CN112812163B

CN112812163B - 转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法

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Publication number: CN112812163B
Application number: CN202110245121.2A
Authority: CN
Inventors: 方中明; 杭俊楠; 杨修艳; 王荣纳
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN112812163A

Abstract

本发明涉及水稻分子育种技术领域，具体涉及转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法。水稻育种的方法包括提高水稻植株的OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因的蛋白的表达量；OsGAmyb基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，OsTCP21基因的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。提高水稻植株的OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因的蛋白的表达量后，水稻单株分蘖数、生物量和稻谷数量显著增加，从而提高了水稻单株产量。OsGAmyb与OsTCP21基因超表达可应用于水稻株型和产量的遗传改良的各个方面，为提高水稻产量以及培育出新株型的水稻创造条件。

Description

转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法

技术领域

本发明涉及水稻分子育种技术领域，具体涉及转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法。

背景技术

“民以食为天，食以稻为先”，水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，其产量的高低决定了全世界的粮食安全。而水稻产量的高低主要由三个农艺性状所决定，分别是单株穗数，每穗粒数和单粒重。其中，单株穗数与水稻的分蘖密切相关。水稻分蘖作为单子叶植物中含有穗的特殊分枝，其形成主要可以分为两个阶段，即分蘖芽的起始与分蘖芽的伸长（Leyser O. Regulation of shoot branching by auxin. 2003, 8(11):541-545.）。通常，水稻分蘖芽的发生主要在水稻主茎上的每个叶的腋，但是并非所有的分蘖芽都能形成有效分蘖，影响水稻单株产量。而只有位于未发芽的基部节间的腋芽才可能发育成有效分蘖，进而产生有效穗影响水稻单株产量（Wang Y, Li J. The plantarchitecture of rice ( Oryza sativa)[J]. Plant Molecular Biology, 2005, 59(1): 75-84.）。因此，水稻的最终分蘖数取决于起始的分蘖芽数目与分蘖芽能够生长的数量。所以，想要提高水稻单株产量，最重要的就是提高起始的分蘖芽数目与分蘖芽能够生长的数量。

分子育种将分子生物学技术应用于育种中，在分子水平上进行育种，是一种有别于传统的杂交育种的育种手段，分子育种包括转基因育种，就是将基因工程应用于育种工作中，通过基因导入，从而培育出一定要求的新品种的育种方法。对水稻进行转基因育种以提高起始的分蘖芽数目与分蘖芽能够生长的数量，对提升水稻产量具有重要意义。在转基因育种的实践中，选取何种目的基因进行转基因育种非常关键，亟需对水稻发育相关基因进行筛选以及研究，从而获得能够显著提高水稻产量的分子育种方法。

发明内容

本发明意在提供一种水稻育种的方法，以解决提高水稻起始的分蘖芽数目从而提高水稻产量的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

水稻育种的方法，提高水稻植株的OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因的蛋白的表达量；OsGAmyb基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，OsTCP21基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本方案的原理及优点是：提高水稻植株的OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因的蛋白的表达量后，水稻单株分蘖数、生物量和稻谷数量显著增加，从而提高了水稻单株产量。这两个基因的敲除则明显降低水稻单株分蘖数、生物量与稻谷数量，对水稻的单株产量起到负调控的作用。在不影响OsGAmyb蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsGAmyb蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。在不影响OsTCP21蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsTCP21蛋白还包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。另外，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

发明人从水稻日本晴（Ni）中克隆了的OsTCP21基因cDNA序列。通过构建OsTCP21基因超表达载体，将超表达载体导入日本晴（Ni）中，得到OsTCP21基因超表达植株，其单株水稻分蘖芽的长度与数目、生物量等与日本晴相比，均显著提高。通过构建OsTCP21基因的基因敲除载体，将敲除载体导入日本晴（Ni）中，得到OsTCP21基因的基因敲除植株，其单株水稻分蘖数量、单株产量与日本晴（Ni）相比，均显著降低。发明人还从水稻日本晴中克隆得到OsGAmyb基因的cDNA序列。通过构建OsGAmyb基因超表达载体，将超表达载体导入日本晴（Ni）中，得到OsGAmyb基因超表达植株，其单株水稻分蘖芽的长度与数目、生物量与日本晴相比，均显著提高，但株高相对降低。通过构建OsGAmyb基因的基因敲除载体，将敲除载体导入日本晴（Ni）中，得到OsGAmyb基因的基因敲除植株，其单株水稻分蘖数量和单株产量与日本晴相比，显著降低。上述研究表明，OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因在水稻植株中超表达可以实现水稻增产，具体地通过增加水稻单株分蘖数、生物量和稻谷数量的形式实现水稻的增产。

