CN113234166B - 一种抗afp的纳米抗体1c5及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗AFP的纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明还提供了含有该纳米抗体可变区编码序列的表达载体，含有该表达载体的宿主细胞，以及所述纳米抗体在制备肿瘤治疗药物和肿瘤诊断试剂中的应用。本发明提供的纳米抗体对AFP具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到2.716E‑09，具有独特的抗原决定簇识别位点，对癌细胞具有显著的ADCC效应，而且能够在AFP血清检测特别是双抗体夹心法中获得优异的检测效果。

Description

一种抗AFP的纳米抗体1C5及其应用
技术领域
本发明公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。
背景技术
肝细胞性癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第五大癌症，我国发病人数约占全球55％，在我国所有肿瘤的死亡率中排行第2，仅次于肺癌。甲胎蛋白(甲种胎儿蛋白，α-fetoprotein，AFP)最早是由Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现，是目前应用最广泛的HCC肿瘤标志物，被普遍应用于相关疾病的检查。AFP是一种糖蛋白，属于白蛋白家族，分子量为69kDa，一般情况下AFP主要由胚胎肝脏细胞分泌而来。因为其糖链结构的差异，AFP分子存在差异性，目前认为至少有三种异质体(AFP2L1，AFP2L2，AFP2L3)。AFP存在于人血清中，来源于早期胎儿的肝脏和卵黄囊，孕期4周即可在胎儿血清中检测到，最高可达l～3g/L，出生时仍高达60～120mg/L，出生后合成很快受到抑制，含量降至50μg/L，一周岁婴儿的血清AFP浓度水平接近成人。健康成人血清中AFP主要由肝脏产生，生理功能尚不清楚，可能与维持正常妊娠、调节脂肪酸进入胎儿体内及免疫抑制有关。正常成年人血清AFP水平非常低，一般低于10μg/L。肝细胞癌变时，AFP水平随着疾病进展会显著升高，目前，我国建议的临界值上限为20μg/L。AFP是我国目前在临床唯一推荐常规使用的肝细胞癌肿瘤标志物，同时结合超声检查，对无症状的高危人群进行筛查，是临床早期发现肝癌患者的最常用方法。随着医疗水平的不断提高，肝细胞癌的诊断和治疗水平不断进步，但肝细胞癌的临床死亡率仍居高不下，究其原因，与肝细胞癌发病隐匿，自觉症状不明显，造成就医确诊晚有关。提高肝细胞癌患者早期诊断率，同时在治疗过程中通过有效的方法手段进行监测是提高肝细胞癌治疗质量和生存率的关键所在。基于以上原因，目前首要任务是建立简单、快速、有效的检验方法。
不仅如此，自上世纪90年代以来，研究者利用AFP作为载药载体，运输抗癌药物，如阿霉素、柔红霉素、顺铂、甲氨蝶呤等成为热门研究内容，通过胞吞作用将上述药物选择性转运至肿瘤细胞中，起到治疗作用。此外，Meng和Sauzay等研究发现，AFP可以与肝癌细胞膜上的受体结合，进而激活Ca2+和PI3/AKT等信号通路，通过上调c-fos、Srs、c-jun、Ras等癌基因的表达，促进肝癌细胞的增殖(Meng WenBo等，The immunosuppression role of alpha-fetoprotein in human hepatocellular carcinoma，Discovery medicine，2016年21卷118期；ChloéSauzay等，Alpha-foetoprotein(AFP):A multi-purpose marker inhepatocellular carcinoma，Clinica Chimica Acta，2016年463卷)。因此，AFP无论是在疾病的诊断、靶向治疗还是后期的预后监测方面都发挥着巨大的作用。
介于癌症生物标志物在癌症的早期诊断和治疗预后中起着重要的作用，其敏感检测在过去几十年里引起了巨大的研究浪潮。免疫分析就是其中一种检测方法。由于其特异性和稳定性的优势，已被广泛应用于癌症生物标志物的敏感检测，并用于基础研究和临床检测。目前，已开发出了多种类型的免疫分析方法：包括电泳免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法、比色法免疫分析法、质谱免疫分析法、表面拉曼增强光谱免疫分析。化学发光免疫分析法的灵敏度和精确度比酶联免疫吸附法、荧光法高几个数量级，且具有方法稳定快速、检测范围宽、操作简单、自动化程度高等优点，可用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等相关物质的检测分析。目前AFP检测方法大多使用的为传统抗体(鼠源单克隆抗体、兔源多克隆抗体以及山羊抗体)，这些抗体分子量大，稳定性差等不足的特点，使得AFP检测灵敏度受到了一定的限制。
基于AFP在临床诊断、治疗和预后方面所表现出的突出特性，研发出针对AFP的特异性结合抗体显得尤为重要。
1993年，Hamers-Casterman等研究发现，在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内发现了一类仅有重链二聚体(H2)的抗体，其主要是IgG2和IgG3类型，此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(Heavy chain only like Antibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kDa，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识。这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，因此形成一种重链二聚体。
相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。
纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较单克隆抗体容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。
