CN104140462B

CN104140462B - 植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104140462B
Application number: CN201310163548.3A
Authority: CN
Inventors: 华金平; 苏莹; 张曦; 甄军波; 王玉美
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2016-12-28
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN104140462A

Abstract

本发明公开了一种植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2‑6及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白来源于陆地棉，由序列表序列2所示的氨基酸组成。实验证明，将含有序列表序列1的第309位至第1452位所示DNA分子（即所述蛋白的编码基因）的重组载体p2301M‑GhSnRK2‑6转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因株系，其种子发芽后置于含不同浓度（100、150、200mM）NaCl的MS固体培养基中培养10天的单株鲜重显著高于野生型拟南芥和转空载体对照株系。本发明为提高植物耐盐性提供了一个新的基因和方法，在植物遗传改良和耐逆性研究方面具有重要意义。

Description

植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用。

背景技术

盐胁迫，作为一种非生物胁迫，严重影响着作物的生长和产量，并且土壤盐渍化程度呈现逐年增长的趋势，因此，培育耐盐性作物是育种工作者的主要目标之一。目前，基因工程育种已经成为增强作物抗逆性的重要方法之一。

棉花是一种重要的经济作物，并且与玉米、水稻、小麦等农作物相比，是一种中度耐盐作物。以棉花为研究材料，现已有部分胁迫应答相关基因的克隆与功能验证，主要集中于编码功能蛋白的基因（如Na+/H+逆转运蛋白、金属硫蛋白、水通道蛋白等）和调控基因（如转录因子、蛋白激酶、乙稀应答因子等）。薛彤彤等（2009）研究发现GhMT3a能够提高转基因烟草的非生物胁迫耐性，表明GhMT3a可能参与植物体内的活性氧清除，从而提高植物非生物胁迫的耐性。芥菜编码膜联蛋白的基因AnnBj1能显著提高棉花对高盐、甘露醇、PEG和H2O2等非生物胁迫的耐性，可能参与棉花体内的活性氧清除等生命活动。SnRK2是植物中特有的蛋白激酶，参与环境胁迫应答。目前在棉花中尚无该蛋白激酶成员相关报道。

发明内容

本发明的目的是一种植物耐盐性相关蛋白GhSnRK2-6及其编码基因与应用。

本发明所提供的耐盐性相关蛋白，来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，名称为GhSnRK2-6，是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性相关的由（a）衍生的蛋白质；

序列表序列2所示的氨基酸序列由361个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列1的第310位至第1395位核苷酸序列所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质的编码基因为如下1）-6）基因中的任意一种：

1）其核苷酸序列是序列表序列1中第309位至第1452位所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表序列1中第310位至第1395位所示的DNA分子；

3）其核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；

4）其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；

5）与1）或2）或3）或4）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

6）在严格条件下与1）或2）或3）或4）或5）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列1由1763个脱氧核苷酸组成，是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)蛋白GhSnRK2-6的全长cDNA序列，其中，第310位至第1395位为开放阅读框。序列表序列3为GhSnRK2-6基因对应的棉花基因组DNA，全长3055bp，由9个外显子（第1-177位、第527-601位、第702-803位、第889-952位、第1036-1128位、第1405-1497位、第2279-2383位、第2470-2568位、第2758-3055位）和8个内含子组成。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体可为将所述基因***载体p2301M得到的重组表达载体，具体可为将序列表序列1中第309位至第1452位所示的DNA分子***载体p2301M得到的重组表达载体；所述载体p2301M是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用EcoR I和HindⅢ对载体pJIM19进行双酶切，回收0.8kb的目的片段，与经EcoR I和HindⅢ双酶切的载体pCAMBIA2301的骨架连接，获得所述载体p2301M。

本发明保护所述蛋白质或所述基因在调控目的植物耐盐性中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到耐盐性高于目的植物的转基因植物。