OsTCP21基因和OsGAmyb基因同为小分子RNA的靶基因，可受到小分子RNA的调控，从而影响植株生长发育的过程，但是目前尚无使用这两种转录因子来进行水稻育种的实践操作。发明人在对小分子RNA对水稻生长发育的影响的研究中，发现miR319对水稻的分蘖和产量的提升具有负向调节作用。发明人进一步对miR319调控的下游分子进行了研究，发现OsTCP21基因和OsGAmyb基因均受到miR319的负向调控，即OsTCP21基因和OsGAmyb基因是的靶基因。发明人进而尝试构建OsTCP21基因和OsGAmyb基因的过表达水稻植株，最终发现了这两个基因由于水稻增产的正向调节作用，并将这两个基因应用于水稻转基因育种的实践操作中。

针对OsTCP21基因，它属于一种TCPs转录调控因子，它们编码一个含有基本螺旋-环-螺旋(bHLH)基序的TCP结构域(Shunichi K, Yuko O. PCF1 and PCF2 specificallybind to cis elements in the rice proliferating cell nuclear antigen gene[J].The Plant Cell, 1997, 9(9): 1607-1919.)。TCPs家族达部分基因是负调控水稻分蘖，例如，OsTCP19作为转录因子负调控水稻分蘖，过表达株系的分蘖数下降，而OsTCP19敲除或敲减株系的分蘖数显著增加（Liu Y, Wang H, Jiang Z, et al. Genomic basis ofgeographical adaptation to soil nitrogen in rice[J]. Nature, 2021, doi:10.1038/s41586-020-03091-w）。而在本方案中，发明人通过下量实验研究发现，同为TCPs家族成员的OsTCP21基因的功能与OsTCP19正好相反。现有技术中尚无关于OsTCP21基因的提高水稻产量的报道，仅有报道称OsTCP21下调使水稻植株更容易感染水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)（Zhang C, Ding Z, Wu K, et al. Suppression of jasmonic acid-mediateddefense by viral-inducible microRNA319 facilitates virus infection in rice[J]. Molecular Plant, 2016, 9(9): 1302-1314.）。这说明，发明人发现了基因的新性质和新功能，并将该新的发现应用到水稻育种的实践操作，从而获得新型的水稻植株，提高了水稻产量。

针对OsGAmyb基因，OsGAmyb基因是一种GAmyb基因。该基因是GAs诱导的一种R2R3型MYB类转录因子（Tsuji H, Aya K, Ueguchi-Tanaka M, et al. GAMYB controlsdifferent sets of genes and is differentially regulated by microRNA inaleurone cells andanthers[J]. Plant Journal. 2006, 47(3): 427-444.）。在水稻中，OsGAmyb功能缺失表现出雄蕊、花药和花粉的不完全发育（Miyuki K, Yoshiaki I, MiyakoUT, et al. Loss-of-function mutations of the rice GAMYB gene impair alpha-amylase expression in aleurone and flower development[J].The Plant Cell.2003,16(1): 33-44.）。OsGAmyb基因还对花器官发育以及花粉的发育十分重要（Kaneko M,Inukai Y, Ueguchi-Tanaka M, et al. Loss-of-function mutations of the riceGAMYB gene impair α-amylase expression in aleurone and flower development[J].The Plant Cell, 2004, 16(1): 33-44），在水稻中发现OsGAmyb基因突变体在营养生长阶段转变为生殖生长阶段后，表现出花粉发育缺陷的特征等（Liu Z, Bao W, Liang W, etal. Identification of gamyb-4 and analysis of the regulatory role of GAMYB inrice anther development[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2010, 52(7): 670-678.）。而水稻中OsGAmyb的研究集中在节间和花药发育等方面，对分蘖/分枝的调控作用没有报道。在本方案中，发明人研究发现了该基因的新功能，并利用该功能进行水稻量育种，获得了预料不到的技术效果。

综上所述，本方案的有益效果如下：

（1）克隆的OsTCP21基因超表达后使水稻单株分蘖数与生物量显著增加，说明OsTCP21基因对改善水稻株型与增加水稻单株产量较明显，因此，通过基因工程技术提高OsTCP21基因的表达能够遗传改良水稻株型与产量；克隆的OsGAmyb基因超表达后使水稻单株分蘖数与生物量显著增加，说明OsGAmyb基因对改善水稻株型与增加水稻单株产量较明显，因此，通过基因工程技术提高OsGAmyb基因的表达能够遗传改良水稻株型与产量。

