CN103351383A - 5-氟尿嘧啶氮氧自由基抗肿瘤药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了结构式（I）所示的化合物，其中X选自NO₂、OH、OCH₃、卤素或H，Y为氧或不存在。本化合物合成方法简便，分子中含有5-氟尿嘧啶及氮氧自由基结构单元，药效具有协同作用，能明显效抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞的增殖。

Description

5-氟尿嘧啶氮氧自由基抗肿瘤药物

技术领域

本发明提供一类新型5-氟尿嘧啶氮氧自由基抗肿瘤药物，属于医药技术领域。 

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，在我国恶性肿瘤已成为居民死亡的第二大因素，每年全世界约有700万人死于癌症，约占总死亡人数的四分之一。化学药物治疗对恶性肿瘤较为有效，是中晚期癌症患者的主要治疗手段和普遍使用的治疗方法，在癌症的治疗中起着不可替代的作用。 

目前，常见的临床药物主要有环磷酰胺(CTX) 、氨甲蝶呤(MTX) 、氟脲嘧啶、阿霉素(ADM) 、表阿霉素(EPI) 、紫杉醇、多烯紫杉醇、铂类药物等。这些药物虽能达到一定治疗癌症的效果，但大多数会引起中性粒细胞减少、胃肠道综合症以及周围神经毒性，对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差，在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，亦严重损伤正常细胞，并直接影响心、肝、肾及神经***。此外，它们往往还存在水溶性差和耐药性等问题。 

联合用药在疗效方面表现出显著优势，然而，联合化疗有效率亦不足40%（临床单药的有效率仅为10-20%），且联合化疗毒副作用大大增加，极大地限制了化疗药物的临床应用效果。大幅度地增加用药量和用药时间会提高药物的抗肿瘤活性，势必严重影响正常组织，甚至引起“化疗死”，从而造成化疗中断。因此，寻找有效的抗癌药物和方法是世界医学面临的重要课题，开发高效、低毒、新型的治疗恶性肿瘤的新药，具有重大的理论意义和应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一类含有可高效清除有害自由基的“氮氧自由基”结构单元和具有抗肿瘤活性的5-氟尿嘧啶结构单元的新型5-氟尿嘧啶氮氧自由基类化合物。 

本发明另一目的在于提供上述5-氟尿嘧啶氮氧自由基类化合物的制备方法； 

本发明还有一个目的是提供上述5-氟尿嘧啶氮氧自由基类化合物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述瘤药为胃癌、肝癌、乳腺癌。

本发明实现过程如下： 

结构式（I）所示的化合物，

其中，X选自NO₂、OH、OCH₃、卤素或H，Y为氧或不存在。

结构式（I）所示化合物的合成方法，合成路线如下： 

。

合成路线还可以如下： 

。

结构式（I）所示化合物的合成方法，合成路线如下： 

。

合成路线还可以如下： 

上述的缩合剂为1,3-二环己基碳二亚胺（DCC），1,3-二异丙基碳二亚胺（DIC）或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)。

结构式（I）所示化合物在制备抗肿瘤单体药物或药物组合物中的应用，所述药物是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、乳剂或注射剂。 

氮氧自由基是近年来发现的一种具有独特的抗氧化性能的自由基。研究证实，体内活性氧物种(ROS)的增高以及细胞抗氧化酶的改变可以诱发肿瘤，本发明依据“抗氧化剂复合链”理论及药物设计的“拼合原理”，将可高效清除有害自由基的氮氧自由基结构单元和具有高效抗肿瘤活性的5-氟尿嘧啶结合，构建系列结构新颖、复合功能的新型抗肿瘤药物结构，可充分发挥二者的抗氧化、抗肿瘤协同作用。本发明5-氟尿嘧啶氮氧自由基类化合物具有非常高的抗肿瘤活性，通过体内外药效学试验证明，该类药物对肝癌、胃癌、乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用，具有良好的抗肿瘤活性，且耐药性更好。 

