CN107384937A - 控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3(SEQ ID NOs:1‑2)及其应用。LGY3控制水稻粒长、粒重和产量,也会影响稻米外观品质。该基因的一个优异等位变异类型lgy3(SEQ ID NOs:3‑4)既能增加水稻粒长、粒重和产量,同时还能提升稻米外观品质。lgy3与其他优异等位基因dep1‑1和gs3聚合可以实现水稻产量和稻米品质协同改良。本发明还公开了利用LGY3基因培育产量提高的作物的方法和培育具有提高的米质和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法。LGY3优异等位基因对协同提高水稻等作物的产量和品质的育种具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地,本发明涉及一种控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3及其等位基因lgy3以及它们的应用。本发明还涉及由该基因编码的多肽序列,以及利用它们培育优良的水稻品种的方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上主要粮食作物之一,全球近一半的人口以稻米为主食。在我国水稻是第一大口粮作物,近年来伴随着人口逐渐增加,而水稻种植面积持续下降,为确保稻米粮食安全,提高水稻产量尤其重要。此外,随着人们生活水平的提高和稻米市场的开放,对稻谷外观和蒸煮食味等品质的要求也日益提高,特别是在国际市场上尤为突出,因此,改良稻米品质也成为育种的重要目标之一。
水稻产量主要由单位面积有效分蘖数,每穗粒数和千粒重三个要素构成。其中千粒重与水稻粒形(粒长、粒宽和长宽比)紧密相关。水稻粒形性状的研究对提高稻米产量具有重要的现实意义和理论价值。水稻籽粒形状也是衡量稻米外观品质的重要指标之一,同时还影响稻米的商品品质和加工品质(糙米率、精米率、整精米率等)。我国的国家优质稻谷标准中还规定优质籼稻品种的长宽比不能低于2.8,籽粒形状已成为育种家选育优质米品种的一个重要指标。
水稻粒形是典型的数量性状,受多基因调控,遗传基础复杂。近年来,通过GWAS、QTL分解和图位克隆技术相结合的办法已经解析了多个控制水稻粒形的关键基因。例如,控制水稻粒长基因GS3(Fan等,2006;Mao等,2010)和GL3.1(Qi等,2012)以及控制水稻粒宽基因GW2(Song等,2007)、GW5(Shomura等,2008;Weng等,2008)、GS5(Li等,2011)、GW7(Wang等,2015a;Wang等,2015b)和GW8(Wang等,2012)。这些粒形基因的克隆与功能分析为基于粒形改良来提高稻米产量与品质的分子设计育种提供了理论支持。
发明内容
本发明人利用美国粳稻品种L204和中国粳稻品种武运粳7号(WYJ7,带dep1-1位点)杂交所构建的一套重组自交系,筛选到一个在dep1-1背景下能增加粒长的材料RIL186,之后利用QTL分析和图位克隆的方法分离鉴定出一个控制水稻粒长和产量的基因LGY3(Long Grain and High Yield 3),并构建了近等基因系WYJ7-LGY3和WYJ7-lgy3,以及HJX74-LGY3和HJX74-lgy3,通过对近等基因系材料的表型分析及遗传互补实验,证明了该基因在水稻粒型、产量和稻米品质控制方面的功能。本发明人还将lgy3等位变异分别导入到泰国籼稻品种RD23(带gs3位点)和恢复系9311(带gs3位点)背景,探讨lgy3在常规稻和杂交稻的聚合育种中的应用价值。本发明人的研究可为今后从分子水平阐明水稻粒形调控的遗传基础,以及为水稻基于分子设计的高产优质育种提供理论依据及材料支持。
本发明涉及一种控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因及其应用。本发明的目的在于提供一种从水稻中分离克隆控制水稻粒形(籽粒长)的重要功能基因及其应用。在本发明中将这种控制水稻粒长、粒重和产量的基因称为LGY3。本发明还涉及LGY3的一种等位基因,其也能够控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质,本发明将该等位基因称为lgy3。
在本发明的第一方面中,通过利用长粒粳稻L204和武运粳7号(WYJ7)构建重组自交系(Recombinant Inbred Lines,RILs),其中RIL186表现出粒长显著增加的表型,利用RIL186与籼稻RD23构建QTL分析群体,从中鉴定到一个控制水稻粒长和产量的主效QTL,qLGY3。进一步回交,构建精细定位群体,将LGY3基因精细定位到水稻第3号染色体短臂端8.8Kb的物理范围内,并构建了武运粳7号(WYJ7)和华粳籼74(HJX74)背景下的近等基因系材料NIL-lgy3。
本发明的第二方面涉及控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3及其等位基因lgy3,其为一种分离的多核苷酸,分别编码SEQ ID NO:5或6所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中,所述控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3及其等位基因lgy3包含从下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NOs:1-4中的任何一个所示的核苷酸序列;
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列;
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列;
(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列;
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列:SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列,或者,由于一或多个(例如1-25个、1-20个,1-15个,1-10个,1-5个,1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列,或者,与SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列;
(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段;或
(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
其中,LGY3和lgy3的cDNA序列和gDNA序列如SEQ ID NOs:1-4所示,其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NOs:5-6所示。具体参见下表1。
表1.SEQ ID NOs:1-6的序列名称及其来源
其中,LGY3(SEQ ID NOs:1-2)能够控制水稻粒长、粒重和产量,也会影响稻米外观品质。该基因的优异等位变异lgy3(SEQ ID NOs:3-4)既能增加水稻粒长、粒重和产量,同时还能提升稻米外观品质。
优选地,本发明涉及的控制水稻籽粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3如SEQ ID NO:1或2所示,其等位基因lgy3如SEQ ID NO:3或4所示。
与LGY3基因编码的LGY3蛋白(SEQ ID NO:5)相比,lgy3基因编码的lgy3蛋白(SEQID NO:6)具有不完整的C结构域和降低的转录活性。
在本发明中,改良水稻籽粒外观品质主要是指增加粒长、提高籽粒的长宽比、降低籽粒的垩白度等(一般指,与对照品种相比,增加或减少的幅度达到显著差异水平,即方差分析P值<0.05)。稻米品质性状主要包括以下几个方面:加工碾磨品质、外观品质、蒸煮食味品质、营养品质和卫生品质,它们之间既有区别又相互联系。其中,与粒型最相关的是外观品质。籽粒外观品质主要包括粒形、垩白粒率、垩白度和透明度。此外,直链淀粉含量是蒸煮食味品质的重要指标之一。粒型一般通过测量水稻籽粒的长度(粒长)、宽度(粒宽)、厚度(粒厚)和长宽比(粒长与粒宽的比值)进行描述。粒长指完整无破损精米籽粒两端的最大距离,以mm为单位。通常根据粒长把稻米分为长粒、中粒和短粒三类(见下表2)。精米率指脱壳后的糙米碾磨成精度为国家标准一等大米时,所得精米的质量占样本净稻谷质量的比率。整精米指糙米碾磨成精度为国家标准一等大米时,迷离产生破碎,其中长度仍达到完整精米粒平均长度的五分之四以上(含五分之四)的米粒(参见GB1350-1999,定义7)。整精米率指整精米占净稻谷试样质量的百分率(参见GB1350-1999,定义8)。垩白粒率是指整精米中垩白米粒的百分比,垩白度是指稻米中垩白部位的面积占米粒投影面积的百分比。垩白是指稻米胚乳中组织疏松而形成的白色不透明的部分的总称。垩白度及垩白米率是水稻籽粒外观品质最重要的性状。垩白度和垩白米率越低,代表稻米米质越优。透明度指整精米籽粒的透明程度,用稻米的相对透光率表示。碱消值指碱液对整精米粒的侵蚀程度。糊化温度是指稻米淀粉颗粒在水中受热产生不可逆膨胀(糊化),双折射现象消失时的温度,一般采用碱消值表示。碱消值大小可以间接地表示稻米糊化温度的高低,碱消值越大,糊化温度越低。质量指数是品种品质综合评价的参数,表示本次样品质量的整体水平,以本批次样品的各品质指标(包含品种品质的理化指标和蒸煮食味品质)实测结果得分的总和占该稻类品质最高总分的白分率表示。在农业部行业标准食用稻品种品质NY/T-593-2002(中国稻米,2003年第1期,第41-42页)中公开了一些水稻籽粒外观品质参数,见下表2。
表2.水稻籽粒外观品质参数(参见农业部行业标准食用稻品种品质NY/T-593-2002,中国稻米,2003年第1期,第41-42页)
稻米粒长的分类(单位:mm)
籼稻品种品质等级
粳稻品种品质等级
其中糙米率、精米率检验按NY/T83-1988中4.1、4.2执行;整精米率检验按GB 1350附录A执行;粒长检验按GB/T 17891-1999附录C中C2.1执行;垩白粒率、垩白度、胶稠度检验按GB/T 17891-1999中6.2、6.3及其附录A执行;透明度、碱消值检验按NY/T83-1988中5.3、6.2执行;直链淀粉检验按GB/T 15683-1995执行;蒸煮食味道品质检验按GB/T 15682执行。
本发明培育的水稻籽粒的外观品质参数可参见下表5(见实施例4)。
本发明的第三方面涉及分离的多肽(也称蛋白质),其由本发明所述的LGY3或lgy3基因编码,其包含从下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列,
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个,1-15个,1-10个,1-5个,1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列,
(3)与SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列,
(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段,
(5)由本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
其中,LGY3蛋白序列及其变体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NOs:5-6所示,具体参见表1。
本发明的LGY3蛋白属于MIKC类的MADS蛋白家族,包含MADS结构域、I结构域、K结构域和C结构域。本发明涉及lgy3蛋白与LGY3蛋白相比,缺少完整的C结构域。
本发明的第四方面涉及一种重组构建体,其含有本发明所述的控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3或等位基因lgy3的多核苷酸序列。其中所述构建体所用的载体可以是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。
本发明的第五方面涉及一种重组宿主细胞,其含有本发明所述的重组构建体,或在其基因组中整合有本发明所述的控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3或等位基因lgy3的多核苷酸序列。所述宿主细胞可以选自植物细胞或者微生物细胞,例如大肠杆菌细胞或农杆菌细胞,优选植物细胞,最优选水稻细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的或者是植物的一部分。
本发明的第六方面涉及本发明的多核苷酸(即,控制水稻粒长和产量的基因LGY3或等位基因lgy3或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因)或多肽或本发明的重组构建体或本发明的重组宿主细胞在改良作物植物性状(例如,提高作物产量)和稻米品质中的用途。
本发明还涉及改良水稻农艺性状(例如,提高水稻产量和稻米品质)的方法,该方法包括培育含有本发明的控制水稻粒长、粒重、产量和外观品质的基因LGY3或等位基因lgy3的多核苷酸序列或本发明的构建体的水稻植物,例如,所述方法可以包括:从含有本发明的控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3或其等位变异lgy3的重组水稻细胞再生转基因水稻植株或者将含有本发明所述的控制水稻粒长、粒重、产量和外观品质的基因LGY3或其等位基因lgy3或LGY3经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交,或者利用包含lgy3的重组农杆菌细胞转染水稻植株获得转基因水稻植株。所述性状包括但不限于:粒长、粒宽、长宽比、灌浆速率、产量和外观品质等。其中所述水稻植株优选是粒长改变,长宽比增加,千粒重和产量提高、籽粒外观品质改善的水稻植株。也就是说,在水稻中过量表达优异等位基因lgy3能够提高水稻产量和稻米品质。
在本发明的第七方面中,本发明提供所述LGY3或lgy3等位编码基因的用途,其用于控制作物籽粒的粒形(更优选地,通过控制粒长、提高千粒重而提高作物产量)和籽粒外观品质(更优选的,减少米粒的垩白率);调控但不仅限于细胞***;作为鉴定作物细长粒型品种的分子标记。
本发明的第八方面涉及一种培育改良的水稻品种的方法。该方法包括:利用包含LGY3或等位基因lgy3的重组农杆菌细胞转染水稻植株获得转基因水稻植株,或者将LGY3或等位基因lgy3或LGY3经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交获得后代水稻植株,其中所获得的水稻植株优选是粒形改变、长宽比增大、籽粒外观品质得到改良的水稻植株。
在本发明更优选的实施方案中,根据更详细的实验验证,本发明人发现可以利用LGY3基因及其等位基因lgy3通过以下五种方式进行培育具有增加粒长和产量、提高品质的水稻品种的育种实验:
(1)通过将LGY3基因及其等位基因lgy3与其他粒形基因聚合改良水稻的籽粒形状、品质及产量;
(2)改变水稻中LGY3或lgy3基因的表达水平;
(3)改变作物中LGY3或lgy3基因所编码的蛋白质的含量;
(4)改变作物中LGY3基因所编码的蛋白质的结构,更优选的,缺少C结构域进而导致蛋白转录活性下降;
(5)应用到杂交稻育种中。
其中(1)中所提及的其他粒形基因包括,但不限于dep1-1(参见申请号201110029759.9,其为本申请人已授权的发明专利,其中提供了dep1基因序列和编码的氨基酸序列,在本发明中以dep1-1表示depl基因,其基因序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO:14和15所示)和gs3基因(参见Fan C,Xing Y,Mao H,Lu T,Han B,Xu C,Li X,Zhang Q(2006)GS3,a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grainwidth and thickness in rice,encodes a putative transmembraneprotein.Theoretical Applied Genetics,112(6):1164-1171,其中提供了GS3基因序列和编码的氨基酸序列(GenBank:DQ355996)。在本发明中,9311背景来源的gs3基因的基因组DNA序列如SEQ ID NO:11所示,其中第2233位碱基由C变成A,导致蛋白翻译提前终止,cDNA序列如SEQ ID NO:12所示,编码的gs3蛋白序列如SEQ ID NO:13所示。
由此,本发明提供培育具有提高的米质和产量的水稻品种的育种方法,所述方法包括:利用包含LGY3基因或等位基因lgy3的重组宿主细胞(例如,农杆菌细胞)转染水稻植株获得含有LGY3基因或等位基因lgy3的转基因水稻植株。
所述培育具有提高的粒长、产量和籽粒外观品质的水稻品种的方法也可以这样进行:利用包含LGY3基因或其等位变异lgy3或LGY3经基因编辑获得其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交,获得包含LGY3基因或其等位变异的杂交水稻植株。其中所述另一水稻植株还可以包含dep1-1或者gs3基因。
在优选的实施方案中,本发明提供一种培育具有提高的粒长和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含LGY3或lgy3的水稻亲本与包含dep1-1和/或gs3基因的水稻亲本杂交,在后代中选育出LGY3-dep1-1、LGY3-gs3、lgy3-dep1-1或者lgy3-gs3双基因聚合或者lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的品系或品种。