（2）OsTCP21基因的成功克隆，证实了转录因子TCPs不仅在植物逆境响应和胁迫中发挥作用，还在植物分蘖和植株生长发育中也起重要作用，可以丰富植物TCPs的认识，对植物分枝和产量遗传改良有极大的推动作用。OsGAmyb基因的成功克隆，证实了转录因子GAmyb不仅在植物节间和花药发育中发挥作用，还在植物分蘖和植株生长发育中也起重要作用，可以丰富植物GAmyb的认识，对植物分枝和产量遗传改良有极大的推动作用。

进一步，OsGAmyb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，OsTCP21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步，提高水稻植株的OsGAmyb基因的表达量的步骤如下：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsGAmyb基因的cDNA，然后将OsGAmyb基因的cDNA连接在pCAMBIA-1306载体上，获得超表达载体OsGAmyb-p1306；采用农杆菌介导的遗传转化方法，将超表达载体OsGAmyb-p1306导入野生型水稻中，经筛选和培育，获得OsGAmyb基因超表达植株。构建超表达载体，并通过农杆菌转染获得超表达植株，上述操作方法成熟且稳定，可获得遗传性质稳定的OsGAmyb基因超表达植株。

进一步，使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsGAmyb基因的cDNA的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的F3，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的R3。通过RT-PCR克隆获得OsGAmyb基因的cDNA，进而构建超表达载体。

进一步，提高水稻植株的OsTCP21基因的表达量的步骤如下：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsTCP21基因的cDNA，然后将OsTCP21基因的cDNA连接在pCAMBIA-1306载体上，获得超表达载体OsTCP-p1306；采用农杆菌介导的遗传转化方法，将超表达载体OsTCP-p1306导入野生型水稻中，经筛选和培育，获得OsTCP21基因超表达植株。构建超表达载体，并通过农杆菌转染获得超表达植株，上述操作方法成熟且稳定，可获得遗传性质稳定的OsTCP21基因超表达植株。

进一步，使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsTCP21基因的cDNA的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的F1，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的R1。通过RT-PCR克隆获得OsTCP21基因的cDNA，进而构建超表达载体。

进一步，转录因子在水稻育种中的应用，所述转录因子的表达量上升；所述转录因子包括OsGAmyb蛋白和/或OsTCP21蛋白；所述OsGAmyb蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述OsTCP21蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。基于发明人发现的OsTCP21和OsGAmyb基因的功能，两者都可用于水稻选育中。水稻选育的目的在于获得单株分蘖数、生物量、稻谷数量或单株产量均较高的水稻植株。可通过超表达技术提高OsTCP21基因的表达，或者通过超表达技术提高OsGAmyb基因的表达，获得具有单株分蘖数多、生物量高、稻谷数量多以及单株产量高等优良性质的水稻植株。

进一步，所述转录因子用于提高水稻分蘖数、生物量以及籽粒数量。在水稻中提高OsTCP21和OsGAmyb基因的表达量，从而提升这两种转录因子的量，可达到改善水稻株型与产量的目的，具体的表现为提高水稻分蘖数、生物量以及籽粒数量。

进一步，构建OsGAmyb基因的超表达水稻植株。在OsGAmyb基因的超表达水稻植株中，OsGAmyb蛋白的表达量上升，提高单株分蘖数、生物量、稻谷数量以及单株产量。

进一步，构建OsTCP21基因的超表达水稻植株。在OsTCP21基因的超表达水稻植株中，OsTCP21蛋白的表达量上升，提高单株分蘖数、生物量、稻谷数量以及单株产量。

附图说明

图1为本发明实施例1的实时荧光定量PCR的统计柱状图，样本为：对照野生型日本晴（Ni）、OsTCP21基因超表达植株3个株系OE1、OE2和OE3（mean±SD，N=3）。

图2为本发明实施例2的实时荧光定量PCR的统计柱状图，样本为：对照野生型日本晴（Ni）、OsGAmyb基因超表达植株3个株系OE1、OE2和OE3（mean±SD，N=3）。

