基因烟草产量方面的应用，并应用于生产其它可提高产量的转基因植物。

本发明中提供的核苷酸序列来自棉花。

本发明利用同源克隆和RACE技术获得了棉花产量相关基因GhMAPK6，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下：

本发明从棉花幼叶中提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库(GenBank)中已发布的其它植物中促丝裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，设计一对简并性引物：

BP1：chtaygghatbgtytgytgtgc

BP2：gcaaccaacwgaccadatrtc

进行常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)。将PCR产物与克隆载体(pMD18-T)连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后筛选重组子，进行序列分析。根据获得的序列设计特异性引物：

3′outside：ctcgctcgtgtcacctctg

3′inside：cgtccacctgaactgttgc

5′outside：gatccatgtgacgaagcag

5′inside：agagttctcttcgcatcaatc

通过3′和5′末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends，RACE)技术分别获得3′和5′端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计一对特异性引物：

WLP1：gtaagaatggaaggcggag

WLP2：tagaatggctattggaattgagatat

以棉花幼叶的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列，将该cDNA命名为GhMAPK6。

该基因的cDNA全长为1564bp，其中开放阅读框部分为1197bp。由此推得，该基因可编码399个氨基酸。将其氨基酸序列在GenBank中检索，发现与已发表的AtMAPK6(拟南芥，NM_129941)、GmMAPK2(大豆，AAQ14867)、LeMAPK2(番茄，AAP20420)、NtNTF4(烟草，Q40532)、OsMAPK6(水稻，ACD76439)、ZmMAPK6(玉米，ACG37232)相比，氨基酸同源性分别为87.47％、90.23％、89.97％、89.97％、81.95％、82.75％。由此表明，经过上述同源克隆步骤得到了编码棉花促丝裂原活化蛋白激酶的基因GhMAPK6。

