CN102634563A - 一种产乙偶姻菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产乙偶姻 - Google Patents

Abstract

本发明阐述了一种产乙偶姻菌株的筛选方法和用该菌株发酵法生产乙偶姻，属于生物工程技术领域。本发明菌株是将土样经过烘烤悬浮后稀释涂布，通过V-P实验进行定性分析筛选，并对筛选菌株进行生理生化及分子生物学鉴定，采用高效液相色谱法得到一株高产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌。本发明同时公开一种采用该菌株生产乙偶姻的方法，采用本方法发酵72h乙偶姻产量为35g/L。

Description

一种产乙偶姻菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产乙偶姻

技术领域

一种产乙偶姻菌株的筛选方法及应用该菌株生产乙偶姻，属于生物工程领域。

背景技术

3-羟基丁酮(3-hydroxybutanone)又名乙偶姻，具有令人愉快的香味，可作为一种食用香料广泛应用在食品生产中，如用于奶油、咖啡的香味增强剂及配制乳品、草莓型香精等，也可作为微生物合成重要化工原料和液体燃料的2，3-丁二醇及双乙酰的前体物质。此外，3-羟基丁酮还可作为一种平台化合物，广泛应用于其他众多行业，2004年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。因此，3-羟基丁酮作为一种重要的化学合成中间体和多功能材料，广泛应用于食品、制药、化工等领域。其生产方法有：化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法已实现工业化生产，该法操作简单易行，但污染重、成本高、原料受石油制约、产品质量难以达到食用香料的要求。微生物发酵法具有生产成本低廉、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙偶姻生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产乙偶姻。

本发明的技术方案：

1、一种产乙偶姻菌株的筛选方法：

从制酒作坊附近的土壤取土样，称取约5.0g，在80℃的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-6，取10^-4-10^-6稀释菌液涂布于富集培养基上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2mL，10000r/min离心10min，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。

2、根据权利要求1所述一种产乙偶姻菌株的筛选方法，其筛选得到产乙偶姻菌株的鉴定方法如下：

1)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐试验，硝酸盐还原试验；

2)16S rDNA分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用枯草芽孢杆菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18 T Vector，转化到大肠杆菌JM109中，利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。

阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Bacillus amyloliquifaciens，同源性达99％。

通过生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquifaciens FMME044。

3、本发明公开的一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用Bacillus amyloliquifaciens FMME044为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产乙偶姻；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始pH 7.0；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养10-12h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

发酵条件：接种量10％(v/v)，温度37℃、摇床转速200rpm条件下，发酵60-72h。

3)7L发酵罐发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，过程中不控制pH，培养时间32-48h。

4、乙偶姻产量的测定

取发酵液10000rpm离心10min，收集上清液，并以乙偶姻作为标准品，配制1、2、3、4、5g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0.45μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定乙偶姻的含量。

色谱条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H；

流动相：5mmol/L稀硫酸，用0.45μm滤膜过滤；

柱温：60℃；

检测波长：290nm；

进样量：20μL

流速：0.6ml/min。

标准曲线在1-5g/L之间呈现良好的线性关系(图1)，回归方程：y＝0.0027，R²＝0.9999。据此得到72h乙偶姻的产量为35g/L，如图1。

附图说明

图1乙偶姻标准曲线

图2色谱检测结果，A 5g/L乙偶姻标样，B 32h发酵液

具体实施方式

以下是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens FMME044)筛选、鉴定及发酵生产乙偶姻的实施例。

实施例1

从制酒作坊附近地表取土样，称取约5.0g，在80℃的烘箱中烘烤48h，加入到200mL的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-6，取10^-4-10^-6稀释菌液涂布于富集培养基上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2mL，10000r/min离心10min，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。

实施例2

对筛选的FMME044菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见表1)，并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组DNA，以P1和P2为正向和反向引物：

P1：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3′，

P2：5′-CGACTTCACCCCAATCATCTG-3′。

用PCR扩增16S rDNA基因，委托华大基因研究中心进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索工具进行同源性比对分析。基于16SrDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillus amyloliquifaciens FMME044。

菌株FMME044部分16S rDNA序列：

1   gccaagagca tgacggcaag tggacgattc gacttcaccc caatcatctg tcccaccttc

61  ggcggctggc tccaaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt

121 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta

181 ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt

241 tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg

301  tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg

361  tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg

421  ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc

481  tgtcactctg cccccgaagg ggacgtccta tctctaggat tgtcagagga tgtcaagacc

541  tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc

601  ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc

661  gttagctgca gcactaaggg gcggaaaccc cctaacactt agcactcatc gtttacggcg

721  tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtt

781  acagaccaga gagtcgccct tcgccactgg tgttcctcca catctctacg catttcaccg

841  ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt ccccagtttc caatgaccct

901  ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcga gccctttacg

961  cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg gcacgtagtt

1021 agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtgccgccc tatttgaacg gcacttgttc

1081 ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc actcacgcgg cgttgctccg

1141 tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtctgggccg

1201 tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctacgcatcg tcgccttggt

1261 gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc atctgtaagt ggtagccgaa

1321 gccacctttt atgtctgaac catgcggttc aaacaagcat ccggtattag ccccggtttc

1381 ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgcta

1441 acatcaggga gcaagctccc atctgaatct ccagaggatc gccgggaacc gaggacgag

表1菌株(FMME044)生理生化鉴定结果

实施例3

步骤1：培养基制备

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，NaCl 5，初始PH 7.0；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄·7H₂O 0.4，初始pH 7.0；

步骤2：种子制备

500mL三角瓶中种子培养基为50mL，121℃灭菌15min。菌株保藏于终浓度为15％的甘油管中，取200μL保藏菌液接入50ml种子培养基中进行种子培养，37℃，200rpm培养12h。

步骤3：摇瓶发酵培养

种子培养基以10％的接种量接入50mL发酵培养基进行发酵培养。在37℃，200rpm条件下发酵60-72h，取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻的含量。产量为35g/L。

实施例4

步骤1：同实施例3

步骤2：同实施例3

步骤3：7L发酵罐发酵培养

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量为10％(v/v)，培养温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，不控制pH，培养时间32-48h(以葡萄糖耗尽计)取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的乙偶姻的含量。产量为35g/L。

Claims (3)

1.一种产乙偶姻菌株的筛选方法，其特征为：

从无锡郊外菜地地表取土样，称取约5.0g，在80℃的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-6，取10^-4-10^-6稀释菌液涂布于富集培养基上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2ml，10000r/min离心10min，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。

2.根据权利要求1所述一种产乙偶姻菌株的筛选方法，其筛选得到产乙偶姻菌株经生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquifaciensFMME044。

3.一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用Bacillus amyloliquifaciens FMME044为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产乙偶姻；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始PH 7.0；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养10-12h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

发酵条件：接种量10％(v/v)，温度37℃、摇床转速200rpm条件下，发酵60-72h；

3)7L发酵罐发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，过程中不控制pH，培养时间32-48h。

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