在优选的实施方案中,本发明提供一种培育具有提高的粒长、产量和改良的籽粒外观品质的水稻杂交稻的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含权LGY3或lgy3的水稻恢复系或不育系与包含dep1-1和/或gs3基因的水稻不育系或恢复系杂交,选育出带有LGY3-dep1-1、LGY3-gs3、lgy3-dep1-1或lgy3-gs3双基因聚合的或者LGY3-gs3-dep1-1或lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的F1代的杂交水稻。
综上所述,本发明提供下述实施方案:
1.一种分离、克隆的控制水稻籽粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因,其为一种分离的多核苷酸,其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列:
(1)SEQ ID NOs:1-4中的任何一个所示的核苷酸序列;
(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的核苷酸序列;
(3)与(1)的核苷酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的核苷酸序列;
(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的核苷酸序列;
(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列:SEQ ID NOs:5和6中任何一个所示的氨基酸序列,或者,由于一或多个(例如1-25个、1-20个,1-15个,1-10个,1-5个,1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NOs:5和6中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列,或者,与SEQ ID NOs:5和6中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列;
(6)(1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段;或
(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种分离的蛋白质,其由第1项的控制水稻籽粒长和产量的基因LGY3编码,其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列:
(1)SEQ ID NOs:5和6中任何一个所示的氨基酸序列,
(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个,1-15个,1-10个,1-5个,1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NOs:5-6中任何一个所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列,
(3)与SEQ ID NOs:5和6中任何一个所示的氨基酸序列具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%同一性的氨基酸序列,
(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段,
(5)由权利要求1或权利要求2的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。
3.如第2项所述的蛋白质,其特征在于,所述的蛋白质具有MADS保守结构域、I结构域和K结构域。
4.一种重组构建体,其特征在于包含第1项的基因的多核苷酸序列。
5.第4项的重组构建体,其中所述重组构建体所用的载体是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。
6.一种重组宿主细胞,其特征在于包含第1项的基因的多核苷酸序列或第4项的重组构建体,或它的基因组中整合有第1项的基因的多核苷酸序列,其中所述细胞选自植物细胞或者微生物细胞,其中所述微生物细胞优选为大肠杆菌或农杆菌细胞。
7.第6项所述的重组宿主细胞,其中所述细胞为水稻细胞。
8.一种培育产量提高、籽粒外观品质改良的水稻品种的方法,所述方法包括:利用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的重组农杆菌细胞转染水稻获得转基因水稻植株,或者将含有第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交,其中所获得的水稻植株优选是粒形改变,长宽比增大,籽粒外观品质得到改良的水稻植株。
9.一种培育具有提高的粒长和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻亲本与包含dep1-1基因的另一水稻亲本杂交,在后代中选育出LGY3-dep1-1、或lgy3-dep1-1双基因聚合的品系或品种。
10.一种培育具有提高的粒长和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻亲本与包含gs3基因的另一水稻亲本杂交,在后代中选育出LGY3-gs3或lgy3-gs3双基因聚合的品系或品种。
11.一种培育具有提高的粒长和产量的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻亲本与包含gs3和dep1-1基因的另一水稻亲本杂交,在后代中选育出LGY3-dep1-1-gs3或lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的品系或品种。
12.一种培育具有提高的粒长、产量和改良的籽粒外观品质的水稻杂交稻的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻恢复系或不育系与包含dep1-1基因的不育系或恢复系杂交,选育出LGY3-dep1-1或lgy3-dep1-1双基因聚合的F1杂交种。
13.一种培育具有提高的粒长、产量和改良的籽粒外观品质的水稻杂交稻的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻恢复系或不育系与包含gs3基因的不育系或恢复系杂交,选育出LGY3-gs3或lgy3-gs3双基因聚合的F1杂交种。
14.一种培育具有提高的粒长、产量和改良的籽粒外观品质的水稻杂交稻的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含第1项所述的基因或等位基因的水稻恢复系或不育系与包含dep1-1和gs3基因的水稻不育系或恢复系杂交,选育出带有LGY3-gs3-dep1-1或lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的F1代的杂交水稻。
以下是对本发明中所用的一些术语的定义。除非另外指明,本发明所用的术语具有本领域普通技术人员已知的意思。
“相关”/“可操作地连接”指两个物理或功能相关的核酸序列。例如,如果启动子或调节DNA序列和编码RNA或蛋白质的DNA序列可操作地连接或定位以至于调节DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平,那么称启动子或调节DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“相关”。
“嵌合基因”是重组核酸序列,其中启动子或调节核酸序列可操作地连接编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列,或与编码mRNA或作为蛋白质表达的核酸序列相关,使得调节核酸序列能调节相关核酸序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不是如自然界中所发现的正常可操作地连接相关核酸序列。
“编码序列”是转录为RNA如mRNA,rRNA,tRNA,snRNA,有义RNA或反义RNA的核酸序列。优选地,随后在生物体中翻译RNA以产生蛋白质。
“杂交稻”是指两个遗传组成不同的水稻品种(系)间杂交产生的具有杂种优势的第一代杂交种的统称。目前生产上广泛使用的有三系杂交稻和两系杂交稻。三系杂交稻种子的生产需要雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的相互配套。不育系的不育性受细胞质和细胞核的共同控制,需与保持系杂交,才能获得不育系种子;不育系与恢复系杂交,获得杂交稻种子,供大田生产应用。两系杂交水稻的生产只需不育系和恢复系。其不育系的育性受细胞核内隐性不育基因与种植环境的光长和温度共同调控,并随光、温条件变化产生从不育到可育的育性转换,其育性与细胞质无关。利用光温敏不育系随光温条件变化产死育性转换的特性,在适宜的光温时期,可自交繁殖种子。
在本发明上下文中,“对应于”意指当不同LGY3基因或蛋白质的核酸编码序列或氨基酸序列互相比对时,“对应于”一些计数位置的核酸或氨基酸是与这些位置比对,但不必是在相对于特定LGY3各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。同样,当特定LGY3的编码或氨基酸序列与参照LGY3的编码或氨基酸序列比对时,“对应于”参照LGY3序列一些计数位置的该特定LGY3序列中核酸或氨基酸是与参照LGY3序列的这些位置比对,但不必是在该特定LGY3蛋白质各自核酸编码序列或氨基酸序列的这些精确数字位置中的核酸或氨基酸。
这里所用的“表达盒”意指能指导适合宿主细胞中特定核苷酸序列表达的核酸序列,包含与目的核苷酸序列可操作地连接的启动子,所述目的核苷酸序列可操作地连接终止信号。通常,它也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的,意指至少其成分之一相对于至少它的其它成分之一是异源的。表达盒也可以是天然存在的,但以重组形式获得用于异源表达的表达盒。然而,通常,表达盒相对于宿主是异源的,即,表达盒的特定核酸序列非天然出现在宿主细胞中,必须通过转化事件将其引入宿主细胞或宿主细胞的前体。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制,其中仅当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时,所述诱导型启动子才起始转录。如果是多细胞生物体的情况,如植物,启动子也可以是对特定组织,或器官或发育阶段特异的。
“基因”是位于基因组内的限定区域,除了前述编码核酸序列外,包含其它主要是调节性的核酸序列,所述调节性核酸序列负责编码部分的表达,即转录和翻译控制。基因也可以包含其它5’和3’非翻译序列和终止序列。进一步可以存在的元件是,例如内含子。
“异源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞非天然相关的核酸序列,包含非天然存在的天然存在核酸序列的多拷贝。
“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。
“同源重组”是同源核酸分子间核酸片段的相互交换。
当核酸序列编码与参照核酸序列编码的多肽有相同氨基酸序列的多肽时,该核酸序列与参照核酸序列是“同类编码”。
“分离的”核酸分子或分离的蛋白质是人工地与其天然环境分离而存在,因此不是天然产物的核酸分子或蛋白质。分离的核酸分子或蛋白质可以以纯化形式存在,或者可以存在于非天然环境如,例如重组宿主细胞或转基因植物中。
“天然基因”指在未转化细胞的基因组中存在的基因。
术语“天然存在”用于描述可以在自然界中发现的客体,其与人工产生的客体不同。例如,可以从自然来源分离,并没有在实验室有意进行人工修饰的、生物体(包括病毒)中存在的蛋白质或核苷酸序列是“天然存在”的。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源分离的单或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明上下文中,优选地,核酸分子是DNA片段。“核酸分子”也称多核苷酸分子。
“植物”是在任何发育阶段的任何植物,特别是种子植物。
“植物细胞”是植物的结构和生理学单位,包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单个细胞或培养细胞形式,或作为高等有组织的单位如,例如植物组织,植物器官或整个植物的一部分。
“植物细胞培养物”意指各种发育阶段的植物单位如,例如原生质体,细胞培养细胞,植物组织中的细胞,花粉,花粉管,胚珠,胚囊,合子和胚的培养物。
“植物材料”指叶,茎,根,花或花的部分,果实,花粉,***,合子,种子,插条,细胞或组织培养物,或植物的任何其它部分或产物。
“植物器官”是植物清楚的和明显结构化和分化的部分,如根,茎,叶,花蕾或胚。
这里所用的“植物组织”意指组织成结构和功能单位的一组植物细胞。包括植物中或培养物中植物的任何组织。该术语包括但不限于整个植物,植物器官,植物种子,组织培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。该术语与以上列举的或该定义包含的任何特定类型植物组织的联合应用或单独应用不意味排除任何其它类型植物组织。
“启动子”是编码区域上游非翻译的DNA序列,其包含RNA聚合酶II的结合位点,并起始DNA的转录。启动子区域也可以包含作为基因表达调节物的其它元件。
“原生质体”是没有细胞壁或仅有部分细胞壁的分离的植物细胞。
“调节元件”指参与控制核苷酸序列表达的序列。调节元件包含可操作地连接目的核苷酸序列的启动子和终止信号。通常它们也包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。
“改组的”核酸是通过改组方法,如这里所述的任何改组方法产生的核酸。通过人工的和可选地循环的方式(物理地或实际上)重组两个或多个核酸(或字符串)产生改组核酸。一般地,在改组方法中利用一步或多步筛选步骤以鉴定目的核酸;可以在任何重组步骤前或后进行该筛选步骤。在一些(但不是所有)改组实施方式中,期望在筛选前进行多轮重组以增加待筛选库的多样性。可选地,可以循环重复重组和筛选的全部过程。根据上下文,改组可以指重组和筛选的全部过程,或可替代地,可以仅指全部过程的重组部分。
在两个核酸或蛋白质序列比对中的短语“基本相同”指当比较和比对以获得最大对应时,如利用下面序列比较算法之一或目测所测定的,具有至少60%,优选80%,更优选90%,甚至更优选95%和最优选至少99%核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或多个序列或亚序列。优选地,基本同一性存在于至少约50个残基长度的序列区域,更优选至少约100个残基的区域上,最优选地,在至少约150残基中的序列基本相同。在特别优选的实施方式中,在编码区整个长度中序列基本相同。而且,基本相同的核酸或蛋白质序列具有基本相同的功能。
为了进行序列比较,通常,一个序列作为参照序列而与检测序列比较。当利用序列比较算法时,将检测和参照序列输入到计算机中,如果必要的话指定亚序列的坐标,并指定序列算法程序的参数。然后,根据选定的程序参数,序列比较算法将计算出检测序列相对于参照序列的百分序列同一性。
例如,通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索方法,通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,WI)或通过目测(通常参见,Ausubel等,下文)可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适于测定百分序列同一性和序列相似性的一个算法例子是BLAST算法,在Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述了该算法。通过国家生物技术信息中心(http://www.Ncbi.nlm.nih.gov/)公众可得到进行BLAST分析的软件。该算法包括:通过鉴定出查寻序列中长度为W的短字而首先鉴定出高分值序列对(HSPs),所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值记分T。T称为相邻字记分阈值(Altschul等,1990)。这些最初的邻近字命中作为开始查寻的线索去发现包含它们的更长的HSPs。然后,这些字命中将沿每个序列的两个方向尽可能远的延伸,直到积累比对分值不再增加。对于核苷酸序列,用参数M(成对匹配残基的奖励分值;总是大于零)和N(错配残基的罚分值;总是小于零)计算积累分值。对于氨基酸序列,用记分矩阵计算积累分值。当积累比对分值从获得的最大值回落数量X,由于一个或更多负分值残基比对积累,积累分值达到或低于零,或两个序列的任一个到达终点时,每个方向的字命中延伸停止。BLAST算法的参数W,T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长值(W)11,期望值(E)10,截断值100,M=5,N=-4和两个链的比较为缺省值。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用字长值(W)3,期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵为缺省值(参见,Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算百分序列同一性外,BLAST算法也进行两个序列间相似性的统计学分析(参见,例如Karlin&Altschul,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一个相似性测定是最小和概率(P(N)),其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率的指示。例如,如果检测核酸序列与参照核酸序列比较的最小和概率少于约0.1,更优选少于约0.01,最优选少于约0.001,那么认为检测核酸序列与参照序列相似。