图3为本发明对比例1的突变体的OsTCP21基因序列比对图。

图4为本发明对比例2的突变体的OsGAmyb基因序列比对图。

图5为本发明实验例1的水稻单株小苗分蘖芽表型图（OsTCP21基因）。

图6为本发明实验例1的水稻单株小苗分蘖芽表型图（OsGAmyb基因）。

图7为本发明实验例1的水稻单株水稻分蘖数统计图（OsTCP21与OsGAmyb基因）（mean±SD，N=20）。

图8为本发明实验例1的水稻单株水稻生物量统计图（OsTCP21与OsGAmyb基因）（mean±SD，N=20）。

图9为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻表型图（OsTCP21基因）。

图10为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻的稻谷表型图（OsTCP21基因）。

图11为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻产量与分蘖数的关系图（OsTCP21基因）（mean±SD，N=20）。

图12为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻表型图（OsGAmyb基因）。

图13为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻的稻谷表型图（OsGAmyb基因）。

图14为本发明实验例2的在大田种植下单株水稻产量与分蘖数的关系图（OsGAmyb基因）（mean±SD，N=20）。

图15为本发明实验例3的实时荧光定量PCR检测结果（OsTCP21基因，mean±SD，N=3）。

图16为本发明实验例3的实时荧光定量PCR检测结果（OsGAmyb基因，mean±SD，N=3）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；MaXetal，Arobust CRISPR/Cas9 system forconvenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicotplants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284.）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：OsTCP21基因超表达植株的构建

提取水稻日本晴(Ni)的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对F1和R1，通过PCR扩增OsTCP21基因的cDNA（OsTCP21基因的蛋白序列参见SEQ ID NO.3，OsTCP21基因的基因序列参见SEQ ID NO.4）。引物对F1和R1，分别为：

F1：5'-gagctcggtacccggggatccatggagctcgccggcagcaa-3'（SEQ ID NO.5，含酶切位点KpnI）；

R1：5'-tccaagggcgaattggtcgacgtgcttgcccttctccttgatgt-3'（SEQ ID NO.6，含酶切位点BamHI）。

然后通过两个酶切位点KpnI和BamHI，将OsTCP21基因的cDNA连入pCAMBIA-1306载体（pCAMBIA-1306载体购自Cambia公司），构建出OsTCP21基因的超表达载体OsTCP-p1306。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种日本晴中。

将得到的所有转基因小苗用加潮霉素的正常营养液培养一周，若小苗能够正常生长则说明转基因植株为阳性植株。将所有的转基因阳性植株移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约15cm时，种于大田中，待苗长大后，转基因水稻植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsTCP21基因超表达植株。本实施例共制备获得三种基因过表达植株，分别为OsTCP21-OE1，OsTCP21-OE2和OsTCP21-OE3。

取OsTCP21基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsTCP21基因在超表达植株的表达量，结果显示（图1）超表达植株中OsTCP21基因的表达量比对照日本晴提高（图中野生型Ni的表达量定为“1”），实验表明表示转基因成功，且基因成功实现了过量表达，过表达植株构建成功。实时荧光定量PCR所用引物对F2和R2，其序列分别为：

F2：5'-tctcacctctccagccatca-3'（SEQ ID NO.7）；

R2：5'-gtgcttgcccttctccttga-3'（SEQ ID NO.8）。

图1中数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，星号表示不同组别与对照组之间相比具有差异显著（*表示p < 0.05, **表示p < 0.01, ***表示p < 0.001）。

实施例2：OsGAmyb基因超表达植株的构建

提取水稻日本晴的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对F3和R3，通过PCR扩增OsTCP21基因的cDNA（OsGAmyb基因的蛋白序列参见SEQ ID NO.1，OsGAmyb基因的基因序列参见SEQ ID NO.2）。引物对F3和R3分别为：

F3：5'-gagctcggtacccggggatccatgtatcgggtgaagagcgagag-3'（SEQ ID NO.9，含酶切位点KpnI）；

R3：5'-tccaagggcgaattggtcgactttgaattctgacatttcacaggc-3'（SEQ ID NO.10，含酶切位点BamHI）。

通过KpnI和BamHI连入pCAMBIA-1306载体（pCAMBIA-1306载体购自Cambia公司），构建出OsGAmyb基因的超表达载体OsGAmyb-p1306。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常水稻品种日本晴中。

将得到的所有转基因小苗用加潮霉素的正常营养液培养一周，若小苗能够正常生长则说明转基因植株为阳性植株。将所有的转基因阳性植株移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约15cm时，种于大田中，待苗长大后，转基因水稻植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即得到OsGAmyb基因超表达植株，分别为OsGAmyb-OE1，OsGAmyb-OE2和OsGAmyb-OE3。