附图说明

图1为化合物1对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用； 

图2为Tunel法测细胞原位凋亡图片；

图3为化合物2~5抗胃癌MKN45细胞增殖实验；

图4为化合物6~10抗MDA-MB-231细胞增殖实验。

具体实施方式

具体地说，按照本发明方法可以合成得到以下结构化合物。 

方法1： 

方法2：

依据类似的合成途径，还可以合成得到下列代表性结构：

通式（I）的化合物按如下方法合成，更换取代基可得到系列衍生物。

依据类似的合成途径，还可以合成得到下列代表性结构： 

实施例1

将 3.5 g（62.5 mmo1）KOH和40 mL水置于三口烧瓶中，搅拌溶解。加入2.0 g(15.4 mmo1)5-氟尿嘧啶，升温至60 ℃。滴加含2.3 g(21.6 mmol)氯乙酸的水溶液，TLC检测，反应完毕后冷却至室温，用浓盐酸调节pH值为5，滤去沉淀，调pH值至2，冷藏过夜，抽滤，沉淀物用蒸馏水（20 mL×3）洗涤3次，干燥得白色晶体中间体，称重2.46 g，产率81%。

在N₂保护下，将1.5 g(12 mmo1)对羟基苯甲醛、0.1 g(5.8 mmol)无水对甲苯磺酸、15 mL吡啶加入三口瓶中，0 ℃搅拌0.5 h，加入含有2.5 g(12 mmol) DCC的7 mL 的DMF溶液，冰浴下，滴加含有1.9 g上步中间体的10 mL干燥吡啶溶液。加毕，室温搅拌36 h，加入10 mL冰醋酸，搅拌1 h，冰浴静置过夜。过滤，用吡啶洗涤（10 mL×2）洗涤，合并有机相，搅拌下倾入冰水中，析出白色固体沉淀。过滤，蒸馏水洗涤，干燥，氯仿重结晶2次，得白色固体产物，干燥称重1.4 g，产率72.9%。 

将1.00 g（4.0 mmol）上步固体产物、0.84 g（5.6 mmol）双羟胺置于100 mL单口圆底烧瓶中，加入30 mL甲醇溶解，室温下搅拌反应，减压旋干溶剂，得淡黄色固体。冰水浴下，用40 mL CH₂Cl₂中溶解固体（不易久置），滴加NaIO₄的饱和水溶液，反应10 min后停止，有机相用无水MgSO₄干燥，过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析纯化得蓝色固体目标产物1，称重1.33g，产率88.5%。HRMS (m/z): 420.323，[M+H]⁺；g=2.0096，|a_N| =7.83G元素分析: Found: C, 54.41; H, 4.81; N, 13.36 Calc. for C₁₉H₂₀FN₄O₆, C, 54.32; H, 4.96; N, 13.44%。 

实施例2

将 3.5 g（62.5 mmo1）KOH和40 mL水置于三口烧瓶中，搅拌溶解。加入2.0 g（15.4 mmo1）5-氟尿嘧啶，升温至60 ℃。滴加含2.3 g(21.6 mmol)氯乙酸的水溶液，TLC检测，反应完毕后冷却至室温，用浓盐酸调节pH值为5，滤去沉淀，调pH值至2，冷藏过夜，抽滤，沉淀物用蒸馏水（20 mL×3）洗涤3次，干燥得白色晶体中间体，称重2.46 g，产率81%。

在N₂保护下，将1.75 g（12 mmo1）3-氟-4-羟基苯甲醛、0.1 g(5.8 mmol)无水对甲苯磺酸、15 mL吡啶加入三口瓶中，0 ℃搅拌0.5 h，加入含有2.5 g(12 mmol) DCC的7 mL 的DMF溶液，冰浴下，滴加含有1.9 g上步中间体的10 mL干燥吡啶溶液。加毕，室温搅拌36 h，加入10 mL冰醋酸，搅拌1 h，冰浴静置过夜。过滤，用吡啶洗涤（10 mL×2）洗涤，合并有机相，搅拌下倾入冰水中，析出白色固体沉淀。过滤，蒸馏水洗涤，干燥，氯仿重结晶2次，得白色固体产物，干燥称重3.0 g，产率78.9%。 