本发明还提供一种提高目的植物耐盐性的方法，包括将所述基因导入目的植物中的步骤。

在上述两种方法中，所述导入是通过所述重组载体实现的。

在上述两种方法中，所述耐盐性为耐100—200mM的NaCl。

在上述应用和方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥。

实验证明，将含有序列表序列1中第309位至第1452位所示的DNA分子的重组载体p2301M-GhSnRK2-6转化拟南芥得到的T3代纯合转基因株系，其种子发芽后置于含不同浓度（100、150、200mM）NaCl的MS固体培养基中培养10天的单株鲜重显著高于野生型拟南芥和转空载体对照株系。本发明为提高植物耐盐性提供了一个新的基因和方法，在植物遗传改良和耐逆性研究方面具有重要意义。

附图说明

图1为GhSnRK2-6基因在盐胁迫处理0.5h条件下不同组织部位差异表达情况。其中，图A为RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图B为RT-PCR检测的相对表达量柱形图。

图2为Real-time PCR检测不同组织部位的GhSnRK2-6基因在盐胁迫处理下的时空表达模式图。其中，图A-C依次为根、茎和叶。

图3为重组质粒p2301M-GhSnRK2-6构建的结构示意图。其中，最上面片段为质粒pCAMBIA2301的T-DNA区，中间的片段为用EcoR I和HindⅢ从载体pJIM19上切下的NOS终止子-CaMV35S片段，最下面的片段为扩增的目的基因片段。

图4为转基因拟南芥植株的PCR鉴定电泳图。其中，M为分子量标准（从上至下的片段大小依次为5000、3000、1000、750、500、250和100bp），CK+为质粒p2301M-GhSnRK2-6阳性对照，CK-为野生型拟南芥Col-0阴性对照，其余泳道为待鉴定转基因拟南芥植株，含有目的片段的为转基因阳性植株。

图5为转基因拟南芥株系在不同胁迫条件下单株鲜重的柱形统计结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、棉花GhSnRK2-6基因的克隆

以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)栽培种中G5（文献：王坤波，崔荣霞，王春英等.棉花新材料中G5主要特点.中国棉花.2000,24.公众可从中国农业大学获得）水培苗为材料提取总RNA，反转录获得cDNA，以该DNA为模板，以GhS1F和GhS1R为引物进行PCR扩增。

上述PCR扩增的引物序列如下：

引物GhS1F：5’-AATGGATCGAGCAGACTTGACG-3’；

引物GhS1R：5’-ACACTTTTGATTGCCTGGAACA-3’。

上述PCR扩增的反应体系：2μl cDNA，1μl引物（10μM），5μl10×LA buffer，8μldNTP（2.5mM each），0.5μl LA-Taq酶，34.5μl ddH₂O。

上述PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s-2min，30个循环；72℃延伸10min。

将获得的PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，回收1.1kb左右的片段，连接到pMD18-T（TAKARA，D101A）上转化大肠杆菌DH5α菌株，采用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序。测序结果表明，该阳性克隆载体（命名为pMD18-T-GhSnRK2-6）为载体pMD18-T中***了自序列表序列1的第309位至第1452位核苷酸序列所示的长1144bp的DNA片段，其中，序列表序列1的序列为GhSnRK2-6基因的全长cDNA序列，自序列表序列1的第310位至第1395位为棉花GhSnRK2-6基因的编码序列，编码序列表序列2所示的由361个氨基酸残基组成的蛋白GhSnRK2-6。GhSnRK2-6基因对应的棉花基因组DNA全长3055bp，如序列表序列3所示，由9个外显子（第1-177位、第527-601位、第702-803位、第889-952位、第1036-1128位、第1405-1497位、第2279-2383位、第2470-2568位、第2758-3055位）和8个内含子组成。

实施例2、盐胁迫处理下GhSnRK2-6基因的表达分析

1）盐胁迫处理

Hoagland营养液水培陆地棉(Gossypium hirsutum L.)栽培种中G5，待幼苗长至三叶一心期时，移至含150mM NaCl的Hoagland营养液中进行盐胁迫培养（NaCl），以在Hoagland营养液中进行正常培养为对照（CK）。分别取盐胁迫及对照处理时间为0.5h、1.0h、3.0h、6.0h、12.0h、24.0h、48.0h和72.0h的幼苗的根、茎和叶，液氮速冻，保存于-70℃，用于RNA抽提。

2）总RNA的提取及cDNA的获得

利用改进的CTAB法（张曦，棉花盐胁迫早期应答基因分析及耐盐相关基因克隆：[博士学位论文]，中国农业大学，2010）分别提取步骤1）保存材料的总RNA，用M-MLV RTaseRNase H^-（Promega，M5301）反转录得到cDNA。