两个核酸序列基本相同的另一个指标是两个分子在严格条件下互相杂交。短语“特异性杂交”指当该序列存在于复杂混合物(例如,总细胞的)DNA或RNA中时,在严格条件下,分子仅与特定核苷酸序列结合,形成双螺旋或杂交。“基本结合”指探针核酸和靶核酸间互补杂交,并且包含较少的错配,通过降低杂交介质的严格性可耐受所述的错配,以实现靶核酸序列的期望检测。
在核酸杂交试验如Southern和Northern杂交上下文中“严格杂交条件”和“严格杂交漂洗条件”是序列依赖性的,并且在不同环境参数下是不同的。较长的序列在较高温度特异性杂交。在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic AcidProbes,第1部分第2章″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″Elsevier,New York中可以发现核酸杂交的大量指南。一般地,对于在限定离子强度和pH下的特定序列,高严格性杂交和漂洗条件选择为低于热熔点(Tm)约5℃。典型地,在“严格条件”下,探针将与其靶亚序列杂交,而不与其它序列杂交。
Tm是(在限定离子强度和pH条件下)50%靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。对于特定的探针,非常严格的条件选择为等于Tm。在Southern或Northern印迹中在滤膜上有多于100个互补残基的互补核酸杂交的一个严格杂交条件的例子是在42℃,具有1mg肝素的50%甲酰胺,过夜进行该杂交。高严格性漂洗条件的例子是72℃,0.15M NaCl约15分钟。严格漂洗条件的例子是在65℃,0.2x SSC漂洗15分钟(参见,Sambrook,下文,SSC缓冲液的描述)。通常,在高严格性漂洗前进行低严格性漂洗以除去背景探针信号。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言,中严格性漂洗的例子是45℃,1x SSC漂洗15分钟。对于例如多于100个核苷酸的双螺旋而言,低严格性漂洗的例子是40℃,4-6x SSC漂洗15分钟。对于短探针(例如,约10到50个核苷酸),严格条件通常包括在pH7.0到8.3的少于约1.0M Na离子的盐浓度,通常约0.01到1.0M Na离子浓度(或其它盐),通常温度至少是约30℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以获得严格条件。一般地,在特定杂交测定中,信噪音比就无关探针所观察到的值高2×(或更高)表明特异杂交的检测。在严格条件下不互相杂交的核酸如果它们编码的蛋白质是基本相同的,那么它们仍是基本相同的。例如,当用遗传密码所允许的最大密码子简并性创造核酸拷贝时,就会出现这种情况。
下面是杂交/漂洗条件设置的例子,所述条件可以用于克隆与本发明参照核苷酸序列基本相同的同源核苷酸序列:参照核苷酸序列与参照核苷酸序列优选在50℃,7%十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交,在50℃,2X SSC,0.1%SDS中漂洗,更期望在50℃,7%十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交,在50℃,1X SSC,0.1%SDS中漂洗,更期望在50℃,7%十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交,在50℃,0.5X SSC,0.1%SDS中漂洗,优选地,在50℃,7%十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交,在50℃,0.1X SSC,0.1%SDS中漂洗,更优选地,在50℃,7%十二烷基硫酸钠(SDS),0.5M NaPO4,1mM EDTA中杂交,在65℃,0.1X SSC,0.1%SDS中漂洗。
两个核酸序列或蛋白质基本相同的另一个指标是第一核酸编码的蛋白质与第二核酸编码的蛋白质免疫交叉反应或特异结合。因此,蛋白质通常与第二蛋白质基本相同,例如,其中两个蛋白质仅仅由于保守性置换而不同。
“合成的”指包含天然序列中不存在的结构特征的核苷酸序列。例如,称更密切地类似双子叶和/或单子叶植物基因G+C含量和正常密码子分布的人工序列是合成的。
“转化”是向宿主细胞或生物体中引入异源核酸的过程,特别地,“转化”意指DNA分子稳定整合进入目的生物体基因组中。
“转化的/转基因的/重组的”指已经引入异源核酸分子的宿主生物体,如细菌或植物。核酸分子可以稳定地整合进入宿主基因组或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子可以是自主复制的。转化的细胞,组织,或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物,也包含其转基因子代。“非转化的”,“非转基因的”,或“非重组的”宿主指不含有异源核酸分子的野生型生物体,例如细菌或植物。
本文所用的术语“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子,可包含一个或多个原核序列,cDNA序列,包含外显子和内含子的基因组DNA序列,化学合成的DNA和RNA序列,以及有义和相应的反义链。生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的,并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等,1989,分子克隆,实验室手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约;Ausubel等,1989,分子生物学当前技术,Greene PublishingAssociates&Wiley Interscience,NY;Sambrook等,1989,分子克隆,实验室手册,第2版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约;Innis等(编),1995,PCR策略,Academic Press,Inc.,SanDiego;和Erlich(编),1992,PCR技术,牛津大学出版社,New York)完成。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1显示水稻粒形QTL定位分析。(a),WYJ7和L-204构建的重组自交系RIL186的粒形比较;(b),利用RD23和RIL186构建的BC1F2群体,鉴定控制水稻粒长和产量主效QTL。
图2显示RD23背景下近等基因系RD23-LGY3和RD23-lgy3的重要农艺性状表型比较分析。(a),粒长比较;(b),粒宽比较;(c)单株产量比较。
图3显示WYJ7背景下近等基因系WYJ7-LGY3-dep1-1和WYJ7-lgy3-dep1-1的重要农艺性状表型比较分析。(a),株型比较;(b),粒型比较,第一行为水稻籽粒的外形图,第二行为水稻精米的外观图;(c),株高比较;(d),抽穗期比较;(e),分蘖数比较;(f),每穗穗粒数比较;(g),粒长比较;(h),粒宽比较;(i),千粒重比较;(j),单株产量比较。
图4显示在籼稻品种华粳籼74(HJX74)中聚合优异等位基因lgy3和gs3对水稻粒形和产重的影响。(a),近等基因系材料的种子大小比较;(b),近等基因系材料的粒长统计分析;(c),近等基因系材料的单株产量比较分析;
图5显示lgy3在杂交稻育种的应用潜力分析。(a),杂交组合F1植株的粒型比较(b),杂交组合F1植株的粒长统计分析;(c),杂交组合F1植株的千粒重统计分析;(d),杂交组合F1植株的单株产量比较;
图6显示优异等位基因lgy3对稻米外观品质的影响。(a),在高产水稻品种WYJ7背景下,优异等位基因lgy3和dep1-1聚合提升水稻外观品质;(b)在RD23背景下,优异等位基因lgy3提升水稻外观品质;(c)在杂交水稻组合“两优培九”中,优异等位基因lgy3和gs3聚合提升杂交稻的稻米外观品质;
图7显示遗传互补验证候选基因LGY3功能。(a),pLGY3::RNAi-LGY3-和pLGY3::lgy3的转基因阳性植株的粒长显著增加;(b),过量表达优异等位基因lgy3的转基因阳性植株的粒长显著增加,而过量表达LGY3则会导致籽粒短小且发育异常;
图8显示LGY3蛋白与DEP1和GS3蛋白互作影响下游基因转录水平。(a),LGY3与DEP1蛋白互作;(b),LGY3与GS3蛋白互作;(c),DEP1可以增强LGY3的转录活性;(d),GS3可以增强LGY3的转录活性;表明LGY3参与G蛋白信号途径并调控水稻粒型和产量。
具体实施方式
本发明人通过深入研究,确定了一个能够改变水稻粒型、改善稻米外观品质、提高水稻产量的基因,该基因位于水稻第3号染色体短臂端。本发明人将克隆了该控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因,命名为LGY3。
植物转化
在特别优选实施方式中,在高等生物体例如植物中表达至少一种本发明的控制粒宽和粒重的蛋白。可将本发明的控制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列***到表达盒中,然后优选地,将该表达盒稳定整合在所述植物基因组中。在另一个优选实施方式中,将所述控制粒宽和粒重的基因的核苷酸序列包含在非致病自我复制的病毒中。按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物,包括但不限于玉米,小麦,大麦,黑麦,甘薯,豆,豌豆,菊苣,莴苣,甘蓝,花椰菜,花茎甘蓝,芜菁,萝卜,菠菜,芦笋,洋葱,大蒜,胡椒,芹菜,笋瓜,南瓜,***,夏南瓜,苹果,梨,温桲,瓜,李子,樱桃,桃子,油桃,杏,草莓,葡萄,木莓,黑莓,菠萝,鳄梨,蕃木瓜,芒果,香蕉,大豆,番茄,高粱,甘蔗,甜菜,向日葵,菜籽油菜,三叶草,烟草,胡萝卜,棉花,苜蓿,稻,马铃薯,茄子,黄瓜,拟南芥属和木本植物如针叶树和落叶树。特别优选的是水稻、小麦、大麦、玉米、燕麦、或黑麦。
一旦已将期望的核苷酸序列转化进入特定植物物种中,可以在该物种中繁殖它或用常规育种技术将它转移进入相同物种的其它品种,特别包括商业品种中。
优选地,在转基因植物中表达本发明的核苷酸序列,由此在转基因植物中引起相应粒宽蛋白的生物合成。以这种方式,可产生具有改良性状的转基因植物。为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列,本发明核苷酸序列可能需要修饰和优化。所有生物体都有特定的密码子使用偏爱性,这是本领域已知的,可以在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且,从有至少约35%,优选多于约45%,更优选多于50%,最优选多于约60%GC含量的编码序列可以最好地实现植物中高水平的表达。尽管可以在单子叶植物和双子叶植物物种中充分地表达优选的基因序列,但可以修饰序列以适应单子叶植物或双子叶植物的特异密码子偏好和GC含量偏好,因为这些偏好已被证明是不同的(Murray等,Nucl.Acids Res.17:477-498(1989))。此外,可筛选核苷酸序列以寻找引起信息截断的非常规剪接位点的存在。利用公开专利申请EP 0 385 962(Monsanto),EP 0 359 472(Lubrizol)和WO 93/07278(Ciba-Geigy)中所述的方法,用本领域熟知的位点定向诱变技术,PCR和合成基因构建进行在这些核苷酸序列中需要进行的所有改变,如上述那些改变。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,下列实施例仅用于进一步说明本发明,而不用来限制本发明的精神和范围。
需要说明的是,本领域技术人员应该理解,下述实施例中所用的试剂、酶类等除特别说明外,均为可从试剂公司商购的分析纯级别的试剂或酶类。
实施例1:水稻粒长和产量主效QTL-qLGY3的定位
水稻的产量由有效亩穗数、每穗粒数和千粒重决定。在生产上,每穗粒数和千粒重往往呈负相关。DEP1是控制水稻直立密穗表型的关键基因,显性突变的dep1-1通过增加二次枝梗数来增加穗粒数,进而提高水稻产量(参见申请号201110029759.9,其为本申请人已授权的发明专利,该申请中的dep1就是本发明中的dep1-1)。但是dep1-1的负效应在于千粒重降低。
本发明人利用武运粳7号(WYJ7)(江苏武进水稻研究所钮中一研究员提供)和长粒型的美国粳稻L204(中国水稻研究所钱前研究员提供)构建重组自交系(RecombinantInbred Lines,RILs),其中RIL186携带等位基因dep1-1且具有粒长增加的表型(图1a)。将RIL186与籼稻RD23杂交,BC1F2群体进行QTL分析,我们检测到两个控制水稻粒长的主效QTLs,qLGY3和qLG6(图1b)。其中在第3染色体短臂的qLGY3还控制水稻产量。
研究所用的分子标记是以PCR为基础的标记,包括SSR标记和自行设计InDel标记。SSR标记均来自McCouch等(2001,2002)发表的微卫星标记连锁图;STS标记是用SSR分析工具(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)分析克隆序列筛选出微卫星重复性好的SSR目标序列,再用Primer5分析软件对这些目标序列进行引物设计。从这些引物中选择了59对在染色体上均匀分布,且在亲本间多态性好的标记用于遗传背景筛选(粒形QTL分析所用的引物及其序列详见表3)。
PCR程序按照Panaud等(1996)的方法稍加修改进行,具体为每管20μl扩增反应体系,包括:0.15μM SSR引物、200μM dNTPs、1×PCR反应缓冲液(50mM KCl,10mM Tris-HCl pH8.3,1.5mM MgCl2,0.01%明胶)、50~100ng模板DNA,1U Taq酶;反应程序为:94℃DNA变性5min、循环(94℃1min,56℃1min,72℃1min)36次、72℃再延伸5min。扩增出的PCR产物用6%聚丙烯酰胺变性凝胶进行电泳,电压调至300V,室温下电泳约3小时。电泳完毕后,银染记录带型或凝胶成像。
表3.粒形QTL分析所用的引物及其序列
实施例2:水稻粒型基因LGY3的精细定位和图位克隆
本发明人利用RIL186和籼稻品种RD23(云南农科院陶大云研究员提供)杂交,并连续多代回交(RD23作为受体亲本)构建了BC3F2群体。在此基础上,利用图位克隆技术克隆了候选基因LGY3,图位克隆所用的多态性标记引物序列如表4所示,多态性标记的检测方法如实施例1所述。
表4.图位克隆所用的引物及其序列
实施例3:NIL-LGY3和NIL-lgy3近等基因系构建
本发明人在实施例2中所阐述的BC3F2群体中选择含有qlgy3且长粒的单株继续与RD23回交至BC4F2,根据籽粒变长的表型选择单株,利用分子标记对目标区段进行跟踪检测,并对目标性状以外的区段进行背景扫描,最终获得与RD23(RD23-LGY3-gs3)遗传背景十分接近的近等基因系RD23-lgy3-gs3材料用于后续的研究。另外,利用实施例1中所阐述的长粒重组自交系RIL186与WYJ7连续回交4次,从而获得与WYJ7(WYJ7-LGY3-dep1-1)遗传背景接近的WYJ7-lgy3-dep1-1材料用于后续研究。分子标记检测方法同实施例1所述。此外,利用实施例1中所阐述的长粒重组自交系RIL186与HJX74连续回交4次,从而获得与HJX74(HJX74-LGY3)遗传背景接近的WYJ7-lgy3材料用于后续研究。分子标记检测方法同实施例1所述。
实施例4:优异等位基因lgy3能增加粒长和产量
本发明人在安徽合肥试验基地和海南省陵水县实验基地试验田播种近等基因系RD23-LGY3和RD23-lgy3(近等基因系的构建详见实施例3)。待植株成熟后,分别取单株考察粒长,千粒重等产量性状。结果显示,携带优异等位基因的近等基因系材料RD23-lgy3,其粒长、千粒重和单株产量显著增加(图2)。此外,RD23-lgy3稻米的长宽比和垩白度等外观品质显著改善(图6,表5),这表明,优异等位基因lgy3可以改善粒型和外观品质,同时显著增加粒重和提高产量。
表5显示优异等位基因lgy3对稻米外观和蒸煮品质的影响。
表5.稻米品质测试数据
实施例5:优异等位基因lgy3和dep1-1聚合能增加粒长和产量
本发明人在安徽合肥试验基地和海南省陵水县实验基地试验田播种高产水稻WYJ7背景下的近等基因系WYJ7-LGY3-dep1-1和WYJ7-lgy3-dep1-1(近等基因系的构建详见实施例3),在水稻植株成熟后,分别统计株高(plant height),抽穗期(Heading time),分蘖数(the number of tillers per plant),每穗粒数(the number of grains perpanicle),粒长(grain length),粒宽(grain length),千粒重(1,000-grain weight)和单株产量(grain yield per plant)等性状(图3)。结果显示,与WYJ7-LGY3-dep1-1相比,WYJ7-lgy3-dep1-1的每穗粒数虽略有降低,但是粒长、千粒重和单株产量都显著增加(图3)。此外,WYJ7-lgy3-dep1-1稻米的长宽比和垩白度等外观品质显著改善(图6,表5),这表明,优异等位基因lgy3与dep1-1基因聚合之后,可以改善粒型和外观品质,同时显著增加粒重和提高产量。
具体的统计方法:株高和分蘖数的统计:在水稻成熟后,分别在田间取30株进行测量株高和统计分蘖数。穗粒数的统计:在水稻成熟后,分别在田间取30株主分蘖上的穗,分别统计每个穗上的穗粒数直接计数并记录。单株产量的统计:在水稻完全成熟后,取小区内40个单株进行脱粒,收获的种子经过37℃恒温干燥后称重得到单株产量数据,需要进行3次重复试验。粒长、粒宽和千粒重的测量:籽粒自然干燥后,浮水冲去秕粒,37℃恒温干燥后,在室温条件下存放3个月及以上,保证籽粒的充分干燥和各株系间含水量的相对一致。从每个株系中随机选取形态正常的种子,以游标卡尺测量其粒宽、粒长,作为粒形的考查指标。籽粒千粒重根据随机选取的1000粒饱满籽粒进行估算,于电子天平上进行称量其总重,取20次的平均值即为千粒重。试验结果允许差:千粒重20g以下的不超过0.4g,千粒重20.1~50g的不超过0.7g,千粒重50.1g以上的不超过1.0g。