取OsGAmyb基因超表达植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsGAmyb基因在超表达植株的表达量，结果显示（图2）超表达植株中OsGAmyb基因的表达量比对照日本晴提高（图中野生型Ni的表达量定为“1”），实验表明表示转基因成功，且基因成功实现了过量表达，过表达植株构建成功。实时荧光定量PCR所用引物对F4和R4，其序列分别为：

F4：5'-cagaagaacaccgggctgt-3'（SEQ ID NO.11）；

R4：5'-caaatgagcggccatccga-3'（SEQ ID NO.12）。

图2中数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，星号表示不同组别与对照组之间相比具有差异显著（*表示p < 0.05, **表示p < 0.01, ***表示p < 0.001）。

对比例1：OsTCP21基因突变体植株的构建（基因敲除）

利用引物对F5和R5构建OsTCP21基因的基因敲除载体OsTCP21-C，其中F5和R5分别为：

F5：5'-gctgtggcggtccttcccgcgttttagagctagaaatagcaagtta-3'（SEQ IDNO.13）；

R5：5'-gcgggaaggaccgccacagcaacctgagcctcagcgcagc-3'（SEQ ID NO.14）。

基因敲除利用CRISPR/Cas9***进行，其方法参见现有技术文献：MaXetal，Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种日本晴（Ni）中。突变体植株在T0代时进行测序，确定基因已经敲除3个株系（图3），继续独立繁种到T1代，即得到OsTCP21基因的独立的突变体植株株系（均为纯合突变体），分别为：OsTCP21-C1（缺失2bp）、OsTCP21-C2（缺失1bp）和OsTCP21-C3（缺失2bp）。

对比例2：OsGAmyb基因突变体植株的构建（基因敲除）

利用引物对F6和R6构建OsGAmyb基因的基因敲除载体OsGAmyb-C，其中F6和R6分别为：

F6：5'-ggagcagatggactcgccgggttttagagctagaaatagcaagtta-3'（SEQ IDNO.15）；

R6：5'-ccggcgagtccatctgctccaacctgagcctcagcgcagc-3'（SEQ ID NO.16）。

基因敲除利用CRISPR/Cas9***进行，其方法参见现有技术文献：MaXetal，Arobust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genomeediting in monocot and dicot plants.MolPlant.2015,8(8):1274-1284。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将基因敲除表达载体导入正常粳稻品种日本晴（Ni）中。突变体植株在T0代时进行测序，确定基因已经敲除3个株系（图4），继续独立繁种到T1代，即得到OsTCP21基因的独立的突变体植株株系（均为纯合突变体），分别为：OsGAmyb-C1（缺失2bp）、OsGAmyb-C2（缺失1bp）和OsGAmyb-C3（缺失1bp）。

实验例1：水培试验

将超表达植株（实施例1）、日本晴（Ni）和基因敲除植株（对比例1）的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，营养液配方参考现有技术常规的国际水稻所配方，分别培养40天，观察水稻表型，统计水稻分蘖芽数目与生物量（即幼苗鲜重），并对水稻分蘖芽进行荧光体视显微镜拍照处理。分蘖芽拍照结果如图5所示，从图中可以看出OsTCP21基因超表达植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度增加，并达到差异显著。OsTCP21基因敲除突变体植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度减少，并达到差异显著。

将超表达植株（实施例2）、日本晴（Ni）和基因敲除植株（对比例2）的种子在培养皿上用蒸馏水浸种3天并培养7天后，转入水稻营养液培养，营养液配方参考现有技术常规的国际水稻所配方，分别培养40天，观察水稻表型，统计水稻分蘖芽数目与生物量，并对水稻分蘖芽进行荧光体视显微镜拍照处理。分蘖芽拍照结果如图6所示，从图中可以看出OsGAmyb基因超表达植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度增加，并达到差异显著。OsGAmyb基因敲除突变体植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度减少，并达到差异显著。

对实施例1和2以及对比例1和2的水培植株进行分蘖芽数目的统计，统计结果参见图7（针对三个基因敲除植株，重复实验的分蘖数一样，均为2）。水稻分蘖芽数目统计结果表明，OsTCP21基因超表达植株、OsGAmyb基因超表达植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度增加，并达到差异显著。OsTCP21基因敲除突变体植株、OsGAmyb基因敲除突变体植株与对照日本晴植株相比分蘖数与分蘖芽长度减少，并达到差异显著。对实施例1和2以及对比例1和2的水培植株进行生物量统计，生物量统计结果表明（图8），OsTCP21基因超表达植株、OsGAmyb基因超表达植株与对照日本晴植株相比生物量增加，并达到差异显著。OsTCP21基因敲除突变体植株、OsGAmyb基因敲除突变体植株与对照日本晴植株相比生物量减少，并达到差异显著。其中，在图7和图8中，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，星号表示不同组别与对照组之间相比具有差异显著（*表示p < 0.05, **表示p < 0.01）。

