CN103323593A - 一种检测氟喹诺酮类药物的试纸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测氟喹诺酮类药物的试纸，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)和结合物释放垫(3)、反应膜(4)、吸水垫(5)和PVC底板(8)。在所述反应膜上有包被有氟喹诺酮类-载体蛋白偶联物构成的检测线(6)和包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线(7)，结合物释放垫(2)包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物，结合物释放垫(3)包被有氟喹诺酮类单克隆抗体。本发明还提供了一种应用上述氟喹诺酮类试纸检测氟喹诺酮类药物的方法。本发明所提供的试纸可用于检测化妆品中氟喹诺酮类药物残留，具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低的特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种检测氟喹诺酮类药物的试纸及其应用

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种检测氟喹诺酮类药物的试纸及其应用。

背景技术

氟喹诺酮类药物是近20年来迅速发展起来的继磺胺类药物之后人类在合成抗菌药方面最重要的突破，该类药物发展经历了以下几个阶段：1962年美国科学家发现了第一个氟喹诺酮类抗菌药——萘啶酸，此后又出现了奥林酸、吡咯酸，成为第1代氟喹诺酮类药物。由于抗菌谱窄，半衰期短，毒副作用和细菌抗药性等问题，现已很少用。20世纪70年代开发出了吡哌酸、氟喹酸等2代氟喹诺酮类药物。20世纪80年代出现了抗菌谱更广、抗菌作用更强的第3代氟喹诺酮类药物。其C-6位上有氟原子，C-7位上连接哌嗪基，亦称为6-氟喹诺酮或氟喹诺酮。发展至今，氟喹诺酮类已经发展到第4代。氟喹诺酮类药物主要对革兰氏阴性菌有强大的抗菌作用，对革兰阳性菌的作用较弱，临床上主要用于尿路、肠道感染、尿道炎及***炎，单纯性淋病，外用于治疗脓疱疮、毛囊炎、湿疹合并感染、外伤感染、癣病合并感染及其他化脓性皮肤感染等的治疗。

化妆品已经成为人民生活必不可少的消费品之一。与此同时，化妆品的安全性已日益成为广大消费者关注的问题。近几年，相关执法部门发现在祛痘类化妆品中发现有非法添加氟喹诺酮类药物的案例。氟喹诺酮类药物多具有广谱、高效、低毒等特点，因此应用较为广泛，但是氟喹诺酮类药物和其他抗菌药的作用点不同，它们以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再***。该类药物对幼年动物可引起软骨组织损害，故不宜用于妊娠期妇女和骨骼***未发育完全的小儿。同时该类药物对人体中枢神经***也会造成不良反应，使用含该类药物的化妆品会刺激皮肤，引起皮肤过敏反应，严重的甚至导致全身过敏。

目前，有关高效液相色谱法、液相色谱-质谱测定氟喹诺酮类药物的方法已有文献报道，但检测的对象主要是各类食品。对于化妆品而言，基质复杂多样，技术难度大，虽然仪器检测方法具有检测精确度高的优点，但其仪器化程度高，样品处理较复杂、检测费用高等，不适合用作大批样品的检测，免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、成本低的氟喹诺酮类药物残留检测试纸及其检测方法。

本发明所提供的检测氟喹诺酮类药物残留的试纸，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)和结合物释放垫(3)、反应膜(4)、吸水垫(5)和PVC底板(8)。

所述反应膜上有包被有氟喹诺酮类-载体蛋白偶联物构成的检测线(6)和包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线(7)，所述结合物释放垫(2)包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物。所述结合物释放垫(3)包被有氟喹诺酮类药物单克隆抗体，为抗氟喹诺酮类药物的单克隆杂交瘤细胞株CGMCCNo.5885分泌的单克隆抗体。所述的氟喹诺酮类药物单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCCNo.5885已于2012年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

上述反应膜上检测线处包被的氟喹诺酮类-载体蛋白偶联物由氟喹诺酮类半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的氟喹诺酮类单克隆抗体由氟喹诺酮类-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到的；所述兔抗羊抗抗体是将羊源抗体免疫兔得到的。

本发明中包被原、免疫原、单克隆抗体的合成过程为：

1.半抗原合成

(1)将诺氟沙星1～3mmol，溶于30～60ml三氯甲烷中，在脱水剂1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)的作用下，与氨基丙酸叔丁酯1～3mmol，室温搅拌1～5小时，得到诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物，将得到的缩合物进行水洗，并干燥，经硅胶柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚、二氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇或丙酮-石油醚洗脱剂洗脱纯化。