3）RT-PCR和Real-time PCR

将步骤2）的得到cDNA稀释5倍后作为RT-PCR和实时荧光定量PCR的模板。根据GhSnRK2-6基因序列，在其3’端设计特异引物GhS3F和GhS3R，以GhActin为内参基因。结果如图1和图2所示。

实时荧光定量PCR在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.Actin）_Timex－（C_T.Target－C_T.Actin）_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

引物GhS3F和GhS3R的序列如下：

GhS3F：5’-ACGAAAACACAATGGGTAGC-3’（对应序列表序列1的第1175-1194位）；

GhS3R：5’-CATAATGGACTCAATGGACC-3’（对应序列表序列1的第1515-1804位）。

内参基因GhActin的引物序列如下：

GhActinL：5’-ATTGTGAGCAACTGGGATGA-3’

GhActinR：5’-GTAGATGGGGACGGTGTGAG-3’

图1结果表明，GhSnRK2-6基因在根、茎和叶中均有表达；图2结果表明，在盐胁迫处理下，GhSnRK2-6基因在根、茎和叶中的表达呈明显上调趋势。

实施例3、重组植物表达载体的构建

1、目的基因GhSnRK2-6的获得

以pMD18-T-GhSnRK2-6为模板，以引物GhS2F和GhS2R为特异引物，进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。回收纯化1.1kb左右的PCR产物。测序结果表明，该PCR产物含有序列表序列1的第309位至第1452位所示的长1144bp的DNA片段。

引物GhS2F：5’-GCTCTAGAGCAATGGATCGAGCAGACTTGACG-3’（划线部分含有限制性内切酶XbaⅠ的识别序列和保护碱基）；

引物GhS2R：5’-GGGGTACCCCACACTTTTGATTGCCTGGAACA-3’（划线部分含有限制性内切酶KpnⅠ的识别序列和保护碱基）。

2、重组植物表达载体的构建

①用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ酶切步骤1回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；

②用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ酶切植物表达载体p2301M，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物热激转化大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒p2301M-GhSnRK2-6（图3），该质粒为在载体p2301M的XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点之间***了序列表序列1的第309位至第1452位所示的长1144bp的DNA片段。

上述p2301M的构建过程如下：

1）NOS终止子-CaMV35S片段的获得：利用EcoR I和HindⅢ对载体pJIM19（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）进行双酶切，回收0.8kb的目的片段；

2）将步骤1）的NOS终止子-CaMV35S片段与经EcoR I和HindⅢ双酶切的载体pCAMBIA2301（中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）的骨架连接，获得重组载体p2301M，经测序证实，该载体为在载体pCAMBIA2301的EcoR I和HindⅢ位点间***了NOS终止子-CaMV35S片段。

实施例4、棉花GhSnRK2-6基因转化拟南芥

1、重组农杆菌的构建

取实施例3制备得到的重组植物表达载体p2301M-GhSnRK2-6用冻融法转化根癌农杆菌EHA105的感受态细胞（购自北京天恩泽基因科技有限公司），28℃于含50μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml利福平的YEP固体培养中筛选培养；经过菌落PCR（使用实施例1中的引物GhS1F和GhS1R）对阳性单克隆进行鉴定，将鉴定正确的农杆菌即含有重组植物表达载体p2301M-GhSnRK2-6的重组农杆菌命名为EHA105/p2301M-GhSnRK2-6。

2、转基因拟南芥的获得

1)农杆菌侵染液的制备

取步骤1的重组根癌农杆菌EHA105/p2301M-GhSnRK2-6接种于5ml YEP液体培养基（含50μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml利福平）中，摇菌过夜，第二天转瓶至500mlYEP液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀为1.6—2.0；离心收集菌体，用MS溶液（MS基本培养基，5%蔗糖，40μl/500ml Silwet L-77）悬浮至OD₆₀₀为0.8—1.0，获得农杆菌侵染液。