将1.00 g（4.0 mmol）上步固体产物、0.84 g（5.6 mmol）双羟胺置于100 mL单口圆底烧瓶中，加入30 mL甲醇溶解，室温下搅拌反应，减压旋干溶剂，得淡黄色固体。冰水浴下，用40 mL CH₂Cl₂中溶解固体（不易久置），滴加NaIO₄的饱和水溶液，反应10 min后停止，有机相用无水MgSO₄干燥，过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析纯化得目标产物4，称重1.33g，产率88.5%。HRMS (m/z): 437.22，[M+H]⁺；g=2.0045，|a_N| =7.69G。元素分析: Found: C, 52.18; H, 4.38; N, 12.81 Calc. for C₁₉H₁₉F₂N₄O₆, C, 52.23; H, 4.40; N, 12.75%。 

实施例3

将2.0 g（15.4 mmo1）5-氟尿嘧啶，3.5 g（62.5 mmo1）KOH和2.3 g（15.4 mmo1）对醛基苯甲酸及40 mL水置于三口烧瓶中，搅拌反应。TLC检测，反应完毕后抽滤，有机相柱层析纯化得白色晶体中间体，称重3.5 g，产率87%。

将1.00 g（4.0 mmol）上步固体产物、0.84 g（5.6 mmol）双羟胺置于100 mL单口圆底烧瓶中，加入30 mL甲醇溶解，室温下搅拌反应，减压旋干溶剂，得淡黄色固体。冰水浴下，用40 mL CH₂Cl₂中溶解固体（不易久置），滴加NaIO₄的饱和水溶液，反应10 min后停止，有机相用无水MgSO₄干燥，过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析纯化得目标产物6，称重1.02g，产率65.8%。HRMS (m/z): [M+H]⁺ 389.10；g=2.0067，|a_N| =7.90G。元素分析: Found: C, 55.53; H, 4.66; N, 14.39 Calc. for C₁₈H₁₈FN₄O₅, C, 55.61; H, 4.62; N, 14.47%。 

实施例4

将2.0 g（15.4 mmo1）5-氟尿嘧啶，3.5 g（62.5 mmo1）KOH和3.0 g（15.4 mmo1）4甲酰基-2硝基苯甲酸及40 mL水置于三口烧瓶中，搅拌反应。TLC检测，反应完毕后抽滤，有机相柱层析纯化得白色晶体中间体，称重4.1 g，产率86%。

将1.23g（4.0 mmol）上步固体产物、0.84 g（5.6 mmol）双羟胺置于100 mL单口圆底烧瓶中，加入30 mL甲醇溶解，室温下搅拌反应，减压旋干溶剂，得淡黄色固体。冰水浴下，用40 mL CH₂Cl₂中溶解固体（不易久置），滴加NaIO₄的饱和水溶液，反应10 min后停止，有机相用无水MgSO₄干燥，过夜，旋转蒸发仪除去溶剂，柱层析纯化得目标产物8，称重1.20g，产率70.5%。HRMS (m/z): [M+H]⁺ 434.25；g=2.0071，|a_N| =7.85G。元素分析: Found: C, 49.77; H, 3.94; N, 16.12 Calc. for C₁₈H₁₇FN₅O₇, C, 49.68; H, 3.96; N, 16.50%。 

实施例5：化合物1的抗肿瘤药效学实验

1. 体外试验

（1）实验方法

将肝癌细胞株SMMC-7721(本校病理生理学教研室)细胞接种于含100 mL／L新生小牛血清的RPMI 1640培养液中，置50 mL／L CO₂培养箱中，37℃培养，所有实验均选用对数生长期的细胞。将调整好密度的细胞加入到96孔培养板，每孔6000-10000 个细胞，培养24 h后换液，加入不同浓度的药物(用含100 mL／L小牛血清的1640完全培养液稀释成不同的终浓度：10 μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL)，每浓度均作6个平行孔，另设空白孔和对照孔，药物作用期间，用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，作用24 h后，每孔加入5 g／L的MTT 20 μL，培养4 h，弃上清液，加DMSO约100 μL／孔，振荡10 min，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪测定各孔的吸光度值A_570nm。