(2)将纯化后得到的诺氟沙星与对氨基本乙酸乙酯缩合物溶于甲醇中，加入NaOH，50～70℃搅拌0.5～2小时，进行酯水解反应，减压脱溶剂，得到粗品氟喹诺酮类半抗原即对羧甲基苯酰胺诺氟沙星，再将对羧甲基苯酰胺诺氟沙星溶于酸性溶液中，调节pH3～5，用萃取溶剂萃取，干燥，经硅胶柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚、二氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇或丙酮-石油醚洗脱剂洗脱纯化。

2.免疫原的合成

(1)取氟喹诺酮类半抗原用0.8mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冷却至10℃，得到溶液I。

(2)取氯甲酸异丁酯10μL加入溶液I中，10℃搅拌反应30分钟，得到溶液II。

(3)取30mL卵清白蛋白(OVA)用2.2mL浓度为50mmol/L的Na₂CO₃溶液溶解，再加入到溶液II中，在10℃下反应4小时，用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，即得到包被原。

3.包被原的合成

(1)取氟喹诺酮类半抗原15mg用1ml N，N二甲基甲酰胺(DMF)溶解，得到溶液I。

(2)取15mg碳化二亚胺(EDC)用0.2ml水充分溶解加入I中，室温下搅拌反应24小时，得到溶液II。

(3)取牛血清白蛋白(BSA)40mg使之充分溶解在3mLpH 7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24小时，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)于4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，即得包被原。

4.单克隆抗体的制备

动物免疫：氟喹诺酮类半抗原与载体蛋白偶联物免疫8-10周龄Bal b/c小鼠。

细胞融合与克隆化：取免疫后的Bal b/c小鼠脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在融合剂聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明提供了一种制备上述试纸的方法，主要包括如下步骤：

(a)制备包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物的结合物释放垫(2)；

(b)制备包被有氟喹诺酮类药物单克隆抗体的结合物释放垫(3)；

(c)制备具有包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线的反应膜；

(d)将(a)、(b)和(c)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和背衬组装成试纸。将上述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序黏贴在PVC底板上；结合物释放垫(2)叠放于结合物释放垫(3)之上，组成结合物释放垫部分，结合物释放垫部分从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫部分的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(T)和质控线(C)，检测线(T)线和质控线(C)线均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫部分的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫部分的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸，2～8℃条件下保存12个月。

本发明还提供了一种应用上述试纸检测氟喹诺酮类的方法，包括的步骤有：

(1)样品的前处理

霜状或乳状化妆品或化妆水：称取0.1g霜状或乳液状化妆品或0.1ml化妆水样品于离心管中，加入5mL 0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液，涡动样品至均匀状态，待检。

(2)用试纸检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴于加样孔，反应5～10分钟，判定结果。

(3)分析检测结果

本发明将氟喹诺酮类-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜上检测线处，结合物释放垫(2)包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物，结合物释放垫(3)包被有氟喹诺酮类药物单克隆抗体，在层析过程中样品中残留的氟喹诺酮类药物和反应膜上预包被的偶联抗原竞争氟喹诺酮类单克隆抗体和羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物的结合物，通过检测线是否显色判断样品中是否有氟喹诺酮类药物的残留，当检测线(T)和质控线(C)都显色时为阴性，当检测线不显色，质控线显色时为阳性，如图2。

阴性(-)：T线和C线都显色，表示样品中氟喹诺酮类浓度低于检测限，如图2(a)。

阳性(+)：T线无显色C线显色，表示样品中氟喹诺酮类浓度等于或高于检测限，如图2(b)。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸已变质失效，如图2(c)。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸重新测试。

本发明的氟喹诺酮类药物检测试纸结构中包括两个结合物释放垫，分别包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物和氟喹诺酮类药物单克隆抗体，本发明将胶体金标记在羊抗鼠抗抗体上，有效减少了标记胶体金时可能产生的空间位阻，提高了抗原-抗体结合效率，有效地提高了试纸的灵敏度。