该基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

长度：1564bp

类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：棉花

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

cacagatcta ttaaccaata aaatcctacg catccttcca gtacacccac tcaccctaat 60

ttctttttag attctttttt ccaggaatta aggtaaga

gaaggcgga ggaccaccac 120

aggcggcgga caccgagatg gcagaagcag cccagcaaca gccacaacac caccagcaac 180

gtccgcctca ggtggccgct ggcctggaaa atattccggc cactctaagc cacggcggta 240

ggtttattca gtataacatc tttggtaaca ttttcgaggt cactgctaaa tataaaccac 300

ctattatgcc tatcggtaaa ggcgcttacg gcatcgtttg ttccgcattg aattccgaga 360

caaatgaaca cgttgcgtta aagaagatag cgaacgcatt tgataacaag attgatgcga 420

agagaactct tcgtgagatc aagctgcttc gtcacatgga tcatgaaaac gttgttgcaa 480

tcagggatat aattccacca cctcaaaggg aatgctttaa tgatgtttat attgcgtacg 540

agctgatgga cactgacctg catcagataa tccgttctaa tcaagcttta tctgaagagc 600

attgtcagta tttcccctat cagatcttac gtgggctgaa gtatatacac tctgcaaatg 660

ttctacacag ggacttgaaa cctagcaacc ttctcctgaa tgctaattgt gacttgaaaa 720

tatgtgattt tggactcgct cgtgtcacct ctgaaagtga ttttatgact gaatatgttg 780

ttacaagatg gtaccgtcca cctgaactgt tgctaaactc ttcagactat actgcagcca 840

ttgatgtatg gtcagtgggt tgcattttta tggaattgat ggatcgaaag ccattatttc 900

ctggaagaga tcatgtgcat cagcttcgat tacttatgga actgattggc accccatcag 960

aggctgagtt ggagttttta aatgagaatg ctaagagata tattcgacaa cttcctcttt 1020

atcgtcgaca atctttcact gaaaagtttc caaatgtccc ccctttagct attgatcttg 1080

ttgaaaagat gttaacattt gatcccagac aaaggattac tgtcgaggac gcacttgctc 1140

atccctatct aacgtcactg catgacataa gtgatgaacc tgtatgcatg acccccttta 1200

gcttcgactt cgagcagcat gcattaaccg aggagcagat gaaggagctg atatatcggg 1260

aggcacttgc attcaaccca gaatatctgc agcag

tc agtccatatg ccattgattt 1320

attgatgagc ttttgtcagt gttggtgatc gttttcttca tgtatatata catacatatg 1380

tatgtatgta tgtatgtatt tatgtatgta tgtatgtacg tatgtatgtt ccaatcccag 1440

gatagaatgg ctattggaat tgagatattt aattatgggc aaaatgcagg aaactaaaac 1500

agctgtattg gtgtttttat gtacggctgt cttgatttct ttctttcaaa aaaaaaaaaa 1560

aaaa 1564

其中透明方框内为起始密码子，灰色方框内为终止密码子。

(3)SEQ.ID.NO.2的信息

(a)序列特征

长度：399个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

拓扑结构：线性

(b)分析类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ.ID.NO.2

Met Glu Gly Gly Gly Pro Pro Gln Ala Ala Asp Thr Glu Met Ala Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gln Gln Gln Pro Gln His His Gln Gln Arg Pro Pro Gln Val

20 25 30

Ala Ala Gly Leu Glu Asn Ile Pro Ala Thr Leu Ser His Gly Gly Arg

35 40 45

Phe Ile Gln Tyr Asn Ile Phe Gly Asn Ile Phe Glu Val Thr Ala Lys

50 55 60

Tyr Lys Pro Pro Ile Met Pro Ile Gly Lys Gly Ala Tyr Gly Ile Val

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Asn Ser Glu Thr Asn Glu His Val Ala Leu Lys Lys

85 90 95

Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn Lys Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg

100 105 110

Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu Asn Val Val Ala Ile

115 120 125

Arg Asp Ile Ile Pro Pro Pro Gln Arg Glu Cys Phe Asn Asp Val Tyr

130 135 140

Ile Ala Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser

145 150 155 160

Asn Gln Ala Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe Pro Tyr Gln Ile

165 170 175

Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp

180 185 190

Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile

195 200 205

Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Thr Ser Glu Ser Asp Phe Met Thr

210 215 220

Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu Leu Leu Asn

225 230 235 240

Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile

245 250 255

Phe Met Glu Leu Met Asp Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp His

260 265 270

Val His Gln Leu Arg Leu Leu Met Glu Leu Ile Gly Thr Pro Ser Glu

275 280 285

Ala Glu Leu Glu Phe Leu Asn Glu Asn Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln

290 295 300

Leu Pro Leu Tyr Arg Arg Gln Ser Phe Thr Glu Lys Phe Pro Asn Val

305 310 315 320

Pro Pro Leu Ala Ile Asp Leu Val Glu Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro

325 330 335

Arg Gln Arg Ile Thr Val Glu Asp Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Thr

340 345 350

Ser Leu His Asp Ile Ser Asp Glu Pro Val Cys Met Thr Pro Phe Ser

355 360 365

Phe Asp Phe Glu Gln His Ala Leu Thr Glu Glu Gln Met Lys Glu Leu

370 375 380

Ile Tyr Arg Glu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Glu Tyr Leu Gln Gln

385 390 395

本发明还提供了编码促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6在其它农作物中应用的方法，可提高转基因作物的产量。步骤为：

(a)利用棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，将cDNA序列置于CaMV 35S启动子之下，构建植物表达载体。