2）目的植物拟南芥的准备

将哥伦比亚生态型拟南芥Col-0（购自Salk研究所基因组分析实验室（SalkInstitute Genomic Analysis Laboratory））移栽约4周左右，开始抽薹后，将主花序不带茎生叶的头部去掉，促进其侧生花序生长，待侧生花序开始开花，可以用于转化。

3)转化

将步骤2）的拟南芥整株与花盆一起倒扣在盛有250ml步骤1）制备的农杆菌侵染液的容器中浸泡转化；将拟南芥植株侧放于托盘中，用黑色塑料布盖上，一天后将塑料布揭开，花盆直立放置，进行正常的光照培养，收取成熟的T₁代种子。

4）抗性苗筛选

T₁代种子消毒后，平铺于MS固体培养基上(含50μg/ml硫酸卡那霉素)，4℃春化2—3天，21℃培养10天后挑选抗性植株移入土壤中，30天后按单株收获T₂代种子。按照同样的方法种植筛选T₂代种子，移栽抗性分离比为3:1的T₂代株系3个，并单株收获T₂代株系内各单株上所结T₃代种子，随机取16个T₃代株系种子按照同样的方法进行抗性筛选，得到8个T₃代不再产生抗性分离的纯合转基因株系。取T₃代为纯合转基因株系的植株或种子，进行下述步骤3和步骤4的PCR鉴定和表型鉴定。

同时，以相同的方法分别转化空载体p2301M作为转空载体对照，得到T₃代为纯合的转空载体对照株系3个。

T₁代表示转化当代植株自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

3、转基因拟南芥植株的PCR鉴定

1）取步骤2得到的T₃代不再产生抗性分离的纯合转基因株系植株叶片提取基因组DNA，用引物KanF和KanR进行PCR扩增，预测产物大小为500bp，结果全部呈阳性，部分植株的PCR产物电泳图如图4所示。

引物KanF和KanR的序列如下：

KanF：5’-CACTGAAGCGGGAAGGGACT-3’

KanR：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3’

2）按照步骤1）的方法检测步骤2得到的T₃代纯合转空载体对照株系植株，结果全部呈阳性。

4、转基因拟南芥植株的耐盐性鉴定

将T₃代纯合转基因株系（TL1—TL6）、T₃代纯合转空载体对照株系（CK）和野生型拟南芥Col-0（WT）的种子，用0.5%NaClO溶液消毒之后，分别铺板于MS固体培养基平板上，4℃条件下春化3天，再转移至温室，21℃光照培养4天后，将幼苗移至含不同浓度（0、100、150、200mM）NaCl的MS固体培养基中培养10天，称量单株鲜重（包括根茎叶），每个株系设三次重复，每个重复20—40株苗，结果用平均值±标准差的形式表示，如表2和图5所示

表2、转基因拟南芥植株经盐胁迫10天后的单株鲜重（单位：10^-3g）

注：表中的*表示与同一浓度NaCl胁迫条件下的WT植株相比，结果在p＜0.05差异显著；**表示与同一浓度NaCl胁迫条件下的WT植株相比，结果在p＜0.01差异极显著。

结果：随着NaCl浓度的升高，转基因株系植株鲜重均显著或极显著高于WT植株。CK与WT无显著差异。结果表明，蛋白GhSnRK2-6及其编码基因可以提高目的植物的耐盐性。

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表序列2所示的氨基酸序列组成的。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白质的编码基因为如下1)-6)基因中的任意一种：

1)其核苷酸序列是序列表序列1中第309位至第1452位所示的DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表序列1中第310位至第1395位所示的DNA分子；

3)其核苷酸序列是序列表序列1所示的DNA分子；

4)其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因***载体p2301M得到的重组表达载体；

所述载体p2301M是按照包括如下步骤的方法制备得到的：用EcoR I和Hind Ⅲ对载体pJIM19进行双酶切，回收0.8kb的目的片段，与经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切的载体pCAMBIA2301的骨架连接，获得所述载体p2301M。

6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的基因在调控目的植物耐盐性中的应用。

7.一种提高目的植物耐盐性的方法，包括将权利要求2或3所述基因导入目的植物中的步骤。

8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到耐盐性高于所述目的植物的转基因植物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述导入是通过权利要求5所述重组载体实现的。

10.根据权利要求6-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

11.根据权利要求10所述的应用或方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。