实施例6:lgy3与gs3聚合育种的应用
本发明人通过杂交的方法将lgy3和gs3导入高产籼稻品种华粳籼74(华南农业大学张桂权教授提供)中,获得近等基因系HJX74-GS3-LGY3、HJX74-GS3-lgy3、HJX74-gs3-LGY3和HJX74-gs3-lgy3。2013年1月在海南省陵水县实验基地试验田播种HJX74-GS3-LGY3、HJX74-GS3-lgy3、HJX74-gs3-LGY3和HJX74-gs3-lgy3待植株成熟后,分别取单株考察粒长,单株产量等产量性状,测量及分析方法同实施例4所示。结果显示,聚合两个优异等位基因的材料HJX74-gs3-lgy3,其粒长和单株产量都有不同程度增加(图4)。同时,NIL-gs3-lgy3的稻米外观品质也显著提升。这表明在育种实践中,可以通过将lgy3与gs3聚合来增加粒长、提高产量和改善外观品质。
实施例7:优异等位基因lgy3在杂交水稻育种中的应用
两优培九是以低温敏两用核不育系培矮64S(PA64S)与恢复系9311杂交配组而成的杂交水稻F1组合。本发明人利用RD23-lgy3-gs3与9311恢复系(9311-LGY3-gs3,中国水稻研究所钱前研究员提供)杂交并连续回交多代,获得近等基因系9311-lgy3-gs3,,其粒长比9311(9311-LGY3-gs3)明显增加。2014年1月在海南省陵水县实验基地试验田播种9311-LGY3-gs3,9311-lgy3-gs3,以及不育系材料PA64S(中国水稻研究所钱前研究员提供),我们配制了两个杂交组合PA64S/9311-LGY3-gs3,和PA64S/9311-lgy3-gs3,。收获杂交种后于2014年6月播种在中科院合肥物质科学院技术生物所南岗基地,待F1植株成熟后,收获40个单株的种子,并测量粒长、粒宽和统计单株产量。结果表明PA64S/9311-lgy3-gs3,杂交组合的F1种子的籽粒长和单株产量都比PA64S/9311-LGY3-gs3,杂交组合明显增加(图5)。同时,PA64S/9311-lgy3-gs3,杂交种的稻米外观品质(更优选的,指垩白粒率)显著提升(图6,表5)。这表明,优异等位基因lgy3可以应用到杂交稻育种中增加粒长、提高产量和改善品质。
实施例8:控制粒形LGY3基因的优异等位变异的分子标记设计与应用
根据LGY3基因在WYJ7和L204品种间存在的核苷酸序列差异,本发明人在LGY3的基因组DNA序列上设计了功能分子标记(SEQ ID NOs:7,8和SEQ ID NOs:9,10),利用Taq酶进行PCR扩增,扩增产物用BamHI酶切,根据片段大小来判定所检测的水稻品种是否携带lgy3基因,该分子标记可用于分子标记辅助选择育种。例如,用Taq酶PCR扩增籽粒长的9311-lgy3-gs3材料和籽粒短的9311-LGY3-gs3材料的基因组DNA,PCR产物用BamHI酶切后用4%琼脂糖电泳可检测到由于碱基不同造成的差异,并由此判定水稻品种所携带的等位变异类型。在本实施例中,WYJ7基因组DNA用引物1(SEQ ID NOs:7,8)扩增产物可以被BamHI酶切;L-204基因组DNA用引物2(SEQ ID NOs:9,10)扩增产物不能被BamHI酶切。这可以作为特异性分子标记鉴定控制粒长基因LGY3的优异等位变异类型。在品种选育过程中,携带LGY3短粒品种与携带lgy3长粒品种的杂交后代群体中,可用该标记快速筛选短出携带长粒基因lgy3的后代材料。
实施例9:LGY3水稻转基因实验及转基因材料粒型分析
本实施例利用RD23-LGY3-gs3和RD23-lgy3-gs3(实施例3构建)幼穗为材料,提取RNA并反转录扩增获得LGY3和lgy3基因全长cDNA。
(1)自身启动子驱动LGY3和lgy3表达载体的构建与转化
根据LGY3的启动子序列以及LGY3和lgy3基因的cDNA序列,设计如下引物:
LGY3-pro-EcoRI:5’-CGGAATTCGTAGGCCAAGAACCTGACAATTC-3’
LGY3-pro-XmaI:5’-ATACCCGGGCTTCTTCCTCCTCCTCTCCTC-3’
LGY3-CDS-XmaI:5’-ATACCCGGGATGGGGAGGGGGAAGGTGGAG-3’
LGY3-CDS-SalI:5’-CCAGTCGACTCATATCCAGCCGGATGGGAT-3’
lgy3-CDS-XmaI:5’-ATACCCGGGATGGGGAGGGGGAAGGTGGAG-3’
lgy3-CDS-SalI:5’-CCAGTCGACTCATATCCAGCCGGATGGGAT-3’
以RD23-LGY3-gs3和RD23-lgy3-gs3的cDNA为模板,用引物LGY3-CDS-XmaI和LGY3-CDS-SalI,lgy3-CDS-XmaI和lgy3-CDS-SalI扩增得到LGY3和lgy3的CDS序列,将扩增产物用XmaI和SalI双酶切回收,连到经XmaI和SalI双酶切的质粒pCAMBIA2300载体(购自澳大利亚CAMBIA公司)中,构成p35S::LGY3和p35S::lgy3。以WYJ7的基因组为模板,用LGY3-pro-EcoRI和LGY3-pro-XmaI扩增得到LGY3的1.9kb启动子序列。将扩增产物用EcoRI和XmaI酶切,连入用EcoRI和XmaI酶切的p35S::LGY3和p35S::lgy3载体,构成pLGY3::LGY3和pLGY3::lgy3载体。采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到日本晴(中国水稻研究所钱前研究员提供)中。结果表明,pLGY3::lgy3转基因阳性植株的种子较日本晴(NPB)长。而pLGY3::LGY3转基因阳性植株的粒长与日本晴相比,没有明显变化(图7a)。
(2)35S启动子驱动LGY3和lgy3表达载体的构建与转化
根据LGY3和lgy3基因的cDNA序列,设计引物:
LGY3-OE-XmaI:5’-ATACCCGGGATGGGGAGGGGGAAGGTGGAG-3’
LGY3-OE-SalI:5’-CCAGTCGACTCATATCCAGCCGGATGGGAT-3’
lgy3-OE-XmaI:5-ATACCCGGGATGGGGAGGGGGAAGGTGGAG-3’
lgy3-OE-SalI:5-CCAGTCGACTCATATCCAGCCGGATGGGAT-3’
以RD23-LGY3-gs3和RD23-lgy3-gs3的cDNA为模板,用引物LGY3-CDS-XmaI和LGY3-CDS-SalI,lgy3-CDS-XmaI和lgy3-CDS-SalI扩增得到LGY3和lgy3的CDS序列,将扩增产物用XmaI和SalI双酶切回收,连到经XmaI和SalI双酶切的质粒pCAMBIA2300-ACTIN载体(实验室自己改造),构建成过量表达载体pACTIN::LGY3和pACTIN::lgy3。采用农杆菌介导的转化法将该载体导入到日本晴中。转基因阳性植株中,过表达LGY3之后会使粒形变短并产生复颖,而过表达lgy3之后的粒形较日本晴对照籽粒显著增加,大量过表达会使粒形变短,并产生复颖等异常发育表型(图7b)。
以上实施例表明,可以通过适当调节LGY3或lgy3基因的表达来改变粒长表型,进而影响水稻粒重和产量。
实施例10:LGY3和lgy3的互作蛋白鉴定
以实施例9中所获取的LGY3全长cDNA和lgy3全长cDNA,通过KpnI和BamHI重组到pCAMBIA1300-35S-CluC-RBS载体(中国科学院遗传与发育生物学研究所周俭民研究员提供,参见Chen H,Zou Y,Shang Y,Lin H,Wang Y,Cai R,Tang X,Zhou JM(2008)Fireflyluciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions inpl ants.Plant Physiol.146(2):368-76)上构建成cLUC-LGY3和cLUC-lgy3。从NIL-DEP1和NIL-dep1中扩增DEP1和dep1全长ORF,通过KpnI和SalI重组到pCAMBIA1300-35S-HA-Nluc-RBS上构建成nLUC-DEP1和nLUC-dep1。根据GS3基因的cDNA序列,设计引物:
GS3-CDS-KpnI:GGGGTACCATGGCAATGGCGGCGGCGCC
GS3-CDS-SalI:GCGTCGACCAAGCAGGGGGGGCAGCAAC
从WYJ7中扩增GS3的全长cDNA,通过KpnI和SalI重组到pCAMBIAl300-nLUC上构成nLUC-GS3。通过BiFC方法分析LGY3和lgy3与DEP1和GS3的蛋白互作情况。实验证实,无论是LGY3还是lgy3蛋白都可以与DEP1或GS3蛋白发生互作(图8a,b)。这表明LGY3能够通过与G蛋白γ亚基互作共同参与调控粒型。
本实施例采用的BiFC方法简述如下:将构建的nLUC-DEP1,nLUC-dep1,nLUC-GS3,cLUC-LGY3,cLUC-lgy3以及p19质粒转化农杆菌,挑取单克隆摇菌,然后用重悬缓冲液(150μM乙酰丁香酮,10mM MgCl2,10mM MES-KOH pH 5.7)悬浮,调nLUC和cLUC载体的菌液的OD600=1.0,p19的OD600=0.5。静置3h后,将nLUC,cLUC和p19按照5∶5∶2比例混匀,用1mL注射器在生长了3周的烟草下表皮下注射。注射2~3d后,在烟草表面喷洒LUC底物,检测LUC表达情况并拍照保存。
实施例11:LGY3和lgy3蛋白的转录激活活性鉴定
将实施例9中所获取的LGY3全长cDNA和lgy3全长cDNA,通过BamHI和KpnI重组到效应基因载体(中国科学院遗传与发育生物学研究所陈受宜研究员提供,参见Yu-Jun HaoYJ,Wei W,Song QX,Chen HW,Zhang YQ,Wang F,Zou HF,Lei G,Tian AG,Zhang WK,Ma B,Zhang JS and Chen SY(2011)Soybean NAC transcription factors promote abioticstress tolerance and lateral root formation in transgenic plants.PlantJournal.68,302-313)上分别构建成p35S-GAL4BD-LGY3和p35S-GAL4BD-lgy3。将实施例9中所获取的DEP1全长cDNA和dep1全长cDNA,通过BamHI和EcoRI重组到效应基因载体上分别构建成p35S-GAL4BD-DEP1和p35S-GAL4BD-dep1。将实施例9中所获取的GS3全长cDNA,通过BamHI和KpnI重组到效应基因载体上构建成p35S-GAL4BD-GS3。之前已有文献报道,OsARF9基因是直接受LGY3基因转录调控的,我们根据OsARF9基因的启动子序列设计引物:
proARF9-EcoRV:CGGATATCTGGAACGAATACCATACACC
proARF9-XbaI:CGTCTAGAGCCTCCTCCTCCTCCTCCTC
从WYJ7中扩增OsARF9基因将近2.3Kb的启动子序列,通过EcoRV和XbaI重组到报告基因载体上构建成proOsARF9-LUC载体。通过转录激活实验分析发现,LGY3蛋白对下游基因具有转录激活活性,并且DEP1或GS3的互作可以增强LGY3的转录活性,而lgy3蛋白(缺失C结构域)对下游基因不具有转录激活活性,因此即使加入DEP1或GS3蛋白也不可以增强lgy3的转录活性(图8c,d)。这表明G蛋白γ亚基通过与LGY3蛋白互作来改变后者的蛋白活性,进而参与对水稻粒型的调控,当LGY3蛋白的转录活性大大降低甚至消失时(比如lgy3蛋白由于羧基端负责转录活性的C结构域部分缺失进而导致失去转录活性),就会一定程度地抑制DEP1蛋白对其促进作用。由此推断,使用基因编辑技术创制一些可以导致编码蛋白缺失或部分缺失C结构域(其氨基酸序列如SEQ ID NO:5中的176-257位氨基酸)的LGY3等位变异基因,也会产生类似于lgy3的功能并应用于育种实践。
本实施例采用的转录激活实验方法简述如下:取水稻幼苗的胚芽鞘切成条状置于酶解液中,暗培养5-6小时后加入等体积的W5(154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl,2mMMES,pH5.7),200g低速离心5分钟,收集沉淀并用W5重悬清洗,反复清洗2次之后用MMg(0.4M甘露醇,15mM MgCl2,4mM MES pH 5.7)重悬。将proOsARF9-LUC、p35S-REN、p35S-GAL4BD-LGY3、p35S-GAL4BD-lgy3、p35S-GAL4BD-DEPl、p35S-GAL4BD-depl和p35S-GAL4BD-GS3精提的质粒按照REN∶LUC∶GAL4BD=1∶6∶6比例(质量比)加入水稻原生质体。用等体积的PEG进行转化,静置15分钟之后,加入2倍体积的W5终止反应并进行清洗,置于W5溶液中黑暗培养16小时。收集原生质体后加入裂解液,使用PROMEGA双荧光检测试剂盒对LUC/REN值进行测定。
本发明提及的所有文献均引用作为参考。在阅读本发明所阐述的上述内容之后,对本发明所作的各种改动或修改,均视同本发明的等价形式,均属于本发明所附的权利要求书的限定范围。
序列表
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因及其应用
<130> IB177404
<160> 15
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 8620
<212> DNA
<213> LGY3 gDNA序列
<400> 1
atacgatcag gtagccaaac cacaccacca taaagctagc ttgcaaaggg gatagagtag 60
tagagagaga gagagaggag aggaggagga agaagatggg gagggggaag gtggagctga 120
agcggatcga gaacaagatc agccggcagg tgacgttcgc caagcgcagg aacggcctgc 180
tcaagaaggc ctacgagctc tccctcctct gcgacgccga ggtcgccctc atcatcttct 240
ccggccgcgg ccgcctcttc gagttctcca gctcatcatg gtacgtatag caccaaacca 300
acgccgccgc cgccgccggc gtgcttgttc cggcgcagca gcgcatcatc atcgatcgat 360
ctaagtctaa taagataatc aattaaccct aactaaataa aatgataaga acagtatata 420
tggttatgat cagtgaaaca ctcgtcgatc tgagggaaaa tccggtcgag atcgagggag 480
tggggagaca aattgaactg caggctagct aatttaatcg tgtcgatcga tttctagctt 540
ttgttgatct ttatatatac gaacgcatgc actttcccct ttgttttttt ttcccttcga 600
tctgcttgga gctcatatgc tatagatctt ggggcatatg tatctgtcag ctttcgagag 660
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tctatttttt ttcttcaaga caagatcttg ctgtttcttc ccttgctatt tttcattcaa 960
agattcttct tttttttcta aaagaactat atatatatga atcgagtttc atcttcatcg 1020
atctgtctct ctccttttgt tttctgtaaa cacacacacg agcgtacgta tatatactct 1080
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ttgtggactc gtccaaattg aggcacggta gctggtgtca aaatgaacct gcaggcccag 1500
cccggttatg tatatgtata gctatatagc ttttcttgca agaggtatat acactttgta 1560
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agcacacaca tcaagtgatg tgtttttctt cagagcttca gacgtgtcat atcaagcagg 1920
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attgcggttt ttcctctttt tcctgtcttg ttctactcag agaattgaac ggtgaactgt 2100
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gcacaattgc taaatctggt atacatgtct tgctgactca catattcgtt cctcctaatt 2220
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cgtgcagtac caaattggaa aggtatccac ttgttcaaac ttaaaaatat tttttttact 3000
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acaaattact ccctccgtac tcataaagga agtcgtttag gacaatgttt aagtcaaacc 3900
ttgggaatat aaattatgaa taactctcaa gttgttgagt ttgaaaatgt aaaaaatata 3960