试纸的检测结果存在不稳定的原因一部分是由于抗体-胶体金标记物干燥在结合物释放垫上后降解失效所致。本发明并通过改变胶体金标记物，将羊抗鼠抗抗体与胶体金标记物结合包被在结合物释放垫(2)上，将氟喹诺酮类药物抗体包被在结合物释放垫(3)上，有效地减少了由于抗体-胶体金标记物干燥在结合物释放垫上后降解所致试纸失效的问题发生，提高了试纸的稳定性。

以往专利文献中的氟喹诺酮类胶体金检测试纸检测的样本主要为食品，尚未见文献报道以胶体金免疫层析法检测化妆品中抗生素残留量，本发明的氟喹诺酮类药物检测试纸能够检测化妆品中氟喹诺酮类药物的残留量。化妆品基质复杂，本发明采用的样品前处理方法省时、简便，有效地降低了前处理工作量，整体地提高了检测效率，试纸具有特异性高、灵敏度高、操作简单、检测时间短等特点，能够对大批量样品进行定性筛查。

附图说明

图1：本发明试纸的组装示意图

图2：本发明的检测结果分析示意图

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例一氟喹诺酮类试纸的制备

1.氟喹诺酮类半抗原的制备

(1)将诺氟沙星1～3mmol，溶于30～60ml三氯甲烷中，在脱水剂1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)和催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)的作用下，与氨基丙酸叔丁酯1～3mmol，室温搅拌1～5小时，得到诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物，将得到的缩合物进行水洗，并干燥，经硅胶柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚洗脱纯化。

(2)将纯化后得到的诺氟沙星与对氨基本乙酸乙酯缩合物溶于甲醇中，加入NaOH，50～70℃搅拌0.5～2小时，进行酯水解反应，减压脱溶剂，得到粗品氟喹诺酮类半抗原即对羧甲基苯酰胺诺氟沙星，再将对羧甲基苯酰胺诺氟沙星溶于酸性溶液中，调节pH3～5，用萃取溶剂萃取，干燥，经硅胶柱层析纯化，洗脱剂为乙酸乙酯-石油醚洗脱纯化，得到羧甲基苯酰胺诺氟沙星，即氟喹诺酮类药物半抗原。分子结构如式I所示：

(式I)

2.免疫原的制备

(1)取氟喹诺酮类半抗原用0.8mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冷却至10℃，得到溶液I。

(2)取氯甲酸异丁酯10μL加入溶液I中，10℃搅拌反应30分钟，得到溶液II。

(3)取30mL卵清白蛋白(OVA)用2.2mL浓度为50mmol/L的Na₂CO₃溶液溶解，再加入到溶液II中，在10℃下反应4小时，用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液于4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，即得到包被原。

3.包被原的制备

(1)取氟喹诺酮类半抗原15mg用1ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，得到溶液I。

(2)取15mg碳化二亚胺(EDC)用0.2ml水充分溶解加入I中，室温下搅拌反应24小时，得到溶液II。

(3)取牛血清白蛋白(BSA)40mg使之充分溶解在3mL pH7.2的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，将溶液II逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24小时，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)于4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，即得包被原。

4.单克隆抗体的制备方法

动物免疫：用无菌pH7.0的PBS液将合成的免疫原(CL-BSA)溶解，然后按免疫原与弗氏佐剂(FCA)1∶3的比例充分乳化制成油乳剂疫苗。首次免疫用弗氏完全佐剂疫苗，对8-10周龄Balb/c小鼠进行免疫，颈背部皮下多点注射，免疫剂量为150μg/只。14天后二免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量同上；31天后加强免，不加佐剂，直接采用CL-BSA免疫。

表1免疫Balb/c小鼠时间表

细胞融合与克隆化：将产生氟喹诺酮类药物特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP20按8∶1比例混合，将混合好的细胞离心，倒干上清，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1min内加入1ml融合剂，融合剂为聚乙二醇(PEG)4000，作用1～3min，并轻轻搅拌细胞，在随后3min内加入20ml无血清的PEG营养液，1000rpm离心10min，弃上清。用20～50ml完全培养液重悬细胞，铺种于含饲养细胞96孔细胞培养板，每孔100μl。置培养箱中。待细胞长至孔底的1/2～1/3时，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞在检测后2天内采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到稳定的能够分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株-氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株CGMCCNo.5885。将此细胞株进行扩大培养和传代，可以无限量的产生氟喹诺酮类药物特异性单克隆抗体。