本发明的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，既具有优异的特异性抗原结合能力，又能克服传统抗体实体肿瘤渗透性差，靶向效应低等固有缺陷的抗AFP的纳米抗体，并进一步提供其在肿瘤尤其是在肝癌治疗药物和诊断制剂制备中的应用。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗AFP的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ ID NO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成，所述抗体具有独特的抗原决定簇识别位点。
在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ ID NO.4所述氨基酸序列组成。在本发明中具有该可变区序列的纳米抗体的一个优选实施例为纳米抗体1C5。
其次，本发明还提供了一种含有上述纳米抗体的融合蛋白，所述融合蛋白还含有化学发光区功能性蛋白。
在一个优选的技术方案中，所述化学发光区功能性蛋白为碱性磷酸酶蛋白。
更为优选地，所述化学发光区功能性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
第三，本发明还提供了一种编码上述纳米抗体的核酸，所述编码序列由SEQ IDNO.5所示。
第四，本发明提供了一种含有上述核酸的表达载体，所述表达载体为pMES4。
第五，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
最后，本发明还提供了上述纳米抗体在肿瘤治疗药物或肿瘤免疫法诊断试剂盒中的应用。
在一个优选的技术方案中，所述免疫法为双抗体夹心法，所述纳米抗体连接有化学发光区，并作为酶标二抗使用。
本发明提供的纳米抗体1C5对AFP抗原具有特异的识别和结合能力，该纳米抗体亲和力可达到2.716E-09，且具有独特的抗原决定簇识别位点，因此，显示出本发明提供的纳米抗体具有高度特异的结合活性。另外，本发明提供的纳米抗体1C5在作为酶标二抗应用于双抗夹心免疫法检测AFP的方法中显示了优异的检测性能，其可以与多个作为捕获一抗的纳米抗体配对使用，具有广谱的适配性，显示其抗原识别表位在众多抗AFP的纳米抗体中具有一定的独特性，适合于作为酶标二抗应用于双抗夹心免疫法检测AFP的方法中。
附图说明
图1.提取的总RNA电泳鉴定图；
图2.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图3.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；
图4.pMES4表达载体结构示意图；
图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；
图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；
图7.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；
图8.Biacore分析纳米抗体结合位点流程图；
图9.Biacore分析纳米抗体亲和力曲线图；
图10.纳米抗体ADCC效应曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1.纳米抗体噬菌体展示文库的构建及筛选
1.1羊驼的免疫
选取健康成年羊驼一只，将重组AFP抗原(爱必信生物，货号Abt-P-208，GenbankID:174，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/174)与弗氏佐剂按1:1的比例混匀，按6-7μg/kg采用背部皮下多点注射的方式免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。之后采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。
1.2驼源淋巴细胞的分离
将采集的羊驼外周血利用骆驼外周血淋巴细胞分离液试剂盒(天津灏洋公司，货号LTS1076)说明书操作进行分离淋巴细胞，每2.5×107个活细胞加入1ml RNA分离试剂，取1ml进行RNA提取，其余-80℃保存。
1.3总RNA提取
将含有淋巴细胞的1ml Tipure Isolation Reagent反复吹打，放置5分钟；加入200μl氯仿，涡旋30秒后继续放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1ml预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μl RNase-free水溶解沉淀，调整浓度到1μg/μl进行凝胶电泳检测(图1：M为Trans 2K DNA Marker；1-2为提取的RNA)。
1.4反转录合成cDNA
根据逆转录试剂盒说明书(Roche公司的transcripor first stand cDNAsynthesis KIT)以1.3步骤获得的RNA为模板进行逆转录cDNA。
1.5抗体可变区基因扩增
将反转录得到的cDNA作为模版进行PCR反应。扩增共进行两轮，第一轮PCR的引物序列如下：
CALL001：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
CALL002：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收700bp左右的条带，最终用水调整核酸浓度至5ng/μl(图2：M为Trans 2K DNA Marker；1-3为第一轮PCR产物)。第二轮PCR的引物序列如下：
VHH-Back：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
VHH-For：CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
PCR反应条件及程序为：95℃5分钟；95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，15个循环；72℃7分钟。使用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物(图3：M为Marker；1-3为第二轮PCR产物)。
1.6载体构建
将pMES4(购自Biovector，其结构示意图见图4)与第二次PCR产物分别进行PstI、BstEII双酶切，取1.5μg酶切后载体和450ng酶切后的第二次PCR产物，加15μl T4 DNA连接酶，补充缓冲液和水至150μl总体积，16℃过夜连接并回收连接产物。使用PCR产物回收试剂盒进行产物回收，20μl水洗脱。1％琼脂糖电泳凝胶检测pMES4载体双酶切结果(图5：M为Trans 5K Plus DNA Marker；1-2为pMES4载体双酶切后产物；3为pMES4载体未酶切质粒)。