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tcggatcaat cttagacaca gtagccattt tacccactga tgcagcaacc caattaggta 4200
tctactaatt agcatcatag tgcaaatttg tacttttcaa gtggaaaata gaaattattt 4260
gtcctccttt actttaattt cttgataata tgatatatgt aacataattt ctctttgctc 4320
ccaagcatat aaaaaacttc aatttgatat gtccaaaaaa tgtcatatat atagcatgta 4380
atcctctgtg gcaaacacgt ttttttggct caaattaaga agaggaaaaa atggtatata 4440
tgtataaacc taacaaaaat gccccaacaa gaatagcttt attttgtgaa caaggtcata 4500
tagaccaggg aacaaaaacc ctgtactgtg cttctatttt gctatgcatt ttggataagt 4560
gattctacag aaatatgact atataggaga tattctcaaa tctgatcttt tctattaatt 4620
agcccatacg atatgaagac atatcttcct ctgttctgat tctatttgtt gtgctaagat 4680
agtctacagg atttgctagg ttgccacctg ccgtcaacaa aattcagctc atcagatttt 4740
gttatagttg ctagcacagt tatattatac gtatatctct tttgagaata tattattaca 4800
gtccattgat ttttcttgta gagtggaaaa tattattgtg ttttctaacc gtaggagttc 4860
atgtggtgtt atttattttg gataatgtgg tgtattttta tgagaaatca ggatcgcgtc 4920
aacatgaaag tttcatctaa tacattatta agtgcatcgt agcaacaatt catatattaa 4980
ctcaaaggta gctttgaaat taagatgcat gtcattaatg cataatagag aaatcaggtt 5040
accaaattat attaagccca tatattaact caaaggtcat agctttgaca aatgctcctt 5100
acagatttct ccttgaacca atttgtaaaa tatcctctcc tttttttttg cgcgaacgct 5160
aaatatcctt tgtttaacaa cctcgtcaat ttgtccattt catatgtgtg aacatccttg 5220
tacattcttt tttgtgccgt ttgaaataaa actttgaata aatatgcaca acttaaatgc 5280
ttaaatgtca attggatttg gatgaaacaa aaccaaagtt ttagaattta cgatctatca 5340
ttatgaattt atgtatgata tatcacactc tttctgaata aacttcagaa taatataaat 5400
tgcttaatta tggtatacat gagcatatat agcttgcgca aatcaaaact gtacagtagg 5460
tgtgtgttca attcagaata gtattctatt tcgaatttaa attaataata ccttctgtag 5520
taatttctat attagaaaat ttatacatac aaggagcact gttaattagc tagctagctt 5580
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tttttattct tcatgcctaa ttaatttgat tcaccattaa ttaattctac gtacaatgtt 5700
cgaatgtgtg actatatatg ctgcatctgc agttctgcac ctcattcagt actaaattca 5760
agttcaggtt cattaattaa ttcacttatt ccttcatttt tcacttccag catgtacaaa 5820
accttggaga ggtaccgcag ctgcaactac aactcacagg atgcagcagc tccagaaaac 5880
gaagtaagca tcctcttagt ttcttaatta acaatctttg acaaatcaat tacttcttac 5940
tagcagaaca tatattatga tttatgagtc agttattcgc ttatagtatt ctctactcac 6000
taaaaaggat tatgttaccc ttttttttct tatgagatga agggtcgtgt tatctttgtt 6060
aattttttgg gacattgatg ttatccttaa tgtcgaatgc atatataggg ttttctctag 6120
cttcatgttt tgctctgata tgtgcagtga tgctcatgca agtgaaaatg agctgggctc 6180
ttaccgtgcg taggttaaca ggccggccca ttaatagcta acagtttaga tgggccgcaa 6240
tgctagatgc cgcgggggac gaaggcctta cattcaatgg gccgtagggc gagatacggc 6300
ccacgtcgga ggttgtgggc cgtagggcgc attgtgactt tgggccgaat atgcttactt 6360
aaattgggct tagaattgtg agaggtttct gttcggatcc gaagagattg atgccatgtt 6420
gtctatgtta acattcctca tgcataagta ggtttagctg atagtctaaa acaggagtga 6480
atttagtaga cttggtttgc aattagaatg ctacatggtt tcctgaatac tttgttgtgc 6540
ctacagtttg ttaaccatct tttttttccc cttcggccaa tatggtctga tatcttgtag 6600
cttcaggagt catgagctaa tccgtgtgtc tgcaattttg ttgtttaaac cagattaatt 6660
accaagaata cctgaagctg aaaacaagag ttgaatttct tcaaaccaca cagaggtagt 6720
cttcagagat gaatgtggcc aatcatttca gcttcttatc tactacagag ttgctatgtt 6780
cttcctgagg gacagagttt ctatgactta ctagcaagca cttcacacca tgcagaaata 6840
ttcttggtga ggatttgggc ccactaagca tgaaggagct ggagcagctt gagaaccaga 6900
tagaagtatc cctcaaacaa atcaggtcaa gaaaggtaaa aatgtttgtt cgccatgtta 6960
cctatgcaag caaatggcac tttttgatat gctcttctta aacactgaac ctagattaga 7020
ttaataatga gcttattata attttttact gcaactatca tgtaattcgg tacttattac 7080
ccctcaactg tatggatttg tttatgtgca tggcttttaa cacaggctca atatttctgc 7140
agaaccaagc actgcttgat cagctgtttg atctgaagag caaggtactg aataaattct 7200
ggttcttttc ttttttcctc tgcacctaaa ttaaatctgt gcacatatga caaacactaa 7260
aattgattct gcaggagcaa cagctgcaag atctcaacaa agacttgagg aaaaaggtaa 7320
cacagccatc gatcaccctg aaagtcattg cgtgcatcag tattcggaca acatacatct 7380
ttttccttgc taaagtccca accatgatct tttcatggct gctaaaatgt ttcacgaaag 7440
ttacagtatt tgcacggaat aaaccttttt ccccggtacg gcttaaaagt taatcagctt 7500
ctcataccgc tgaagcgttt gtttgttcgt gcagttacag gaaaccagtg cagagaatgt 7560
gctccatatg tcctggcaag atggtggtgg gcacagcggt tctagcactg ttcttgctga 7620
tcagcctcat caccatcagg gtcttctcca ccctcaccca gatcagggtg accattccct 7680
gcagattggg tattcttctt ttcttccagt tacagttaat ttcttgcctg aaaaaattcc 7740
caaaatgcag aggtcatgtt ctttttaaac tattcactaa attattaaac agagtatttg 7800
ctcaagttcg aacaatacac tttcttaaaa gatggtttgc tatgtattac ttagaccact 7860
tatctcgatt tacttgtata ttttattttt tttcaaatat ttaatttata actatataat 7920
cgagtatatc gataatcctg acaataattc gcccaataat ctagatcaaa ttgggcctaa 7980
ttttgtcttt gttattcagt aatttaaaat ttatgtatat atactccatc gttttcatag 8040
ctttaattta atttttcctt ggtgaaggta tcatcaccct catgctcacc atcaccaggc 8100
ctacatggac catctgagca atgaagcagc agacatggtt gctcatcacc ccaatgaaca 8160
catcccatcc ggctggatat gatgtgtgtg ttcagttcag gcttcaggct tcagagaagc 8220
caatgcaaac agtgtcctgt aatccagtaa ttacagggca tatgtaatgt aatgtaatgt 8280
aatccctgat ctatattttg ctaagtacgt gcgtgctctc ttacgacctt ctcccccaaa 8340
cagttaatca ggggaataat aatttcgttt gatgcacgta ctgtatgtct gtatctgtca 8400
ctgtatcgta ggaccgtcca tgtataacaa tttccgtttt ggatgtggta acaagttaat 8460
tggcacttaa atttatattt gtgatgatct gggagagtac ctaatctcaa aaacttgtgg 8520
agattatgtt agggagtagt gcaagaaatg ttttaagacg gcagctgtta tctcatgaga 8580
tattgataat gatgttgtct ctgctgctgt cgcgatcgcc 8620
<210> 2
<211> 774
<212> DNA
<213> LGY3 cDNA序列
<400> 2
atggggaggg ggaaggtgga gctgaagcgg atcgagaaca agatcagccg gcaggtgacg 60
ttcgccaagc gcaggaacgg cctgctcaag aaggcctacg agctctccct cctctgcgac 120
gccgaggtcg ccctcatcat cttctccggc cgcggccgcc tcttcgagtt ctccagctca 180
tcatgcatgt acaaaacctt ggagaggtac cgcagctgca actacaactc acaggatgca 240
gcagctccag aaaacgaaat taattaccaa gaatacctga agctgaaaac aagagttgaa 300
tttcttcaaa ccacacagag aaatattctt ggtgaggatt tgggcccact aagcatgaag 360
gagctggagc agcttgagaa ccagatagaa gtatccctca aacaaatcag gtcaagaaag 420
aaccaagcac tgcttgatca gctgtttgat ctgaagagca aggagcaaca gctgcaagat 480
ctcaacaaag acttgaggaa aaagttacag gaaaccagtg cagagaatgt gctccatatg 540
tcctggcaag atggtggtgg gcacagcggt tctagcactg ttcttgctga tcagcctcat 600
caccatcagg gtcttctcca ccctcaccca gatcagggtg accattccct gcagattggg 660
tatcatcacc ctcatgctca ccatcaccag gcctacatgg accatctgag caatgaagca 720
gcagacatgg ttgctcatca ccccaatgaa cacatcccat ccggctggat atga 774
<210> 3
<211> 8618
<212> DNA
<213> lgy3 gDNA序列
<400> 3
atacgatcag gtagccaaac cacaccacca taaagctagc ttgcaaaggg gatagagtag 60
tagagagaga gagagaggag aggaggagga agaagatggg gagggggaag gtggagctga 120
agcggatcga gaacaagatc agccggcagg tgacgttcgc caagcgcagg aacggcctgc 180
tcaagaaggc ctacgagctc tccctcctct gcgacgccga ggtcgccctc atcatcttct 240
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acgccgccgc cgccgccggc gtgcttgttc cggcgcagca gcgcatcatc atcgatcgat 360
ctaagtctaa taagataatc aattaaccct aactaaataa aatgataaga acagtatata 420
tggttatgat cagtgaaaca ctcgtcgatc tgagggaaaa tccggtcgag atcgagggag 480
tggggagaca aattgaactg caggctagct aatttaatcg tgtcgatcga tttctagctt 540
ttgttgatct ttatatatac gaacgcatgc actttcccct ttgttttttt ttcccttcga 600
tctgcttgga gctcatatgc tatagatctt ggggcatatg tatctgtcag ctttcgagag 660
cggctatgtc catcgatccc tctttttttt ctctttcttt ttgtagtatc agctgccatg 720
catatatcag atttcgtttt cgcgtgcttt tagtgcttca cttatctgtt cgccatatct 780
gatttcttct catcctttgc cgacgtcgtc tgagcagtct gacctccaag atctggcgaa 840
ataaacctca atcgttgcta tttcttgcct tgaatctgca taaacatgac aatagatcct 900
tctatttttt ttcttcaaga caagatcttg ctgtttcttc ccttgctatt tttcattcaa 960
agattcttct tttttttcta aaagaactat atatatatga atcgagtttc atcttcatcg 1020
atctgtctct ctccttttgt tttctgtaaa cacacacacg agcgtacgta tatatactct 1080
catctctact tttatcaaaa agaaacacac atgttctagc ttcagatccc aaaataatca 1140
aacaggaaaa tatatataat atgcaattag ttcagatccc gaggtagatt tcttgattat 1200
ttccattttc caaagtgagg cgcgcgacaa ctcgacgcgg ttcctctttg cacacacaca 1260
cagtataact gtacgcaagg ggtaagaaca aaggagcaat cccttctggg ttgctgcttg 1320
cttctcccat ttttagctat ttcagaattt cactttctga gactcatctc tctctctcta 1380
ccagctgcat tatttcactt cccttttttc ccatttctgc ctattacacg gatggcctct 1440
ttgtggactc gtccaaattg aggcacggta gctggtgtca aaatgaacct gcaggcccag 1500