5.羊抗鼠抗抗体的制备

以鼠源抗体为免疫原，以羊为免疫动物，免疫原免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体。

6、兔抗羊抗抗体的制备

以羊源抗体为免疫原，以兔为免疫动物，免疫原免疫无病原体兔，得到兔抗羊抗抗体。

7.羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

(2)金标抗抗体的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入50～100μg羊抗鼠抗抗体的标准向胶体金溶液中加入上述羊抗鼠抗抗体，继续搅拌混匀30分钟，加入10％牛血清白蛋白(BSA)使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30分钟。12000rpm，4℃离心30min，弃上清液，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含牛血清白蛋白(BSA)0.1％～0.3％(体积百分含量)、吐温-800.05％～0.2％(质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

8.羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物包被到结合物释放垫(2)上

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)和pH7.2，0.5mol/L磷酸盐缓冲液中浸湿1小时，37℃烘3小时备用，用Isoflow喷膜仪将制备好的羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫(2)(2)上，每1cm结合物释放垫包被0.01ml羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60分钟后取出，置于干燥环境中保存备用。

9.氟喹诺酮类药物单克隆抗体包被到结合物释放垫(3)上

将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5％)和pH7.5，0.02mol/L磷酸盐缓冲液中均匀浸湿，37℃烘3小时备用，用Isoflow喷膜仪将稀释好的氟喹诺酮类药物单克隆抗体均匀包被在结合物释放垫(3)上，每1cm结合物释放垫包被0.005ml氟喹诺酮类药物单克隆抗体后，冷冻干燥，使抗体充分结合于结合物释放垫上2(3)上，置于干燥环境中保存备用。

10.反应膜的制备

将氟喹诺酮类-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线(6)，将兔抗羊抗抗体包被在反应膜上构成质控线(7)。

包被过程：用磷酸缓冲液将氟喹诺酮类-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μg/cm²；用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将兔抗羊抗抗体稀释到150μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μg/cm²。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2～3小时，备用。

11.样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH7.4、0.1mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2～3小时，37℃烘2～3小时备用。

12.试纸的组装

将上述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)(2)、结合物释放垫(3)(3)、反应膜(4)、吸水垫(5)依次按顺序从上到下黏贴在PVC底板(8)上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫(1)覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜(4)的始端连接，反应膜(4)的末端与吸水垫(5)的始端相连，样品吸收垫(1)的始端与PVC底板(8)的始端对其，吸水垫(5)的末端与PVC底板(8)的始端对齐；所述反应膜(4)上有检测线(6)和质控线(7)，检测线(6)也称为T线，质控线(7)也称为C线，检测线(6)和质控线(7)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线(6)位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线(7)位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸，4～30℃条件下保存12个月。

实施例二样品中氟喹诺酮类残留的检测

1.样品的前处理

霜状、乳状化妆品或化妆水或：称取0.1g霜状或乳液状化妆品或0.1ml化妆水样品于离心管中，加入5mL 0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液，涡动样品至均匀状态，待检。

2.用试纸检测

用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴于加样孔，反应5～10分钟，判定结果。3.分析检测结果

阴性(-)：T线和C线都显色，表示样品中氟喹诺酮类浓度低于检测限，如图2(a)。

阳性(+)：T线无显色C线显色，表示样品中氟喹诺酮类浓度等于或高于检测限，如图2(b)。

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸已变质失效，如图2(c)。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸重新测试。

实施例三样品检测实例

1.检测限试验

分别取空白霜状、乳状化妆品或化妆水样品，在空白霜状或乳状化妆品或化妆水样品中添加氟喹诺酮类药物恩诺沙星、双氟沙星、氟甲喹、达氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、环丙沙星分别至终浓度为1、2.5、5mg/kg(L)，添加环丙沙星、依诺沙星分别至终浓度为2.5、5、10mg/kg(L)，取试纸进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸检测霜状、乳状化妆品或化妆水样品时，当霜状、乳状化妆品或化妆水样品中氟喹诺酮类添加浓度为3μg/L时，试纸上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当猪尿样品中氟喹诺酮类药物恩诺沙星、双氟沙星、氟甲喹、达氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、环丙沙星添加浓度为2.5、5mg/kg(L)时，环丙沙星、依诺沙星添加浓度为5、10mg/kg(L)时试纸质控线显色，但检测线不显色，呈阳性，表明本试纸对霜状、乳状化妆品或化妆水样品中氟喹诺酮类药物检测限为恩诺沙星、双氟沙星、氟甲喹、达氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、环丙沙星分别为2.5mg/kg(L)；环丙沙星、依诺沙星分别为5mg/kg(L)。