实验例2：大田种植实验

使用超表达植株（实施例1）、日本晴（Ni）和基因敲除植株（对比例1）进行大田种植实验。从大田中随机选取OsTCP21基因的超表达植株三个株系、OsTCP21基因敲除植株三个株系及对照日本晴（Ni）各一株，放入小桶中进行拍照，发现超表达植株分蘖增多、基因敲除植株分蘖减少（图9）。从上述超表达植株三个株系、基因敲除三个株系及对照日本晴中随机选取一株，将所有带壳的已灌浆的水稻种子排成一个圆形，发现超表达植株种子比对照日本晴的圆圈增大，基因敲除植株种子比对照日本晴的圆圈减小（图10）。统计了超表达植株、基因敲除植株和对照组的单株产量和单株分蘖数，统计显示超表达植株的单株产量和单株分蘖数较对照组显著增加，但是基因敲除植株却呈现显著的减少（图11）。

使用超表达植株（实施例2）、日本晴（Ni）和基因敲除植株（对比例2）进行大田种植实验，实验方法参见本实验例的前段的内容，实验结果如图12、13和14所示。超表达植株分蘖增多、基因敲除植株分蘖减少（图12）。超表达植株种子比对照日本晴的圆圈增大，基因敲除植株种子比对照日本晴的圆圈减小（图13）。超表达植株的单株产量和单株分蘖数较对照组显著增加，但是基因敲除植株却呈现显著的减少（图14）。

在图11和图14中，中空的条形柱子表示为单株产量（g），实心的条形柱子表示为单株分蘖数。数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，小写字母表示不同组别之间相比具有差异显著（*表示p<0.05, **表示p<0.01）。上述结果表明，OsTCP21基因提高表达后可以使正常的水稻分蘖数增多，并使单株水稻种子数量增多，从而提高水稻单株产量。通过敲除OsTCP21基因，使水稻分蘖数减少，并使单株水稻种子数量减少，千粒重降低，从而降低水稻单株产量，严重影响水稻单产。OsGAmyb基因提高表达后可以使正常的水稻分蘖数增多，并使单株水稻种子数量增多，生物量增加，从而提高水稻单株产量。敲除OsGAmyb基因，使水稻分蘖数减少，并使单株水稻种子数量减少，千粒重降低，从而降低水稻单株产量，严重影响水稻单产。

实验例3：OsTCP21基因和OsGAmyb基因的上游调控因素

在研究miR319对水稻发育的影响时，构建了三种miR319敲除植株STTM319-1、STTM319-2和STTM319-3，以及构建了三种miR319超表达植株OE319a-1、OE319a-2和OE319a-3。取miR319敲除植株、miR319超表达植株和野生型植株的基部（根茎结合处，也是分蘖芽伸长处），提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsTCP21基因和OsGAmyb基因在上述植株的表达量，结果如图15和图16所示。实验结果显示，miR319过表达会导致OsTCP21基因和OsGAmyb基因的表达量下调，而敲除miR319会带来OsTCP21基因和OsGAmyb基因的表达量上调。这说明OsTCP21基因和OsGAmyb基因同时都受到miR319的调控。图15和图16中数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，星号表示不同组别与对照组之间相比具有差异显著（*表示p<0.05, **表示p<0.01, ***表示p<0.001）。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州大学

<120> 转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法

<130> 2021/3/2

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

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Cys Asp Asn Phe Ile Ala Asn Ser Glu Ala Leu Pro Tyr Ala Pro His

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355 360 365

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370 375 380

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<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

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gaggaggaga ggctcatcat ccagctccac tccaagatgg ggaacaagtg ggctcggatg 360

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<212> PRT

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SEQUENCE LISTING

<110> 贵州大学

<120> 转录因子在水稻育种中的应用以及水稻育种的方法

<130> 2021/3/2

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 553

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

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<213> Oryza sativa L.