1.7电转化及库容测定
取10μl纯化后的连接产物，加入到含有50μl大肠杆菌TG1感受态细胞的预冷电转杯中置入电转仪(美国BTX的ECM630电转仪)进行电转化，取出电转杯，复苏并培养转化子。随机挑选克隆，进行菌落PCR鉴定(图6：M为Marker；N为阴性对照；1-15为随机挑选的单克隆PCR鉴定产物)。根据PCR阳性率推算库容(库容量＝克隆数×稀释倍数×PCR鉴定阳性率×10)。引物序列如下：
MP57：TTATGCTTCCGGCTCGTATG
GIII：CCACAGACAGCCCTCATAG
1.8噬菌体扩增
取复苏的菌液接种至YT-AG培养基中，37℃200rpm培养到培养物OD600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010VCSM13，37℃静止感染30分钟。4000rpm，常温离心10分钟，去净上清。用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素)培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜。离心取上清40ml管中，加入10ml PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，离心弃上清，沉淀用1ml冰PBS洗涤离心，取上清250μl预冷的PEG/NaCl，充分混匀并洗涤重悬。
测定噬菌体滴度：将TG1培养至OD600＝0.4，用LB培养基梯度稀释噬菌体，取倍比稀释的噬菌体TG1培养物混合培养，次日观察培养板中噬菌斑形成情况，对噬菌斑数在30-300的稀释梯度平板进行计数并按照下列公式计算噬菌体滴度(pfu)。
噬菌体滴度(pfu/ml)＝稀释倍数×噬菌斑数目×100
1.9纳米抗体筛选
通过ELISA方法以抗原筛选阳性克隆。以抗原包被ELISA板，5％BSA封闭，PBST洗涤。每孔加入100μl噬菌体上清液，37℃放置1小时。弃上清，加入HRP标记的小鼠抗M13的二抗，37℃放置1小时。弃上清，加入TMB溶液，室温孵育5小时，每孔加入2M硫酸终止液，用酶标仪450nm读数。
1.10纳米抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
挑选噬菌体ELISA结果阳性的克隆，提取质粒并转化至菌株BL21感受态细胞，以IPTG诱导纳米抗体蛋白表达，收集上清(周质提取物)，并将周质提取物透析至PBS，使用Ni-NTA树脂进行纯化，使用不同浓度咪唑进行洗脱和收集，将收集的样品进行还原型蛋白电泳分析，最后将纳米抗体透析到PBS中。
通过羊驼免疫、细胞分离、噬菌体文库的构建、纳米抗体的筛选，筛选出抗AFP的纳米抗体。用Vector NTI软件对测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(Complementary Determining Regions，CDR)。
本发明筛选到的一个优选实施方案的纳米抗体被命名为“1C5”。通过DNA测序，所述纳米抗体1C5重链核酸序列为SEQ ID NO.5所示，可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中第1-25位氨基酸序列为FR1，第26-33位氨基酸序列为CDR1，第34-50位氨基酸序列为FR2，第51-58位氨基酸序列为CDR2，第59-96位氨基酸序列为FR3，第97-111位氨基酸序列为CDR3，第112-122位氨基酸序列为FR4。
实施例2.纳米抗体1C5的制备
2.1纳米抗体原始菌株TG1扩增及纳米抗体重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)
将含有纳米抗体核酸的原始菌株TG1甘油菌，按照1:1000比例接种于5ml新鲜的LB-A培养基，37℃200rpm过夜培养。次日，使用Plasmid mini kit(OMEGA)按照说明书提取质粒。经验证后将上述质粒1μl转化于100μl感受态细胞中，轻轻混匀，在冰上放置30分钟，42℃水浴热击90秒，冰浴冷却3分钟。向离心管加入600μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。取上清100μl，用三角涂布器涂布在LB-A平板上，37℃倒置培养过夜。
2.2纳米抗体的诱导表达
挑取上述单克隆菌落于LB-A培养基中，37℃振荡培养过夜。次日，取该菌液按照1:100比例加入100ml新鲜LB-A培养基，37℃振荡培养3小时至菌液OD600＝0.8左右，加入终浓度为1mM IPTG，30℃诱导过夜。第三日，8000rpm，离心10分钟收集菌体，加入1.5ml的预冷TES缓冲液重悬沉淀。冰浴2分钟后，轻柔振荡30秒，重复此循环6次。加3.0ml TES/4(将TES用水稀释4倍)，轻柔振荡30秒后，冰浴静置2分钟，同样重复振荡和静置步骤共6次。9000rpm，4℃离心10分钟，收集约4.5ml的上清(周质提取物)。
2.3纳米抗体的纯化和鉴定
将IMAC Sepharose(GE公司)重悬后，取2ml加入到重力柱内，静置30分钟，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存缓冲液。加入2倍柱体积的硫酸镍溶液(0.1M)，按照约8秒/滴的流速流出硫酸镍溶液；加入10倍柱体积的平衡缓冲液平衡并洗涤sepharose，流速维持不变；将样品使用平衡缓冲液2倍稀释后，加入重力柱中，调节流速为6秒/滴，收集穿透液；加入10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤sepharose，维持流速不变，收集洗涤液；加入3倍柱体积的洗脱缓冲液，流速维持在6秒/滴，收集含有目的蛋白的洗脱液；最后依次加入10倍柱体积的平衡缓冲液、10倍柱体积的纯水和10倍柱体积的20％乙醇洗涤sepharose，并最终保留4ml的20％乙醇来保存柱子。上述收集的样品分别进行SDS-PAGE检测(图7:M为彩虹180广谱蛋白Marker；1-9为大肠杆菌诱导表达纯化后的纳米抗体)。
实施例3.纳米抗体与抗原的亲和活性测定
3.1芯片抗原偶联
将抗原用不同pH的醋酸钠缓冲液(pH 5.5，pH 5.0，pH 4.5，pH 4.0)配制成20μg/ml的工作液，同时准备50mM的NaOH再生溶液，利用Biacore T100蛋白相互作用分析***仪器中的模板方法对不同pH条件的抗原与芯片(GE公司)表面之间的静电结合进行分析，以信号增加的量达到5倍RL为标准，选择合适的最偏中性的pH体系并根据需要调整抗原浓度作为偶联时的条件。按照仪器中自带的模板方法对芯片进行偶联：其中1通道选择空白偶联模式，2通道选择Target偶联模式，目标设置为设计好的理论偶联量。偶联过程大概耗时60分钟。