cccggttatg tatatgtata gctatatagc ttttcttgca agaggtatat acactttgta 1560
gttttagcca gtggtccagc tagccatgga tggatatatt atacacacgt atatatagta 1620
catgtatgta cgagtgttaa ttaaactcgt ttagttaatt tccaaagtcc ttttttatta 1680
ctacagctag cctgatctgt gttttagtgt gttactgttc cattagttac tgttctattg 1740
aagagagcgc gtacacgttg ttgttttatt tctctttttc cgatccggtg ttcctttttt 1800
ttttcttttg gtcatcttcc tcgagtcccg agcagtagaa atactactac tgccctgcaa 1860
agcacacaca tcaagtgatg tgtttttctt cagagcttca gacgtgtcat atcaagcagg 1920
tcagcacgca ttacatgcaa tataatactc ctatatggac acgcagaact cactttgatc 1980
atgtgtgacc aagctggatg agccgttaat ttgttgttgg gacagggtat tgaatcatta 2040
attgcggttt ttcctctttt tcctgtcttg ttctactcag agaattgaac ggtgaactgt 2100
ataggcagag ctagtcctgc atgcatcggt tttctgaaat tattaactat acacacacat 2160
gcacaattgc taaatctggt atacatgtct tgctgactca catattcgtt cctcctaatt 2220
aaagcactca tttatttatt ttacacggtt ttcaatgata tactttaaat attaatttgt 2280
ttgatgttat atttctatga atatgaaatt agcatcatat gaaaatactt taaaacaaat 2340
atagtgatat aacatgcata atacttagca tatacttgta tgattagcat ggtcattaat 2400
caaaagttgc cgagcttgaa ttttctaaag gacagggtgc cttgtaattt gggacaaaga 2460
accattggaa aacgaacaca aagaaacttt cattacatta attatctgaa aaagaaagaa 2520
actttcatta acctcgtaca gtaaatagaa aagaggaact atgcatgtat aacgaaatag 2580
ctaggatcac agcaattaat tagttgttct ctggctttac ttttcttttg gagtaacttt 2640
aatttttctt tggaggatga agtagttaat tatacaggtt tccaattctt gtttggtaga 2700
tcctttttta tgttcctgga agagctacta tatttttgta cttgagatgg agctgaggta 2760
ccgttatcta gctatgtcgc atctcaagga gttacgaatt aacatatatc accaatatca 2820
caaaaatgct ccatacaaaa agatcataaa aattcttgaa tttgcttgct gtgttttttt 2880
actatatatg cttggaatta aaaaaatgac tgaattaatc gtttgcaatc tttaacggtg 2940
cgtgcagtac caaattggaa aggtatccac ttgttcaaac ttaaaaatat tttttttact 3000
gatattactc tctaaaaagg tgcatgggaa atgctattgg aactactagt tttcgggaca 3060
ttataagaaa atgtatgcat atatatatat atatatggac ttatgatatg ggccagatac 3120
ctatatatat agaagatata tgtgtgctac tacctccatt caacaataca agcatttgag 3180
ccagttctgg tcaaggatat aaacatcctg cactattagc ttgtacttgt caaattaatg 3240
atctctaatt caaactttct tgctacttta cccccaatca cccttcccaa ccatcttaat 3300
ctttgctaaa cattctagaa atgcttattg ttggatggag gaagtagcta ttaactactc 3360
ctatagtttt tttaactacc tcatattaat tttgtaatcc taataaatgc actatatatg 3420
cccactttta ccgtgtttcc aaactggcat caagctaaaa tgaatgttaa tttagtttcc 3480
ccataatttt atgagaatcg caaaattgta cctattttaa acaaatcaaa gtcactgaac 3540
aaatgaacgg aggttaatta ttatattcac ctgatatagg cagactaggt tgggctaaga 3600
gggacattaa tttgggcatc taggttttga aatgggagat atggagagtg aaccaaaaaa 3660
aaactgttag tgaattagta catgatatat actagtatta ttagtgggaa cctagagaaa 3720
tgcaaagaat gttgcgcaaa tcatcatttt gtgtaaatta aaatgggata tacactatgg 3780
ggaactatag ctgagtgtca atccccacct tttgtttgta attaaacatg tgtttatgct 3840
acaaattact ccctccgtac tcataaagga agtcgtttag gacaatgttt aagtcaaacc 3900
ttgggaatat aaattatgaa taactctcaa gttgttgagt ttgaaaatgt aaaaaatata 3960
tgaatagatt tgtcttgaaa aatactttca taaaagtata catatatcac ttttcaataa 4020
atattttata gaaacaagaa gtcaaaattg tgttttggag accgtgtcac tgtccaaaac 4080
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tcggatcaat cttagacaca gtagccattt tacccactga tgcagcaacc caattaggta 4200
tctactaatt agcatcatag tgcaaatttg tacttttcaa gtggaaaata gaaattattt 4260
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ccaagcatat aaaaaacttc aatttgatat gtccaaaaaa tgtcatatat atagcatgta 4380
atcctctgtg gcaaacacgt ttttttggct caaattaaga agaggaaaaa atggtatata 4440
tgtataaacc taacaaaaat gccccaacaa gaatagcttt attttgtgaa caaggtcata 4500
tagaccaggg aacaaaaacc ctgtactgtg cttctatttt gctatgcatt ttggataagt 4560
gattctacag aaatatgact atataggaga tattctcaaa tctgatcttt tctattaatt 4620
agcccatacg atatgaagac atatcttcct ctgttctgat tctatttgtt gtgctaagat 4680
agtctacagg atttgctagg ttgccacctg ccgtcaacaa aattcagctc atcagatttt 4740
gttatagttg ctagcacagt tatattatac gtatatctct tttgagaata tattattaca 4800
gtccattgat ttttcttgta gagtggaaaa tattattgtg ttttctaacc gtaggagttc 4860
atgtggtgtt atttattttg gataatgtgg tgtattttta tgagaaatca ggatcgcgtc 4920
aacatgaaag tttcatctaa tacattatta agtgcatcgt agcaacaatt catatattaa 4980
ctcaaaggta gctttgaaat taagatgcat gtcattaatg cataatagag aaatcaggtt 5040
accaaattat attaagccca tatattaact caaaggtcat agctttgaca aatgctcctt 5100
acagatttct ccttgaacca atttgtaaaa tatcctctcc tttttttttg cgcgaacgct 5160
aaatatcctt tgtttaacaa cctcgtcaat ttgtccattt catatgtgtg aacatccttg 5220
tacattcttt tttgtgccgt ttgaaataaa actttgaata aatatgcaca acttaaatgc 5280
ttaaatgtca attggatttg gatgaaacaa aaccaaagtt ttagaattta cgatctatca 5340
ttatgaattt atgtatgata tatcacactc tttctgaata aacttcagaa taatataaat 5400
tgcttaatta tggtatacat gagcatatat agcttgcgca aatcaaaact gtacagtagg 5460
tgtgtgttca attcagaata gtattctatt tcgaatttaa attaataata ccttctgtag 5520
taatttctat attagaaaat ttatacatac aaggagcact gttaattagc tagctagctt 5580
tatgggttcc actaatcaat ttatatataa taatgtgcta aactatacag cgtccatgca 5640
tttttattct tcatgcctaa ttaatttgat tcaccattaa ttaattctac gtacaatgtt 5700
cgaatgtgtg actatatatg ctgcatctgc agttctgcac ctcattcagt actaaattca 5760
agttcaggtt cattaattaa ttcacttatt ccttcatttt tcacttccag catgtacaaa 5820
accttggaga ggtaccgcag ctgcaactac aactcacagg atgcagcagc tccagaaaac 5880
gaagtaagca tcctcttagt ttcttaatta acaatctttg acaaatcaat tacttcttac 5940
tagcagaaca tatattatga tttatgagtc agttattcgc ttatagtatt ctctactcac 6000
taaaaaggat tatgttaccc ttttttttct tatgagatga agggtcgtgt tatctttgtt 6060
aattttttgg gacattgatg ttatccttaa tgtcgaatgc atatataggg ttttctctag 6120
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ccacgtcgga ggttgtgggc cgtagggcgc attgtgactt tgggccgaat atgcttactt 6360
aaattgggct tagaattgtg agaggtttct gttcggatcc gaagagattg atgccatgtt 6420
gtctatgtta acattcctca tgcataagta ggtttagctg atagtctaaa acaggagtga 6480
atttagtaga cttggtttgc aattagaatg ctacatggtt tcctgaatac tttgttgtgc 6540
ctacagtttg ttaaccatct tttttttccc cttcggccaa tatggtctga tatcttgtag 6600
cttcaggagt catgagctaa tccgtgtgtc tgcaattttg ttgtttaaac cagattaatt 6660
accaagaata cctgaagctg aaaacaagag ttgaatttct tcaaaccaca cagaggtagt 6720
cttcagagat gaatgtggcc aatcatttca gcttcttatc tactacagag ttgctatgtt 6780
cttcctgagg gacagagttt ctatgactta ctagcaagca cttcacacca tgcagaaata 6840
ttcttggtga ggatttgggc ccactaagca tgaaggagct ggagcagctt gagaaccaga 6900
tagaagtatc cctcaaacaa atcaggtcaa gaaaggtaaa aatgtttgtt cgccatgtta 6960
cctatgcaag caaatggcac tttttgatat gctcttctta aacactgaac ctagattaga 7020
ttaataatga gcttattata attttttact gcaactatca tgtaattcgg tacttattac 7080
ccctcaactg tatggatttg tttatgtgca tggcttttaa cacaggctca atatttctgc 7140
agaaccaagc actgcttgat cagctgtttg atctgaagag caaggtactg aataaattct 7200
ggttcttttc ttttttcctc tgcacctaaa ttaaatctgt gcacatatga caaacactaa 7260
aattgattct gcaggagcaa cagctgcaag atctcaacaa agacttgagg aaaaaggtaa 7320
cacagccatc gatcaccctg aaagtcattg cgtgcatcag tattcggaca acatacatct 7380
ttttccttgc taaagtccca accatgatct tttcatggct gctaaaatgt ttcacgaaag 7440
ttacagtatt tgcacggaat aaaccttttt ccccggtacg gcttaaaagt taatcagctt 7500
ctcataccgc tgaagcgttt gtttgttcgt gcagttacag gaaaccagtg cagagaatgt 7560
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tcagcctcat caccatcagg gtcttctcca ccctcaccca gatcagggtg accattccct 7680
gcagattggg tattcttctt ttcttccagt tacagttaat ttcttgcctg aaaaaattcc 7740
caaaatgcag aggtcatgtt ctttttaaac tattcactaa attattaaac agagtatttg 7800
ctcaagttcg aacaatacac tttcttaaaa gatggtttgc tatgtattac ttagaccact 7860
tatctcgatt tacttgtata ttttattttt tttcaaatat ttaatttata actatataat 7920
cgagtatatc gataatcctg acaataattc gcccaataat ctagatcaaa ttgggcctaa 7980
ttttgtcttt gttattcagt aatttaaaat ttatgtatat atactccatc gttttcatag 8040
ctttaattta attttatgta tatatacttc atcaccctca tgctcaccat caccaggcct 8100
acatggacca tctgagcaat gaagcagcag acatggttgc tcatcacccc aatgaacaca 8160
tcccatccgg ctggatatga tgtgtgtgtt cagttcaggc ttcaggcttc agagaagcca 8220
atgcaaacag tgtcctgtaa tccagtaatt acagggcata tgtaatgtaa tgtaatgtaa 8280
tccctgatct atattttgct aagtacgtgc gtgctctctt acgaccttct cccccaaaca 8340
gttaatcagg ggaataataa tttcgtttga tgcacgtact gtatgtctgt atctgtcact 8400