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gggaatacag ctgatccatc agttttcaac aatgccatag caatgcttct gggcaatgac 1560

ttgagtatcg attgcagacc tgttcttggc gacggtatca tgttcaattc ttcctcgtgg 1620

agcaacatgc cacacgcctg tgaaatgtca gaattcaaat ga 1662

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

Met Glu Leu Ala Gly Ser Asn Asn Lys Arg Gly Arg Val Arg Gly Pro

1 5 10 15

Asn Asp Asp Asp Asp Asp Ala Gly Glu Pro Asp Ala Lys Arg His His

20 25 30

His Gln Leu Leu Leu Pro Trp Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Pro

35 40 45

Ala Ser Arg Ile Tyr Arg Val Ser Arg Ala Ser Gly Gly Lys Asp Arg

50 55 60

His Ser Lys Val Tyr Thr Ala Lys Gly Ile Arg Asp Arg Arg Val Arg

65 70 75 80

Leu Ser Val Ser Thr Ala Ile Gln Phe Tyr Asp Leu Gln Asp Arg Leu

85 90 95

Gly Tyr Asp Gln Pro Ser Lys Ala Ile Glu Trp Leu Ile Lys Ala Ala

100 105 110

Ala Ala Ala Ile Asp Lys Leu Pro Ser Leu Asp Thr Ala Ser Phe Pro

115 120 125

Thr Asn Pro Ala Ser Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro

130 135 140

Leu Pro His Ala Glu Arg Glu Gln Gln Gln Gln Leu Thr Lys Ser Gly

145 150 155 160

Cys Ser Ser Thr Ser Glu Thr Ser Lys Gly Ser Val Leu Ser Leu Ser

165 170 175

Arg Ser Glu Ser Arg Val Lys Ala Arg Glu Arg Ala Arg Glu Arg Ser

180 185 190

Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Lys Asp Ala Gly Asp Asp Ala Ala

195 200 205

Thr Pro Thr Ala Pro Thr Ala Ala Pro Ala Ser Ser Gln Ala Ala Ser

210 215 220

Phe Thr Glu Leu Leu Thr Gly Met Ala Ala Ala Asn Ala Ser Pro Ala

225 230 235 240

Asp His Lys Gln Gln Gln Ala Trp Gln Pro Met Thr Val Ala Ala Ala

245 250 255

Thr Ala Asp Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ala Ala Ala Pro His Thr Gln

