CN103018453A

CN103018453A - 一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒

Info

Publication number: CN103018453A
Application number: CN2011102791437A
Authority: CN
Inventors: 万宇平; 罗贵昆; 杨秀贤; 韩锐; 扶胜; 冯月君; 文雪静; 孙倩倩
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: CN103018453B

Abstract

本发明公开了一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有包被抗原即诺氟沙星衍生物与载体蛋白的偶联物；所述试剂包括：喹诺酮类药物的单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、喹诺酮类药物系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液；本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有高灵敏度、简便快速、准确度高、检测药物种类多的特点，与传统的比色ELISA法比较，操作时间大幅度减少。可用作检测动物组织(猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼肉、虾肉)和蜂蜜中12种喹诺酮类药物残留检测。

Description

一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测喹诺酮类药物的化学发光免疫检测试剂盒，用于检测动物组织(猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝)、水产品(鱼、虾等)、蜂蜜中的喹诺酮类药物含量或残留量。属于免疫学检测领域。

背景技术

喹诺酮类抗菌药(4-quinolones)，又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类较新的合成抗菌药，该类药物的开发可以追溯到1962年，Lesher从合成抗疟药氯喹中分离出一种副产品-萘啶酸，喹诺酮类历经40多年的发展，共开发出了四代喹诺酮类药物，共计50多种药物。

喹诺酮类抗菌药以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶位，通过选择性的抑制细菌DNA促旋酶与拓扑异构酶IV而造成染色体的不可逆损害，而使细菌细胞不再***，主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱(某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用)。

喹诺酮抗菌药按发明先后及其抗菌性能的不同，分为一、二、三、四代，第一代喹诺酮类抗菌药的品种有萘啶酸(Nalidixic acid)和吡咯酸(Piromidic acid)等，第二代喹诺酮类抗菌药的品种有新恶酸(Cinoxacin)和甲氧恶喹酸(Miloxacin)等，第三代喹诺酮类抗菌药的品种有诺氟沙星(Norfloxaicin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Perfloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)和环丙沙星(Ciprofloxacin)等，***喹诺酮类抗菌药的品种有加替沙星(Gatifloxacin)与莫昔沙星(Moxifloxacin)等。

喹诺酮类药物可用于治疗呼吸道感染、泌尿生殖***感染、消化***感染及其他类的各种感染，还可用于抗肿瘤和抗病毒作用，但该类药物对人体也存在很大的不良反应，如胃肠道反应、中枢反应、可诱发癫痈、影响软骨发育、易产生结晶尿及易导致肝损伤等。

喹诺酮类药物残留分析通常包括：选用适当的溶剂提取，进一步利用液液萃取法、固相萃取法等进行净化、浓缩，最后用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)、高效毛细管电泳法(Capillary electrophorctic，CE)、液相色谱质谱联用技术(Liquidchromatography-mas spectrometry，LC-MS)等方法进行检测，有时还使用气相色谱法(Gaschromatography，GC)，高效薄层色谱法(High pefformancthinlay erchromatogram，HPTLC)，微生物法(Microbiological assay，MA)、免疫分析法(Immunoassay，IA)等测定。

目前的检测方法主要是仪器分析的方法，而酶联免疫分析方法，只能检测一种或者几种药物，对于种类较多的喹诺酮类药物还远远不能达到同时检测多残留的要求。酶联免疫试剂盒因为操作简单，省时，是各个国家检测兽药残留的首选方法。化学发光免疫检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6～18个月)等优点，其检测限比酶联免疫法和理化检测方法高几个数量级。化学发光底物液是化学发光酶免疫检测方法的关键试剂，配制出低成本且性能良好，适合国产仪器使用的的发光底物液，可降低化学发光方法的使用成本，有利于在基层的普及。建立稳定的化学发光酶免疫分析方法，也是进行商品化学发光试剂盒的研制的基础。建立喹诺酮类药物多残留化学发光酶联免疫检测试剂盒检测方法对于于严把食品安全的检验环节有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、应用灵活、方便的特点。

一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有以喹诺酮类药物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：喹诺酮类药物的单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体、喹诺酮类药物系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。

所述酶标板优选乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

所述酶标板的各孔包被有以喹诺酮类药物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；其中所述包被抗原浓度优选20.0μg/mL。