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attatgttag ggagtagtgc aagaaatgtt ttaagacggc agctgttatc tcatgagata 8580
ttgataatga tgttgtctct gctgctgtcg cgatcgcc 8618
<210> 4
<211> 678
<212> DNA
<213> lgy3 cDNA序列
<400> 4
atggggaggg ggaaggtgga gctgaagcgg atcgagaaca agatcagccg gcaggtgacg 60
ttcgccaagc gcaggaacgg cctgctcaag aaggcctacg agctctccct cctctgcgac 120
gccgaggtcg ccctcatcat cttctccggc cgcggccgcc tcttcgagtt ctccagctca 180
tcatgcatgt acaaaacctt ggagaggtac cgcagctgca actacaactc acaggatgca 240
gcagctccag aaaacgaaat taattaccaa gaatacctga agctgaaaac aagagttgaa 300
tttcttcaaa ccacacagag aaatattctt ggtgaggatt tgggcccact aagcatgaag 360
gagctggagc agcttgagaa ccagatagaa gtatccctca aacaaatcag gtcaagaaag 420
aaccaagcac tgcttgatca gctgtttgat ctgaagagca aggagcaaca gctgcaagat 480
ctcaacaaag acttgaggaa aaagttacag gaaaccagtg cagagaatgt gctccatatg 540
tcctggcaag atggtggtgg gcacagcggt tctagcactg ttcttgctga tcagcctcat 600
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<210> 5
<211> 257
<212> PRT
<213> LGY3蛋白序列
<400> 5
Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Ser
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Tyr Glu Leu Ser Leu Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe
35 40 45
Ser Gly Arg Gly Arg Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser Ser Cys Met Tyr
50 55 60
Lys Thr Leu Glu Arg Tyr Arg Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Gln Asp Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Glu Asn Glu Ile Asn Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys Leu Lys
85 90 95
Thr Arg Val Glu Phe Leu Gln Thr Thr Gln Arg Asn Ile Leu Gly Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Pro Leu Ser Met Lys Glu Leu Glu Gln Leu Glu Asn Gln
115 120 125
Ile Glu Val Ser Leu Lys Gln Ile Arg Ser Arg Lys Asn Gln Ala Leu
130 135 140
Leu Asp Gln Leu Phe Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Gln Leu Gln Asp
145 150 155 160
Leu Asn Lys Asp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Thr Ser Ala Glu Asn
165 170 175
Val Leu His Met Ser Trp Gln Asp Gly Gly Gly His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Thr Val Leu Ala Asp Gln Pro His His His Gln Gly Leu Leu His Pro
195 200 205
His Pro Asp Gln Gly Asp His Ser Leu Gln Ile Gly Tyr His His Pro
210 215 220
His Ala His His His Gln Ala Tyr Met Asp His Leu Ser Asn Glu Ala
225 230 235 240
Ala Asp Met Val Ala His His Pro Asn Glu His Ile Pro Ser Gly Trp
245 250 255
Ile
<210> 6
<211> 225
<212> PRT
<213> lgy3蛋白序列
<400> 6
Met Gly Arg Gly Lys Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Ser
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
20 25 30
Tyr Glu Leu Ser Leu Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe
35 40 45
Ser Gly Arg Gly Arg Leu Phe Glu Phe Ser Ser Ser Ser Cys Met Tyr
50 55 60
Lys Thr Leu Glu Arg Tyr Arg Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Gln Asp Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Glu Asn Glu Ile Asn Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys Leu Lys
85 90 95
Thr Arg Val Glu Phe Leu Gln Thr Thr Gln Arg Asn Ile Leu Gly Glu
100 105 110
Asp Leu Gly Pro Leu Ser Met Lys Glu Leu Glu Gln Leu Glu Asn Gln
115 120 125
Ile Glu Val Ser Leu Lys Gln Ile Arg Ser Arg Lys Asn Gln Ala Leu
130 135 140
Leu Asp Gln Leu Phe Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Gln Leu Gln Asp
145 150 155 160
Leu Asn Lys Asp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Glu Thr Ser Ala Glu Asn
165 170 175
Val Leu His Met Ser Trp Gln Asp Gly Gly Gly His Ser Gly Ser Ser
180 185 190
Thr Val Leu Ala Asp Gln Pro His His His Gln Gly Leu Leu His Pro
195 200 205
His Pro Asp Gln Gly Asp His Ser Leu Gln Ile Gly Pro Thr Trp Thr
210 215 220
Ile
225
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> LGY3基因的dCAPs标记引物F
<400> 7
catagcttta atttaatttt ggatccttgg tgaaggta 38
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> LGY3基因的dCAPs标记引物R
<400> 8
cgtaagagag cacgcacgta 20
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> lgy3基因的dCAPs标记引物F
<400> 9
catagcttta atttaatttt atgtatatat acttca 36
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> lgy3基因的dCAPs标记引物R
<400> 10
cgtaagagag cacgcacgta 20
<210> 11
<211> 6762
<212> DNA
<213> 来自9311的gs3的gDNA 序列
<400> 11
atcgtggtaa agaaagaaaa aaggtgaagg acgaggggca tgatacatat gggaaagctg 60
tagactttga cccttgacta ctcgttggaa gtgtgcgtct gcatgcatta ttgaacggct 120
ctgatccccg cggcgcagcg gatcggggtc atgtccggat gggcatatcg acgagaagga 180
tccgtccccg acaatctttc aagccccgtg cccccgtccc tcctctcctc tgcgcctttc 240
catcatcatt tacgcccaac cccaacacat gtacatttcc cttggcttgc ttccggagaa 300
gaaaagagcg gccatccact ccactctcca ctctctccct tccatcatta cttgcccaaa 360
aacggcaatc ccctcccctc catctccatg tgctcttcca cctagctccg ccattcaaag 420
caaagcacca agcttttgcc tctccctcta ccatgcctgc cccctataca tagctgctgc 480
accgtctctc ttcataaata tactagtagg agtagcagag ctcatcactt agatcatctc 540
cattatcgga acttcggagt gacatggcaa tggcggcggc gccccggccc aagtcgccgc 600
cggcgccgcc cgacccatgc ggccgccacc gcctccagct cgccgtcgac gcgctccacc 660
gcgagatcgg attcctcgag gtactgtcta tatcactacc attcatactc cttcgatctt 720
gcttcaaaac aaaaaaagat atatttccta cttcatattc atatacacac gtacggcttg 780
ctatctgtcg aattgtttgc ttctgcatgc atgcatcact ctcattgtaa gttttcccca 840
gcttaaaacc actcctttta tcttcgttct tcttccttct tgtttttttt ttaaaaaaaa 900
aacaacaact catttgatct tcatatagtg tatcatgcat catttgcttc tttgatcagt 960
tccccaaaaa ctgctcctct cttctcagcc aaataattaa acttaagcaa acgagcaagt 1020
tgaactgatg atccaataaa acaaaacaaa accgatcgaa taggaagtca atggcatata 1080
ccagctgcta tagctgaagc cacgaacgct tagcttagct ctagtcgatc cctgttgact 1140
gttcaacaca ctgcactaac acaccagtta atgagctgat taattaaacc attaaatgag 1200
cttaacgggc ggctagcttc ttcctctggg cccgtgccga tcgtaccatc ggtttgcgcg 1260
tccctccacc taaactctct gccttgttat tcccttttcc tagtactaca tgcatttgca 1320
tcatcatccc atcaccaata gtactacgtt tcaactggat tttggtggtg tccaaccata 1380
tcatatttgg ttttgttctc tagtttactc ctacattagt ctctagcggt tttgtggagt 1440
actaaagaaa acaactaatc agccagggtt taacgtttaa tcggttggtg gttttgttaa 1500
ttaatttcag ctactatttt agacttcaca ggtcttcgag ctataagcat cgattgccat 1560
gcatcaatcg atgctggtcc acgctagttt ctgagttctg actagctctc ttaattgtgc 1620
tttgacctac tttaattaat taaccagtgg ctgcgtcact cattgaccaa cattgtcatg 1680
ttacccggac tgattttttt tctttaaaaa aacaccggat atattattag ttagtgtata 1740
tatatgtctg ctcaagcagc gcatgcatat agtttctcgt caaacaaaaa aatgtagtgt 1800
atgctcaaag catctgtttt ggaattgtca tattcgcctt tataattaaa ataatttaaa 1860
tggtgatgcc cagctttttt ttcctccaat aatttattta ttggcttgat ttcctgtgct 1920
attaggagta aaactactcc gttttaatta gcaccatttt taaagcttct aaaattaacc 1980
taagtaaagt acgacactgc aacctaactg tatatgttgt gtttgttcat tagcagtgac 2040
agtacttgct gtctagcttt aaatgttttg ggtgttaaaa tatccctcag acatcacctg 2100
aaaagttgac aggctaaaca catgcccatc tccctcgttt acttaaatta attcgaacaa 2160
acaactgtat atatatttct tgcagggtga aataaattca atcgaaggga tccacgctgc 2220
ctccagatgc tgaagagagt aagccagcct gctgtttctt tttgtactac ttccatttct 2280
tctcgtcttt actcttacca tgcattcaca aaatatactt acttacccca gtttttgatc 2340
atgaactttg accgttatct ttttaagcaa cttcaataaa ataggtttaa atgcaaatgt 2400
tatgtacacc attgattata aaaccttggc aaatgaaagt aaaaaaccag cacatttaat 2460
ttctgaacgt tgggagtatt attattttta tatcttttac tatcatttaa tcatagtatc 2520
gtgcaagctt tttgagtgta attaggttgc ttaaggtaaa aagatgtaac taggttacat 2580
ttagtactaa actgaacatt taattagtaa tgtttcgtta agtaactgta atttcaatgc 2640
atgcatgtcc tcccgtaaga gcaagtttaa tagtatagcc aactactagc tccaatttat 2700
ctatagccaa tttaatagct cattcataca ataattatat actacactat taatatctgg 2760
tccaacctgt catacaccta ctgcgtcttg gagtccgtgc tatagctgac tacaaatcta 2820
tagcccgctg ctcttctctc tccttattta tctccttaaa atatgtttgc agctggctga 2880
tagcctgcta ttgtacctgc tctaaaaaca gtgcagagac tgttcaaaaa gtcattgcac 2940
aataactatt cacatggaac tgtgaaaagt atatattgga acttagggcc tgtttggttt 3000
tcaagtccct gtcacatcgg atgtttagac actaatttag agtattaaac atacattaat 3060
tacaaaaccc attccataac cttggactaa ttcgcgagac gaatcttttg agtctaatta 3120
cgccatgatt ttgacaatgt gatgctacag taaacttttg ataattatgg attaattagg 3180
cttaaaaaat tcatctcgtg gattagctct catttataaa attagttttt ttactagtat 3240