3.2分析物浓度设置条件探索及再生条件优化
采取手动进样模式，选择1，2通道2-1模式进样，流速设置为30μl/分钟。进样条件均为120秒，30μl/分钟。再生条件均为30秒，30μl/分钟。首先持续空走运行缓冲液直至所有基线均稳定。准备浓度跨度较大的纳米抗体溶液，以运行缓冲液配置，建议设置200μg/ml，150μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml，2μg/ml。准备再生溶液，选择谷氨酸盐酸体系四个pH梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手动进样200μg/ml分析物样品，观察2通道，从最偏中性pH的再生缓冲液进行再生，直至2通道再生后的响应线回到与基线同一高度。再手动进样一次200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量，用上一步中最后使响应线回到基线的再生溶液进行再生后，再次收手动进样200μg/ml分析物样品，观察2-1通道的信号变化并记录结合量与刚才的结合量数值对比，若偏差小于5％，即认为此pH的再生溶液为最佳的再生溶液，若再次进样的结合量偏低，则继续以更低pH的再生缓冲液进行实验。以选择的最佳再生溶液，作为每次进样后的芯片表面再生试剂。分别进样上面设置的分析物浓度样品，并对每个浓度的结合量进行分析，最终确定亲和力测试所需的浓度梯度。
3.3亲和力测试
按优化好的样品浓度梯度，再生溶液，使用仪器自带的模板方法(其中设置进样条件为60秒，30μl/min；解离时间：600秒；再生条件：30秒，30μl/min)对纳米抗体及抗原之间的亲和力进行测试。随时观察2-1通道的信号情况。亲和力测试过程大概耗时200分钟。
3.4结果分析
选择合适的几个浓度梯度的结合解离曲线采用1：1binding的模式对所有曲线进行拟合，最终得到亲和力数值及结合常数和解离常数等重要参数(见表1和图9)。抗AFP纳米抗体1C5的亲和力数值为2.716E-09。
表1：纳米抗体亲和力数据
Figure BDA0003074467170000101
Figure BDA0003074467170000111
实施例4.纳米抗体的ELISA叠加数据分析
4.1抗原饱和浓度的确定
以2μg/ml的浓度包被抗原，100μl/孔，4℃包被24小时，洗板5遍。以1％BSA作为封闭剂过夜封闭，洗板5遍。酶标板中加入不同梯度稀释的纳米抗体、阴性对照(阴性血清1:100)、PBS空白对照，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加入1:4000比例稀释的HRP标记的羊抗羊驼IgG，37℃孵育30分钟，洗板5遍。加TMB显色液，37℃孵育10分钟，2M硫酸终止反应。读取吸光值450nm读数，绘制抗体饱和曲线，根据结果选择随浓度增加读数不再增加的浓度为饱和浓度。
4.2位点叠加实验
先加入第一种抗体进行反应，洗板后再加第二种抗体，洗板后加酶标二抗，TMB显色读数(方法同4.1)。计算两株抗体叠加率AI，AI>50％说明被测2株抗体抗原位点不同，AI<50％说明被测两株抗体抗原表位相同，AI值越大，位点重叠可能性越低。公式为：AI＝[2×A(1+2)-(A1+A2)]/A(1+2)×100％
A1—第一株抗体读数
A2—第二株抗体读数
A(1+2)—叠加2种抗体读数
表2：抗体抗原表位叠加实验
Figure BDA0003074467170000112
Figure BDA0003074467170000121
实验结果见表2，1C5与其他四株纳米抗体1A7、2F5、1F9、1B1分别针对AFP抗原不同的抗原表位，这预示着在AFP的检测应用上，该几株纳米抗体组成检测抗体对的几率大大增加，从而可以增大检测效率。
实施例5.利用Biacore分析纳米抗体结合位点
Biacore***主要原理就是通过表面分子的浓度改变使SPR(折射率)发生偏移，在监测器上表现为RU值的变化。由于该***的灵敏度更高，我们设计了相关实验来验证ELISA叠加的实验结果。如图8所示，首先重复进2针第一个纳米抗体A，观察RU值的变化，以确认相应的抗原结合位点的饱和并记录；之后进入第二个纳米抗体B，观察并记录RU值：如该RU值比单一的纳米抗体B的RU值相差不超过20％，即可认为两者识别不同的抗原决定簇；如相差值超过20％但低于60％，认为两者有位阻效应；若相差值超过了60％，判定两者识别了同一抗原。具体操作为首先单纯进样抗体B记录RU增加值RB1，并对芯片再生；之后重复进两次抗体A，记录RU增加值RA，并确认饱和后，直接进样抗体B，观察RU值的增加量RB2；之后使用公式(RB2-RA)/RB1来计算位阻率，以此判定二者是否识别同一抗原决定簇。该实施例结果见表3。可见1C5纳米抗体与其他四株纳米抗体均识别不同抗原位点，该结果与ELISA叠加实验推测的结果一致。更加验证了该五株纳米抗体在AFP检测领域的应用前景。
表3：Biacore检测纳米抗体叠加实验RU值变化表
Figure BDA0003074467170000131
实施例6.1C5-HAP在检测标准血清中的AFP含量中的应用
以人碱性磷酸酶的结合位点序列作为化学发光区氨基酸序列，如SEQ ID NO:8所示。使之通过柔性多肽与1C5纳米抗体相融合成为带有化学发光区序列的纳米抗体1C5-HAP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。在所述核酸编码序列的两个末端添加有HindⅢ和EcoRⅠ两个酶切位点，以该两个酶切位点连接到载体pCDNA3.1(+)上。无内毒素大提质粒后利用状态处于对数生长的293细胞进行转染。获得转染的细胞培养至36小时后将细胞培养液倒入50ml离心管中，12000g离心5分钟，收集上清，用0.22μm滤膜过滤，利用阴离子交换层析对培养上清进行纯化。利用实施例3相同的方法对1C5-HAP进行亲和力测试，结果1C5-HAP的亲和力数值为1.864E-10。经过筛选配对，结果见表4所示。选取FC融合纳米抗体1A7或者2F5为捕获一抗(融合方法见CN106749667A中的实施例5)，其可变区序列含有如SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7所述的氨基酸序列所示，1C5-HAP为酶标二抗进行双抗体夹心免疫法检测血清标本中的AFP抗原，获得了优异的检测效果，具体过程如下：