(b)采用本领域熟知的方法，如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。

本发明从棉花中分离出一种编码促丝裂原活化蛋白激酶基因(GhMAPK6)，将该cDNA序列构建在由组成型CaMV 35S强启动子控制的真核表达载体pBI121上，构建了GhMAPK6的正义表达载体，采用农杆菌介导的方法转化本生烟。对获得的转基因烟草进行功能分析表明，转基因烟草中GhMAPK6的过量表达能提高其产量。相比于非转基因烟草，转基因烟草叶片面积增加约1.7倍，果荚数增加约2.4倍，种子数量增加约1.5倍。该基因可转化棉花、玉米、小麦等农作物，能提高其产量，具有重大的经济价值和社会价值。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列，用于提高植物产量。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，获得可提高产量的转基因植物。导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体转化法、PEG介导的转化法、花粉管导入法等。

本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。

在本发明中GhMAPK6基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它转基因植物，包括转基因植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。

(四)附图说明

图1.棉花中GhMAPK6氨基酸序列与几种其它植物的MAPK氨基酸序列的比较结果。其中相同的氨基酸残基用黑底表示。它们在GenBank中的物种来源及其注册号分别为：AtMAPK6(拟南芥，NM_129941)、GmMAPK2(大豆，AAQ14867)、LeMAPK2(番茄，AAP20420)、NtNTF4(烟草，Q40532)、OsMAPK6(水稻，ACD76439)、ZmMAPK6(玉米，ACG37232)。

图2.GhMAPK6正义表达载体的构建程序。

图3.部分转基因植株的PCR鉴定结果。1-9：转基因烟草植株；CK+：pBI121质粒作为阳性对照；CK-：非转基因对照；M：marker DL2000。

图4.过量表达GhMAPK6的转基因烟草与非转基因烟草在苗期的生长状况比较。A：非转基因烟草；B：转基因烟草。

图5.过量表达GhMAPK6的转基因烟草与非转基因烟草在产量方面的状况比较。A：非转基因烟草；B：转基因烟草。

(五)具体实施方式

基于本生烟生长速度快、生活周期短、离体培养再生能力强、遗传转化效率高等优点，在下述实施例中以本生烟为例对本发明进行了详细的说明。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施方式(一)：一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的克隆方法

1.RNA的提取：利用TRIZOL试剂盒提取棉花总RNA

2.cDNA第一链的合成(采用Transgen公司cDNA第一链合成试剂盒法)

在0.25ml离心管中加入下列试剂：

mRNA 5μl

Oligo d(T) 1μl

2×Buffer 10μl

EasyScript Reverse Transcriptase 1μl

RNAase free water 3μl

吸打混匀后42℃水浴30min，85℃水浴5min，冰上冷却5min，轻离心后，保存备用。

3.cDNA的5′加尾反应

(a)反应体系：

cDNA 20μl

5×TdT Buffer 10μl

0.1％BSA 5μl

100mM dCTP 1μl

TdT 1μl

ddH₂O Up to 50μl

(b)37℃保温30min。

(c)加100μl无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(d)12,000rpm，室温离心5min。弃上清，干燥后加适量ddH₂O回溶。

4.cDNA全长序列的获得

4.1 用简并引物进行PCR反应获得GhMAPK6中间片段

引物序列如下：

BP1：chtaygghatbgtytgytgtgc

BP2：gcaaccaacwgaccadatrtc

体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

BP1(10μM) 1μl

BP2(10μM) 1μl

cDNA 1μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

反应完毕后，电泳检测结果并回收正确片段。将所得片段连入pMD18-T，取胶回收产物4μl与pMD18-T载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

4.2 5′RACE获得5′端序列

(a)用上述反转录产物进行PCR

引物序列如下：

5′outside：gatccatgtgacgaagcag

AAP：ggccacgcgtcgactagtac(g)₁₆

体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

AAP(10μM) 1μl

5′outside(10μM) 1μl

cDNA 1μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

(b)反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)同样的体系和反应程序以第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为AUAP(ggccacgcgtcgactagtac)和5′inside(agagttctcttcgcatcaatc)。