2.假阳性率、假阴性率试验

取已知恩诺沙星含量大于2.5mg/kg(L)的霜状、乳状化妆品或化妆水阳性样品和阴性样品各20份，用三批试纸进行检测，计算其阴阳性率。结果见表2、表3。

表2检测阳性样品结果

表3检测阴性样品结果

结果表明：用3个批次生产的试剂盒检测阳性样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阴性率为0。检测20份阴性霜状、乳状化妆品或化妆水样品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。本发明的检测氟喹诺酮类药物试纸可以对氟喹诺酮类药物残留进行快速检测。

3.特异性试验

特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将常检的其他药物大环内脂类、磺胺类、氨基糖苷类、四环素类药物用pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释至终浓度均为50mg/L，用氟喹诺酮类药物试纸进行检测。结果显示，用该试纸检测大环内脂类、磺胺类、氨基糖苷类、四环素类药物时，试纸质控线和检测线均显色，说明本试纸对这些药物无交叉反应。

Claims (10)

1.一种检测氟喹诺酮类药物的试纸，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、结合物释放垫(3)、反应膜(4)、吸水垫(5)和PVC底板(8)，其特征在于所述反应膜上有包被有氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物构成的检测线(6)和包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线(7)，所述结合物释放垫(2)包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物，所述结合物释放垫(3)包被有氟喹诺酮类药物单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述的检测线上包被的氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物由氟喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。

3.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述的结合物释放垫(2)包被的羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物的羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；所述的结合物释放垫(3)包被的氟喹诺酮类药物单克隆抗体是由氟喹诺酮类药物半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原免疫动物获得；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体由杂交瘤细胞株CGMCCNo.5885分泌产生。

4.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述的包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线上的兔抗羊抗抗体是以兔作为免疫动物，以羊源抗体为免疫原对无病原体兔进行免疫，得到兔抗羊抗抗体。

5.如权利要求1或2所述的试纸，其特征在于所述的氟喹诺酮类半抗原的合成方法主要包括如下步骤：

(a)诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物的合成：

将诺氟沙星1～3mmol，溶于30～60ml三氯甲烷中，在脱水剂1，3-二环己基碳二亚胺和催化剂4-二甲氨基吡啶的作用下，与氨基丙酸叔丁酯1～3mmol，室温搅拌1～5小时，得到诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物。

(b)氟喹诺酮类半抗原的合成

将诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物溶于甲醇中，加入NaOH，50～70℃搅拌0.5～2小时，进行酯水解反应，得到碱性对羧甲基苯酰胺诺氟沙星，再将得到碱性对羧甲基苯酰胺诺氟沙星溶于酸性溶液中，调节pH3～5，得到氟喹诺酮类半抗原，结构见式1

(式1)。 

6.如权利要求6所述的试纸，其特征在于将步骤(1)所得到的诺氟沙星与对氨基苯乙酸乙酯缩合物，用无水Na₂SO₄干燥后，再上硅胶层析柱经过乙酸乙酯-石油醚、二氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇或丙酮-石油醚洗脱剂洗脱纯化。

7.如权利要求6所述的试纸，其特征在于将步骤(2)所得到的碱性对羧甲基苯酰胺诺氟沙星用HCL溶液酸化形成的溶液用乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮萃取，用无水Na₂SO₄干燥后，再上硅胶层析柱经过乙酸乙酯-石油醚、二氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇或丙酮-石油醚洗脱剂洗脱纯化。

8.如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述的结合物释放垫(2)叠放于结合物释放垫(3)之上，并且结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫之下。

9.一种制备权利要求1～8所述的试纸的方法，其包括步骤：

(a)制备包被有羊抗鼠抗抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

(b)制备包被有氟喹诺酮类药物单克隆抗体的结合物释放垫；

(c)制备具有包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有兔抗羊抗抗体构成的质控线的反应膜；

(d)将(a)、(b)和(c)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸。

10.一种检测化妆品中氟喹诺酮类药物的方法，是将待检样本进行前处理，用权利要求1～9所述的检测氟喹诺酮类药物的试纸进行检测，所述样本前处理方法为：

称取0.1g霜状或乳液状化妆品或0.1ml化妆水样品于离心管中，加入5mL 0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液，涡动样品至均匀状态，待检。 

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