260 265 270

Pro Arg Lys Ser Ala Ala Gly His His Ser Ala Met Pro His Thr Phe

275 280 285

Ala Ser Pro Ala Pro His Leu Ala Asn Ile Thr Pro Ile Ala Met Ala

290 295 300

Pro Ala Gln His Phe Thr Leu Thr Pro Ala Ala Ala Glu His His Ala

305 310 315 320

Glu Met Thr His Tyr Ser Phe Asp His Phe Met Pro Val His Ala Ala

325 330 335

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Pro Ala Gly Gly Asp Tyr Asn

340 345 350

Leu Asn Phe Ser Met Ser Ser Gly Leu Val Gly Val His Ser Arg Gly

355 360 365

Thr Leu Gln Ser Asn Ser Gln Ser His Leu Ser Ser His His His His

370 375 380

His His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Arg Leu Ser Ala

385 390 395 400

Pro Leu Asp Ala Pro Asn Ile Pro Phe Leu Phe Ser Pro Ala Ala Ala

405 410 415

Pro Thr Ala Ala Asp Thr Gln Phe Ala Ala Ala Leu Gln Leu Trp Asp

420 425 430

Gly Phe Arg His Ala Asp Ile Lys Glu Lys Gly Lys His

435 440 445

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 4

atggagctcg ccggcagcaa caacaagcgg gggagggtga gggggcccaa cgacgacgac 60

gacgacgccg gggagccgga cgccaagcgc catcaccacc agctgctgtt gccgtggccg 120

cagcagcagc agcagcagca tccggcgtcg cggatctacc gggtgtcgcg ggcctccggc 180

gggaaggacc gccacagcaa ggtgtacacg gccaagggca tccgcgaccg ccgcgtccgc 240

ctctccgtct ccaccgccat ccagttctac gacctccagg atcgtctcgg gtatgaccag 300

ccgagcaagg ccatcgagtg gctcattaag gccgccgccg ccgccatcga caagctccct 360

tcgcttgata ccgcttcctt ccccaccaac cccgcctcct ccgccgctgt tgctgctgct 420

gctgctcctc ctcttcccca tgccgaacgc gagcagcagc agcagctcac caagtccgga 480

tgcagtagca cgtcggagac cagcaagggc tccgtcctct ccctctcccg ctccgagagc 540

cgcgtcaagg ccagggagcg cgccagggag cggagcagcg cggccgccgc cgcggcatcc 600

aaggacgccg gggacgacgc cgccaccccc accgcgccca ccgccgcgcc cgcctcctcg 660

caggcggctt ccttcaccga gctactcacc gggatggccg cagccaacgc ctcacccgct 720

gaccacaagc agcagcaggc gtggcagccg atgaccgtcg ccgcggccac cgccgactac 780

atcggcttcg ccgccgccgc cgcgccgcat acgcagccgc ggaaatccgc cgcgggccat 840

cactccgcga tgccgcacac cttcgcatca cccgctcccc acctcgccaa catcaccccc 900

atcgccatgg cgcccgcgca gcacttcacc ctcacacccg ccgccgccga gcaccacgcg 960

gagatgacgc actactcgtt cgaccacttc atgcccgtcc acgcggcagc agcggcggcg 1020

gcggcggcct ccaccccggc cggcggcgac tacaacctca acttctccat gtcctcgggt 1080

cttgtgggtg tccacagtag ggggaccctt cagtccaatt cgcagtctca cctctccagc 1140

catcaccacc accatcacca gcaacagcag cagcagcagc agctgcagag gctgtctgct 1200

ccgctggatg cgcccaacat tccgttcctc ttcagcccgg ccgccgcgcc caccgccgcg 1260

gacacccagt tcgccgccgc attgcagctc tgggacgggt tccggcacgc cgacatcaag 1320

gagaagggca agcactga 1338

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagctcggta cccggggatc catggagctc gccggcagca a 41

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tccaagggcg aattggtcga cgtgcttgcc cttctccttg atgt 44

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctcacctct ccagccatca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgcttgccc ttctccttga 20

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagctcggta cccggggatc catgtatcgg gtgaagagcg agag 44

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tccaagggcg aattggtcga ctttgaattc tgacatttca caggc 45

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cagaagaaca ccgggctgt 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caaatgagcg gccatccga 19

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctgtggcgg tccttcccgc gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgggaagga ccgccacagc aacctgagcc tcagcgcagc 40

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggagcagatg gactcgccgg gttttagagc tagaaatagc aagtta 46

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccggcgagtc catctgctcc aacctgagcc tcagcgcagc 40

Claims

1.一种用于提高水稻分蘖数、生物量以及籽粒数量的水稻育种的方法，其特征在于：提高水稻植株的OsGAmyb基因和/或OsTCP21基因的蛋白的表达量；OsGAmyb基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，OsTCP21基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的水稻育种的方法，其特征在于：OsGAmyb基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，OsTCP21基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的水稻育种的方法，其特征在于：提高水稻植株的OsGAmyb基因的表达量的步骤如下：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsGAmyb基因的cDNA，然后将OsGAmyb基因的cDNA连接在pCAMBIA-1306载体上，获得超表达载体OsGAmyb-p1306；采用农杆菌介导的遗传转化方法，将超表达载体OsGAmyb-p1306导入野生型水稻中，经筛选和培育，获得OsGAmyb基因超表达植株。

4.根据权利要求3所述的水稻育种的方法，其特征在于：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsGAmyb基因的cDNA的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的F3，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的R3。

5.根据权利要求2所述的水稻育种的方法，其特征在于：提高水稻植株的OsTCP21基因的表达量的步骤如下：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsTCP21基因的cDNA，然后将OsTCP21基因的cDNA连接在pCAMBIA-1306载体上，获得超表达载体OsTCP-p1306；采用农杆菌介导的遗传转化方法，将超表达载体OsTCP-p1306导入野生型水稻中，经筛选和培育，获得OsTCP21基因超表达植株。

6.根据权利要求5所述的水稻育种的方法，其特征在于：使用RT-PCR从野生型水稻中获得OsTCP21基因的cDNA的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的F1，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的R1。

7.转录因子在提高水稻分蘖数、生物量以及籽粒数量的水稻育种中的应用，其特征在于：所述转录因子的表达量上升；所述转录因子包括OsGAmyb蛋白和/或OsTCP21蛋白；所述OsGAmyb蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述OsTCP21蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

8.根据权利要求7所述的转录因子在水稻育种中的应用，其特征在于：构建OsGAmyb基因的超表达水稻植株。

9.根据权利要求7所述的转录因子在水稻育种中的应用，其特征在于：构建OsTCP21基因的超表达水稻植株。