(d)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

4.3 3′RACE获得3′端序列

(a)用上述反转录产物进行PCR

引物序列如下：

3′outside：ctcgctcgtgtcacctctg

B26：gactctagacgacatcga(t)₁₈

体系如下：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

B26(10μM) 1μl

3′outside(10μM) 1μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 25μl

(b)反应程序为：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)以同样的体系和反应程序，用第一次PCR产物为模板做二次PCR，引物为B25(gactctagacgacatcga)和3′inside(cgtccacctgaactgttgc)。

4.4 cDNA全长序列的获得

根据已测定序列及其重叠区域，拼出目的基因的全长cDNA，设计引物WLP1和引物WLP2，PCR扩增全长序列作进一步的验证。

引物序列如下：

WLP1：gtaagaatggaaggcggag

WLP2：tagaatggctattggaattgagatat

(a)反应体系：

10×EasyTaq buffer 2.5μl

dNTP mixture(10mM) 1μl

WLP1(10μM) 1μl

WLP2(10μM) 1μl

cDNA 0.5μl

Taq E 0.25μl

ddH₂O Up to 50μl

(b)反应程序：

94℃ 5min

72℃ 5min

(c)将所得片段连入pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定，然后进行序列测定。

5.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。

实施方式(二)：棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的序列见SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2。

实施方式(三)：表达载体的构建

(1)根据分离出的棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因的核苷酸序列，设计引物：

正向引物：5′-ggatccgtaagaatggaaggcggag-3′

划横线部分为BamH Ⅰ酶切位点

反向引物：5′gagctctggactgatcactgctgca-3′

划横线部分为Sac Ⅰ酶切位点

以该基因全长测序质粒为模板，利用上述正向和反向引物进行PCR反应。

(2)取PCR产物4μl与pMD18-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD18-T Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落挑取白色菌落至LB液体培养基中培养3h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样在含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法小量提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

(3)将PCR扩增得到目的片段用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切，与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后在含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养，对生长的菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。

(4)将构建好的表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施方式(四)：转基因植物的获得

(1)本生烟种子，播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用。

(2)挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，待用。

(3)取烟草叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)，将剪好的烟草叶片，置于MS预分化培养基中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2,000Lux，预培养2d。

(4)将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。

(5)共培养后的外植体先用含羧苄青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含羧苄青霉素250mg/L的MS培养液洗涤1次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含有卡那霉素100mg/L，羧苄青霉素250mg/L的MS选择培养基上，恒温培养(条件同预培养)；每15d更换一次培养基。

(6)待芽长至1cm左右时，切下，移入MS生根培养基(附加卡那霉素50mg/L，羧苄青霉素250mg/L)中，促其生根。

(7)根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

实施方式(五)：转基因烟草提高产量能力分析

将T2转基因株系种子与非转基因种子种在GM培养基上，萌发后两周将其移植至土壤中温室培养。在烟草的整个生长周期中，相对于非转基因烟草，转基因烟草叶片面积增加约1.7倍，果荚数增加约2.4倍，种子数量增加约1.5倍。该基因可转化棉花、玉米、小麦等农作物，能提高其产量，具有重大的经济价值和社会价值。

<110>山东农业大学

<120>一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用

<160>2

<210>1

<211>1564

<212>DNA

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<220>

<221>CDS

<222>(99)...(1298)

<223>

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)...(98)

<223>

<220>

<221>3′UTR

<222>(1299)...(1564)