（2）试验结果 

MTT结果显示（图1），化合物1的浓度为20μg/mL，40μg/mL, 80μg/mL，160μg/mL时对SMMC-7721细胞有明显的抑制细胞增殖作用。

由表1可见，化合物1对不同的肿瘤细胞均有抑制作用，与多烯紫杉醇相比，化合物1对乳腺癌细胞MDA-MB-231和胃癌细胞MKN-45、MKN-28的增长抑制效果尤为显著，且对正常细胞GES的毒害影响低于多烯紫杉醇。 

2. 体内实验 

（1）实验方法

对数生长期人乳腺癌MDA-MB-231细胞，调整细胞浓度为1-2×10⁷ cells/mL，6号针头注射接种于裸鼠大腿内侧皮下，每只接种0.2 mL。接种30只裸鼠，两周后荷瘤成功，肿瘤平均体积122±11 mm³时用于实验。

肿瘤抑制率的检测 

选择肿瘤大小差别不大的裸鼠24只，随机分组，每组3只，分为空白组，1组（40 mg/kg），多烯紫杉醇阳性对照组（40 mg/kg）。采用瘤体局部注射法，每两天用药1次，每次用药50 μL实验周期为两周。实验结束后，用颈椎脱臼法处死所有裸鼠，迅速解剖摘取瘤块，测量体积。

TUNEL法原位检测细胞凋亡 

采用TUNEL原位检测细胞凋亡试剂盒（购自BD公司）检测细胞凋亡情况。

（2）实验结果 

肿瘤抑制率的检测

实验结果表明，化合物1、多烯紫杉醇阳性对照组均显现出较为明显的的抑制肿瘤生长的作用。第12天时，肿瘤体积差别明显。

从表3可见，化合物1实验组对肿瘤有较好的抑制作用，与多烯紫杉醇中、低剂量组无显著性差异（P>0.05）。本实验证明1在动物水平能较好的抑制肿瘤增长。 

TUNEL法原位检测细胞凋亡实验结果见图2。 

从原位细胞凋亡率检测结果进行分析，化合物1实验组和多烯紫杉醇阳性对照组均能诱导细胞凋亡，与空白组相比有显著性差异（P<0.05）。 

实施例6：化合物2~5抗胃癌MKN45细胞增殖实验

验操作方法同实施例5，实验结果如图3所示。图3中数据说明化合物2~5（浓度为40μg/mL）对人胃癌MKN45细胞增殖均有一定的抑制作用。

实施例7：化合物6~10抗MDA-MB-231细胞增殖实验

实验操作方法同实施例5，实验结果如图4所示。图4中数据说明化合物6~10（浓度为40μg/mL）对MDA-MB-231细胞增殖均有一定的抑制作用。

实施例8：化合物1抗MDA-MB-231细胞增殖实验与现有氮氧自由基结果比较

由上表抗胃癌MDA-MB-231细胞增殖实验的IC₅₀值可见，本发明的新型5-氟尿嘧啶氮氧自由基具有比现有合成的药物具有更好的抗肿瘤药物活性。

Claims (8)

1.结构式（I）所示的化合物，

其中，X选自NO₂、OH、OCH₃、卤素或H，Y为氧或不存在。

2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于合成路线如下：

。

3.根据权利要求2所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

4.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于合成路线如下：

。

5.根据权利要求4所述化合物的合成方法，其特征在于：

。

6.根据权利要求2至5任意之一所述化合物的合成方法，其特征在于：所述的缩合剂为1,3-二环己基碳二亚胺，1,3-二异丙基碳二亚胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

7.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤单体药物或药物组合物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所述药物是片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、乳剂或注射剂。

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