使用无菌CBS稀释捕获抗体至终浓度为10μg/ml；按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃静置18小时；弃上清后，每孔加入300μl洗涤液，水平震动3分钟，吸弃上清；重复洗板四次。每孔加入200μl 1％BSA，于37℃静置1小时。重复洗板四次；每孔中加入50μl阳性对照、阴性对照或者待测样本；随即每孔加入50μl新鲜稀释的酶标二抗(即纳米抗体1C5-HAP，稀释至工作浓度为2μg/ml)，置于摇床上摇动3～5秒；37℃下温育1小时。重复洗板四次，每孔加入100μl AP化学发光显色液(BM Chemiluminescence ELISA Substrate)，在摇床上摇动3～5秒；室温避光孵育10分钟；选择酶标仪程序Luminescence，测定各孔的Lum值并计算质控血清AFP值。结果1C5与1A7、2F5纳米抗体对线性指数R2＞0.99。
表4：纳米抗体1C5与1A7、2F5两株纳米抗体配对检测血清中AFP含量曲线线性指数结果
捕获抗体 检测抗体 线性指数(R<sup>2</sup>)
1A7 1C5-HAP 0.9979
2F5 1C5-HAP 0.9935
1F9 1C5-HAP 0.9617
1B1 1C5-HAP 0.9844
本实施例显示，1C5与1A7、2F5配对使用，线性指数趋近于1，均取得了优异的检测效果，具有广谱的适配性，显示其抗原识别表位在众多抗AFP的纳米抗体中具有一定的独特性，适合于作为酶标二抗应用于双抗夹心免疫法检测AFP的方法中。
实施例7.带恒定区的抗AFP纳米抗体的制备及其诱导的ADCC活性测定
将抗AFP纳米抗体1C5进行FC融合表达，(融合方法见CN106749667A中的实施例5)，其融合后的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在96孔细胞培养板内培养HCC-9204和SK-Hep-1细胞(3×104/孔)48小时，然后根据特定比例加入LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞，lymphokine activated killercells)、抗AFP纳米抗体或者IgG抗体对照，LAK细胞与靶细胞的比例为1:1、5:1、10:1、15:1、20:1，抗体浓度均为2μg/ml。在5％CO2环境下37℃孵育6小时，吸去LAK细胞和死亡的肿瘤细胞，使用MTS方法进行细胞活力测定。
细胞毒性(％)＝【实验靶细胞的OD490/对照靶细胞的OD490】×100结果显示，抗AFP纳米抗体1C5能显著诱导LAK细胞的ADCC活性，肿瘤细胞裂解率在45％左右，在不表达AFP的SK-Hep-1细胞中未观察到这种裂解现象(见图10)。
序列表
<110> 深圳市国创纳米抗体技术有限公司
<120> 一种抗AFP的纳米抗体1C5及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 1
Glu Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 2
Ile Ser Trp Asp Asp Glu Arg Thr
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 3
Ala Val Gly Gly Leu Ser Asp Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Trp Asp Asp Glu Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Gly Gly Leu Ser Asp Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 366
<212> DNA
<213> Lama pacos
<400> 5
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60
tcctgtaaag cctctgaacg caccttcagt agctattcca tggcctggta ccgccaggct 120
ccagggaaga agcgtgagtt tgtagcctct attagctggg atgatgaacg cacatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagaccta atgccaagaa cacggtatat 240
ctgcagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agttggagga 300
ctctcggacg ggttggggcc cagctatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> Lama pacos
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Glu Ser Ile Phe Ser Phe Ala
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Ile Thr Gly Gly Asp Asn Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Gly Glu Gly Tyr Gly Ser Ser Trp Phe Asp Asp Gly Lys Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 484
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala
20 25 30
Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr
35 40 45
Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly
50 55 60
Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser
65 70 75 80
Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu
100 105 110
Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu
115 120 125
Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly
130 135 140
Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr
145 150 155 160
Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala
165 170 175
Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser
180 185 190
Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe
195 200 205
Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly
210 215 220
Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys
225 230 235 240
Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala
245 250 255
Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly
260 265 270
Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu
275 280 285
Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg
290 295 300
Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His
305 310 315 320
Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp
325 330 335
Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser
340 345 350
Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro
355 360 365
Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp
370 375 380
Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val
385 390 395 400
Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser
405 410 415
Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro Leu Asp Glu Glu Thr His
420 425 430
Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu
435 440 445
Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe
450 455 460
Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala
465 470 475 480
Gly Thr Thr Asp
<210> 9
<211> 621
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Trp Asp Asp Glu Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Pro Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Gly Gly Leu Ser Asp Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu
130 135 140
Asn Pro Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala
145 150 155 160
Lys Lys Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe
165 170 175
Leu Gly Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu
180 185 190
Lys Gly Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met
195 200 205
Asp Arg Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys
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His Val Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val
225 230 235 240
Lys Gly Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn
245 250 255
Gln Cys Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg
260 265 270
Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val
275 280 285
Gln His Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn
290 295 300
Trp Tyr Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys
305 310 315 320
Gln Asp Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile
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Leu Gly Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro
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Glu Tyr Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys
355 360 365
Asn Leu Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val
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Trp Asn Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr
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Gly Gly Arg Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala
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Leu Thr Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln
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485 490 495
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Asp Val Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser
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565 570 575
Phe Ala Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln
580 585 590
Thr Phe Ile Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr
595 600 605
Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp
610 615 620
<210> 10
<211> 353
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Lys Arg Glu Phe Val
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala His His Ser Glu Asp
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Cys Pro Lys Cys Pro Gly Pro Glu Leu Leu Gly Gly
130 135 140
Pro Thr Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile
145 150 155 160
Thr Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Lys Glu
165 170 175
Asp Pro Glu Ile Glu Phe Ser Trp Ser Val Asp Asp Thr Glu Val His
180 185 190
Thr Ala Glu Thr Lys Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
195 200 205
Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys
210 215 220
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
225 230 235 240
Arg Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr
245 250 255
Ala Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr Val Ser Val
260 265 270
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Phe Pro Ala Asp Ile Asn Val Glu Trp
275 280 285
Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala Thr Thr Leu
290 295 300
Pro Gln Leu Asp Asn Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
305 310 315 320
Val Gly Lys Asn Thr Trp Gln Gln Gly Glu Val Phe Thr Cys Val Val
325 330 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Ser Thr Gln Lys Ser Ile Ser Gln
340 345 350
Ser

Claims (10)

1.一种抗AFP的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.1所述氨基酸序列组成，CDR2序列由SEQ IDNO.2所述氨基酸序列组成，CDR3序列由SEQ ID NO.3所述氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQ IDNO.4所述氨基酸序列组成。
3.一种含有权利要求1或2所述纳米抗体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还含有化学发光区功能性蛋白。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述化学发光区功能性蛋白为碱性磷酸酶蛋白。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述化学发光区功能性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.一种编码权利要求2所述纳米抗体序列的核酸，其特征在于，所述编码序列由SEQ IDNO.5所示。
7.一种含有权利要求6所述的核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pMES4。
8.一种含有权利要求7所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.权利要求1-2任一所述的纳米抗体在肿瘤治疗药物或肿瘤免疫法诊断试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所特征在于，所述免疫法为双抗体夹心法，所述纳米抗体连接有化学发光区，并作为酶标二抗使用。
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