<223>

<400>1

cacagatcta ttaaccaata aaatcctacg catccttcca gtacacccac tcaccctaat 60

ttctttttag attctttttt ccaggaatta aggtaaga

gaa ggc gga gga cca 116

Met Glu Gly Gly Gly Pro

1 5

cca cag gcg gcg gac acc gag atg gca gaa gca gcc cag caa cag cca 164

Pro Gln Ala Ala Asp Thr Glu Met Ala Glu Ala Ala Gln Gln Gln Pro

10 15 20

caa cac cac cag caa cgt ccg cct cag gtg gcc gct ggc ctg gaa aat 212

Gln His His Gln Gln Arg Pro Pro Gln Val Ala Ala Gly Leu Glu Asn

25 30 35

att ccg gcc act cta agc cac ggc ggt agg ttt att cag tat asc atc 260

Ile Pro Ala Thr Leu Ser His Gly Gly Arg Phe Ile Gln Tyr Asn Ile

40 45 50

ttt ggt aac att ttc gag gtc act gct aaa tat aaa cca cct att atg 308

Phe Gly Asn Ile Phe Glu Val Thr Ala Lys Tyr Lys Pro Pro Ile Met

55 60 65 70

cct atc ggt aaa ggc gct tac ggc atc gtt tgt tcc gca ttg aat tcc 356

Pro Ile Gly Lys Gly Ala Tyr Gly Ile Val Cys Ser Ala Leu Asn Ser

75 80 85

gag aca aat gaa cac gtt gcg tta aag aag ata gcg aac gca ttt gat 404

Glu Thr Asn Glu His Val Ala Leu Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp

90 95 100

aac aag att gat gcg aag aga act ctt cgt gag atc aag ctg ctt cgt 452

Asn Lys Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg

105 110 115

cac atg gat cat gaa aac gtt gtt gca atc agg gat ata att cca cca 500

His Met Asp His Glu Asn Val Val Ala Ile Arg Asp Ile Ile Pro Pro

120 125 130

cct caa agg gaa tgc ttt aat gat gtt tat att gcg tac gag ctg atg 548

Pro Gln Arg Glu Cys Phe Asn Asp Val Tyr Ile Ala Tyr Glu Leu Met

135 140 145 150

gac act gac ctg cat cag ata atc cgt tct aat caa gct tta tct gaa 596

Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Ala Leu Ser Glu

155 160 165

gag cat tgt cag tat ttc ccc tat cag atc tta cgt ggg ctg aag tat 644

Glu His Cys Gln Tyr Phe Pro Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr

170 175 180

ata cac tct gca aat gtt cta cac agg gac ttg aaa cct agc aac ctt 692

Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu

185 190 195

ctc ctg aat gct aat tgt gac ttg aaa ata tgt gat ttt gga ctc gct 740

Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala

200 205 210

cgt gtc acc tct gaa agt gat ttt atg act gaa tat gtt gtt aca aga 788

Arg Val Thr Ser Glu Ser Asp Phe Met Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg

215 220 225 230

tgg tac cgt cca cct gaa ctg ttg cta aac tct tca gac tat act gca 836

Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Thr Ala

235 240 245

gcc att gat gta tgg tca gtg ggt tgc att ttt atg gaa ttg atg gat 884

Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Met Glu Leu Met Asp

250 255 260

cga aag cca tta ttt cct gga aga gat cat gtg cat cag ctt cga tta 932

Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp His Val His Gln Leu Arg Leu

265 270 275

ctt atg gaa ctg att ggc acc cca tca gag gct gag ttg gag ttt tta 980

Leu Met Glu Leu Ile Gly Thr Pro Ser Glu Ala Glu Leu Glu Phe Leu

280 285 290

aat gag aat gct aag aga tat att cga caa ctt cct ctt tat cgt cga 1028

Asn Glu Asn Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Leu Tyr Arg Arg

295 300 305 310

caa tct ttc act gaa aag ttt cca aat gtc ccc cct tta gct att gat 1076

Gln Ser Phe Thr Glu Lys Phe Pro Asn Val Pro Pro Leu Ala Ile Asp

315 320 325

ctt gtt gaa aag atg tta aca ttt gat ccc aga caa agg att act gtc 1124

Leu Val Glu Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Arg Gln Arg Ile Thr Val

330 335 340

gag gac gca ctt gct cat ccc tat cta acg tca ctg cat gac ata agt 1172

Glu Asp Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Thr Ser Leu His Asp Ile Ser