atgtttaata ctccaaatta gcgtccaaac atccgatatg acatgggcta aaaaagtttt 3300
agctccatct aaacaccccc ttactagcta gatccttttg ggaacatggg aaaagccaag 3360
tcacgtgtgg aatccctatt ccctgtgttc ttcagctaga agagtgaaaa taatgtacta 3420
ctactatacg gagatgaaat tacagcagga gcagaaagcg ggaaaaaaaa ctttaaatca 3480
attaaacaag cctctctctg caaaattcaa caccagcaac gaacaactca tcaagttctt 3540
gtgttatgta ccggccggta actaattgtt gtttgcataa gcgaaacagt atatttgaaa 3600
aaaaataata atttatgaat aaaactttta tatacgtgtt cttagtcatc ttaaaacaaa 3660
ggttgaaaaa taaacttcga tgaaaaaaat ctcaaaatca attccaaatt tatggtgaaa 3720
attttaaatt ttgtctgata aacataagta taagaaaaaa gtaaagcaat gtcactatgt 3780
taatggtatt ggtatatata cctttgagtt tctgtctgta ctttaggagt acatgctacg 3840
aacatgtttt cttggcttct atttcgttgg aattacttgc gtattgtggg ccagacgcct 3900
ggtgaacttc gtcgattgtg tggactaatt aagctcacct gaaataagtg gttgaaaaca 3960
aggctaaaga tgattttaat catggatttt ggcttggaaa tttttttgta gggttgacga 4020
attcatcgga agaactcctg atccattcat aacgatgtat ggattttcag gtcgagaatt 4080
tgtctttaac ttcgcacgac tgttattttt tttcttatta attctctgtt tacaagcagt 4140
tcatcggaga agcgaagtca tgatcattct caccacttct tgaagaagtt tcggtactca 4200
cttcattccc ggatcttaat gtatatatgc atatctgcac tgtgctaatt ggtgtacaca 4260
ttatgtgatc atcagtccaa gttaattatt acttacaaaa ctgaactaat aaacactaga 4320
aaatatgtaa cttgcaaagt acatattgaa tcagggattc atatatagaa ctccacctgc 4380
agatttcttc caatatatat atgctgtcac catgttttca cttgtcacct agtacacctt 4440
tccttgatga tcgacgtggt catattcttc agattgattt agtttcagat agaaaaaaat 4500
attgtttact tagtttctct ccttcagtaa gagagatgtg caagaccagc gatcaaacta 4560
tatgaactgt tcgtttcatg ataaaaaaaa catgatatgg aataactagg tgattcaaca 4620
tataatggct gataatccct cgtttcagga gataccatca gttttctact tttctacttt 4680
tctccatgtt ctctttttca tgtttgaggt ggatcggagc ttgtgttaga tgtttgctca 4740
gctcaattat tgctgcagat ttccctatat agcctccact gtatatatac tctctccgat 4800
tccataattt aatgatattt tgaacaatga cgctgtctct aaaatatatc tttgacttta 4860
ttttcctatt ataatatata caataaaaaa atacatattt acttttctta taaatagttt 4920
caaagacaaa tctatatatg ttgttatata gctcttttaa actaaatatt tttaaagtta 4980
tagtcaaagt tacaaaagtt tgacctcaaa catgtacaaa acgtcgataa ttgtatatct 5040
aatcaaccaa taatttgtag tgcattgtct taaaaaaatt gcatttctag ctatgtatct 5100
agataattac aagaaccagg tgaaatcaca ttttattttt actggaccac gaactcattg 5160
tttaattact tccagccttg cactaaataa caataattga acctggcatc acctgcacaa 5220
ttaatttgga cacaaagtaa acatgaacgc aacatacttc gtttcatatt gtttgttggt 5280
gtaggattta aattttgtgt caaaatactt gccgttctta ctacattctt aagcactttg 5340
agaactaacc ttctcttcct acccttcatc aatacagtca tactaactaa ttggctctta 5400
tgccttgaaa aactaattag gatgtattta atgagggtaa ccatgtaatc tgccaccagt 5460
gaatgcaatt ttggttcaaa atttcgggcc cccgccctaa aaagtcatta tctcgataga 5520
atttttttga atttagtcaa aatttattca aatttagcca aattgtgtta aatttcaaat 5580
aatttcagtc taaaaagtgc tgaaaatccc gaaatttagg ttccaccgaa atggccggaa 5640
attttcagcg aaaatcaaac atgaaaacct tgtctgccac atttgttagt ttgtgtaaag 5700
atttgctaga acgataagta atttgaagcg gatgtatatt atatatccca caaaaccatc 5760
aacttgttaa ttacatgtat atttgtgcat gatgctttca ccactttgcc gttgttaacg 5820
attaaatcac acgttttatt ttctcacagc tgtttgtgca gagcaagtgc gtgctgcctc 5880
agctacctct cctggatctg ctgctgcagc agcgccgccg gcggctgctc atcctcctcc 5940
tcctccttca acctcaagag gccgagctgc tgctgcaact gcaactgcaa ctgctgctcc 6000
tcctcctcct cctcatgtgg ggcggcgtta acgaagagtc cgtgtcgctg ccgccgccgc 6060
agctgctgct gccgtcgctg ctgctgcggc ggcgtcggcg tccgcgcgtg cgcgagctgc 6120
agctgctccc cgccgtgcgc gtgctgcgcg ccgccgtgcg cgggatgctc gtgccgctgc 6180
acctgcccgt gcccgtgccc cggcggctgc tcctgcgcgt gcccggcgtg caggtgctgc 6240
tgcggcgtcc ctcgttgctg ccccccctgc ttgtgatcga tcgatcgatt gagcgaagct 6300
gcactgattg gttaattaat tagttctcga tgatgatcga tcgagctgcg cgcgtactta 6360
attagctagc taggttctgg tgttaattag ttcctcatcg atgcatatgt tgattgcctt 6420
gctctgcttg cggttatctg taatttggct ttgctgccat gatgagtacg tgattgctga 6480
tttattttac atatcctccg ctatatatat ctagctggta gtagctagtt ttgatctcac 6540
ttgcaaaact attcatttcc tgattttaac aaggtcaaat gacttggttg cctttggttc 6600
atactcctta gagcaagtat aaaggtttat atggaggaga gaggtaacaa aaaaaatcaa 6660
gagtgttggc tctcatgcga gagctagctt atcacaagct acaaatcaaa tatattaaat 6720
gtataaatga gagatagaga gaggaataaa attatagcta ac 6762
<210> 12
<211> 165
<212> DNA
<213> gs3的CDS序列
<400> 12
atggcaatgg cggcggcgcc ccggcccaag tcgccgccgg cgccgcccga cccatgcggc 60
cgccaccgcc tccagctcgc cgtcgacgcg ctccaccgcg agatcggatt cctcgagggt 120
gaaataaatt caatcgaagg gatccacgct gcctccagat gctga 165
<210> 13
<211> 54
<212> PRT
<213> gs3蛋白的序列
<400> 13
Met Ala Met Ala Ala Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro Pro Ala Pro Pro
1 5 10 15
Asp Pro Cys Gly Arg His Arg Leu Gln Leu Ala Val Asp Ala Leu His
20 25 30
Arg Glu Ile Gly Phe Leu Glu Gly Glu Ile Asn Ser Ile Glu Gly Ile
35 40 45
His Ala Ala Ser Arg Cys
50
<210> 14
<211> 588
<212> DNA
<213> 水稻dep1-1的cDNA序列
<400> 14
atgggggagg aggcggtggt gatggaggcg ccgaggccca agtcgccgcc gaggtacccg 60
gacctgtgcg gccggcggcg gatgcagctg gaggtgcaga tcctgagccg cgagatcacg 120
ttcctcaagg atgagcttca cttccttgaa ggagctcagc ccgtttctcg ttctggatgc 180
attaaagaga taaatgagtt tgttggtaca aaacatgacc cactaatacc aacaaagaga 240
aggaggcaca gatcttgccg tctttttcgg tggatcggat caaaattgtg tatctgcatt 300
tcatgtcttt gctactgttg caagtgctca cccaagtgca aaagaccaag gtgcctcaat 360
tgttcttgca gctcatgctg cgacgagcca tgctgtaagc caaactgcag tgcgtgctgc 420
gctgggtcat gctgtagtcc agactgctgc tcatgctgta aacctaactg cagttgctgc 480
aagacccctt cttgctgcaa accgaactgc tcgtgctcct gtccaagctg cagctcatgc 540
tgcgatacat cgtgctgcaa accgagctgc acctgcttca acatctag 588
<210> 15
<211> 195
<212> PRT
<213> 水稻dep1-1蛋白的氨基酸序列
<400> 15
Met Gly Glu Glu Ala Val Val Met Glu Ala Pro Arg Pro Lys Ser Pro
1 5 10 15
Pro Arg Tyr Pro Asp Leu Cys Gly Arg Arg Arg Met Gln Leu Glu Val
20 25 30
Gln Ile Leu Ser Arg Glu Ile Thr Phe Leu Lys Asp Glu Leu His Phe
35 40 45
Leu Glu Gly Ala Gln Pro Val Ser Arg Ser Gly Cys Ile Lys Glu Ile
50 55 60
Asn Glu Phe Val Gly Thr Lys His Asp Pro Leu Ile Pro Thr Lys Arg
65 70 75 80
Arg Arg His Arg Ser Cys Arg Leu Phe Arg Trp Ile Gly Ser Lys Leu
85 90 95
Cys Ile Cys Ile Ser Cys Leu Cys Tyr Cys Cys Lys Cys Ser Pro Lys
100 105 110
Cys Lys Arg Pro Arg Cys Leu Asn Cys Ser Cys Ser Ser Cys Cys Asp
115 120 125
Glu Pro Cys Cys Lys Pro Asn Cys Ser Ala Cys Cys Ala Gly Ser Cys
130 135 140
Cys Ser Pro Asp Cys Cys Ser Cys Cys Lys Pro Asn Cys Ser Cys Cys
145 150 155 160
Lys Thr Pro Ser Cys Cys Lys Pro Asn Cys Ser Cys Ser Cys Pro Ser
165 170 175
Cys Ser Ser Cys Cys Asp Thr Ser Cys Cys Lys Pro Ser Cys Thr Cys
180 185 190
Phe Asn Ile
195
Claims (10)
1.一种分离、克隆的控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观品质的基因LGY3,其编码SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的基因LGY3,其包含SEQ ID NOs:1-2中的任何一个所示的核苷酸序列。
3.权利要求1的基因的等位基因lgy3,其编码SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的等位基因lgy3,其包含SEQ ID NOs:3-4中的任何一个所示的核苷酸序列。
5.由权利要求1的基因LGY3或权利要求3的等位基因lgy3编码的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5或6所示。
6.一种重组构建体,其特征在于包含权利要求1或2所述的基因LGY3或包含权利要求3或4所述的等位基因lgy3的多核苷酸序列。
7.一种重组宿主细胞,其特征在于包含权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3的多核苷酸序列,或权利要求6的重组构建体,或它的基因组中整合有权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3的多核苷酸序列,其中所述细胞为微生物细胞,其中所述微生物细胞优选为大肠杆菌或农杆菌细胞。
8.一种培育产量提高、籽粒外观品质改良的水稻品种的方法,所述方法包括:利用包含权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3的重组农杆菌细胞转染水稻植株获得转基因水稻植株,或者将含有权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3或经基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻植株与另一水稻植株杂交获得后代水稻植株,其中所获得的水稻植株是粒形改变、长宽比增大、籽粒外观品质得到改良的水稻植株。
9.一种培育具有提高的粒长、粒重、产量和改良的籽粒外观品质的水稻品种的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻亲本与包含dep1-1和/或gs3基因的另一水稻亲本杂交,在后代中选育出LGY3-dep1-1、LGY3-gs3、lgy3-dep1-1或lgy3-gs3双基因聚合的或者LGY3-gs3-dep1-1或lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的品系或品种。
10.一种培育具有提高的粒长、产量和改良的籽粒外观品质的水稻杂交稻的分子标记辅助选择聚合育种方法,所述方法包括:使用包含权利要求1或2所述的基因LGY3或权利要求3或4所述的等位基因lgy3或基因编辑技术改造后的其他形式的等位基因的水稻恢复系或不育系与包含dep1-1和/或gs3基因的水稻不育系或恢复系杂交,选育出带有LGY3-dep1-1、LGY3-gs3、lgy3-dep1-1或lgy3-gs3双基因聚合的或者LGY3-gs3-dep1-1或lgy3-dep1-1-gs3三基因聚合的F1代的杂交水稻。
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