345 350 355

gat gaa cct gta tgc atg acc ccc ttt agc ttc gac ttc gag cag cat 1220

Asp Glu Pro Val Cys Met Thr Pro Phe Ser Phe Asp Phe Glu Gln His

360 365 370

gca tta acc gag gag cag atg aag gag ctg ata tat cgg gag gca ctt 1268

Ala Leu Thr Glu Glu Gln Met Lys Glu Leu Ile Tyr Arg Glu Ala Leu

375 380 385 390

gca ttc aac cca gaa tat ctg cag cag

tcagtccata tgccattgat 1318

Ala Phe Asn Pro Glu Tyr Leu Gln Gln *

395

ttattgatga gcttttgtca gtgttggtga tcgttttctt catgtatata tacatacata 1378

tgtatgtatg tatgtatgta tttatgtatg tatgtatgta cgtatgtatg ttccaatccc 1438

aggatagaat ggctattgga attgagatat ttaattatgg gcaaaatgca ggaaactaaa 1498

acagctgtat tggtgttttt atgtacggct gtcttgattt ctttctttca aaaaaaaaaa 1558

aaaaaa 1564

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>棉花(Gossypium hirsutum)

<400>2

Met Glu Gly Gly Gly Pro Pro Gln Ala Ala Asp Thr Glu Met Ala Glu

1 5 10 15

Ala Ala Gln Gln Gln Pro Gln His His Gln Gln Arg Pro Pro Gln Val

20 25 30

Ala Ala Gly Leu Glu Asn Ile Pro Ala Thr Leu Ser His Gly Gly Arg

35 40 45

Phe Ile Gln Tyr Asn Ile Phe Gly Asn Ile Phe Glu Val Thr Ala Lys

50 55 60

Tyr Lys Pro Pro Ile Met Pro Ile Gly Lys Gly Ala Tyr Gly Ile Val

65 70 75 80

Cys Ser Ala Leu Asn Ser Glu Thr Asn Glu His Val Ala Leu Lys Lys

85 90 95

Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn Lys Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg

100 105 110

Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu Asn Val Val Ala Ile

115 120 125

Arg Asp Ile Ile Pro Pro Pro Gln Arg Glu Cys Phe Asn Asp Val Tyr

130 135 140

Ile Ala Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg Ser

145 150 155 160

Asn Gln Ala Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe Pro Tyr Gln Ile

165 170 175

Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg Asp

180 185 190

Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys Ile

195 200 205

Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val Thr Ser Glu Ser Asp Phe Met Thr

210 215 220

Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Pro Pro Glu Leu Leu Leu Asn

225 230 235 240

Ser Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys Ile

245 250 255

Phe Met Glu Leu Met Asp Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp His

260 265 270

Val His Gln Leu Arg Leu Leu Met Glu Leu Ile Gly Thr Pro Ser Glu

275 280 285

Ala Glu Leu Glu Phe Leu Asn Glu Asn Ala Lys Arg Tyr Ile Arg Gln

290 295 300

Leu Pro Leu Tyr Arg Arg Gln Ser Phe Thr Glu Lys Phe Pro Asn Val

305 310 315 320

Pro Pro Leu Ala Ile Asp Leu Val Glu Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro

325 330 335

Arg Gln Arg Ile Thr Val Glu Asp Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Thr

340 345 350

Ser Leu His Asp Ile Ser Asp Glu Pro Val Cys Met Thr Pro Phe Ser

355 360 365

Phe Asp Phe Glu Gln His Ala Leu Thr Glu Glu Gln Met Lys Glu Leu

370 375 380

Ile Tyr Arg Glu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Glu Tyr Leu Gln Gln

385 390 395

Claims

1.一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6，其特征在于其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6的应用，其特征在于该基因在本生烟草中过量表达，能提高转基因烟草产量。