所述喹诺酮类药物系列标准溶液从喹诺酮类纯品中稀释得到，稀释液为含有10％甲醇的0.05m mol/L，pH＝7.4的PBS，喹诺酮类标准品浓度分别是0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL，所述百分比为体积百分比。

所述酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，其工作浓度优选为1∶2000。

所述喹诺酮类药物抗体是由诺氟沙星衍生物与牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫动物制得的单克隆抗体，其工作浓度优选为1∶32000。

所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。所述鲁米诺为化学发光底物，对甲苯酚为发光增强剂。

所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g的水溶液；

所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠的溶液(CB)，pH＝9.5。

所述封闭溶液是每升洗涤溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也称鸡卵清白蛋白或鸡卵白蛋白，由385个氨基酸残基组成，分子量约45kDa)且加入质量为5‰NaN₃的溶液，所述百分比为质量百分比。

本发明溶液的配制：

本发明试剂盒中涉及的喹诺酮类药物标准溶液、酶标羊抗鼠抗体溶液、喹诺酮类药物抗体溶液、化学发光溶液及洗涤溶液及其配方对本发明试剂盒检测的灵敏度影响很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、喹诺酮类药物标准溶液：以常规方法将喹诺酮类药物纯品用含有10％甲醇的0.05mmol/L，pH＝7.4的PBS配制成浓度分别为0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL的喹诺酮类药物标准溶液，所述百分比为体积百分比。

2、酶标羊抗鼠抗体溶液：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用时用洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度。

3、喹诺酮类药物抗体溶液：喹诺酮类药物抗体是用人工免疫抗原免疫动物制得的单克隆抗体，将所得喹诺酮类药物抗体用洗涤溶液稀释成1∶32000的工作浓度。

4、化学发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。

5、浓缩磷酸盐缓冲液：NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g溶于1L的去离子水中。

6、浓缩洗涤溶液：按体积分数0.05％将吐温-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液中。

7、包被溶液：1.59g碳酸钠和2.53g碳酸氢钠溶于1L水中，调节pH＝9.5。

8、封闭溶液配制：10g OVA溶于1L洗涤溶液中，再加入重量比为5‰的NaN₃。

本发明酶标板的包被：

本发明中包被酶标板采用将喹诺酮类药物-OVA偶联物置于设定的包被溶液中，以设定的浓度，在37℃恒温箱中反应包被。

本发明采用的是pH＝9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液。本发明中微孔板中所包被的喹诺酮类药物-OVA在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，可以经受多次洗板，采用的包被抗原浓度为20.0μg/mL。

包被好的微孔板可以用封闭溶液封闭，封闭液中惰性蛋白优选OVA，需加入NaN₃防止变质。

喹诺酮类药物抗体溶液和酶标羊抗鼠抗体溶液的制备：

本发明中喹诺酮类药物抗体溶液、酶标羊抗鼠抗体溶液浓度是决定本发明中喹诺酮类药物酶联免疫测试试剂盒测定范围及灵敏度的重要因素。

本发明中涉及的喹诺酮类药物抗体溶液可以用洗涤溶液稀释成1∶32000的工作浓度。

本发明中涉及的酶标羊抗鼠抗体溶液优选用洗涤溶液配制的浓度为1∶2000。

按照上述喹诺酮类药物抗体溶液浓度和酶标羊抗鼠抗体溶液浓度制备的试剂盒可以达到很好的线性范围(标准线范围可以达到0ng/mL～8.1ng/mL)和很好的灵敏度(0.1ng/mL)。化学发光溶液的配制：

本发明采用辣根过氧化酶标记底物发光***，主要是鲁米诺-过氧化氢***。

本发明的原理是将抗体-抗原反应的高度特异性与酶催化的高度灵敏性结合起来，利用酶催化底物的化学发光反应检测产物浓度。

本发明的化学发光酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。有望在动物性食品(如水产品、动物组织、蜂蜜)中的喹诺酮类药物残留检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为诺氟沙星衍生物合成反应式。

图2为本发明化学发光反应式。

图3为本发明喹诺酮类药物抗体的工作曲线。

具体实施方式

实施例1：衍生物、免疫原、包被原及单克隆抗体的制备

(1)诺氟沙星衍生物合成

A，将诺氟沙星1mmol，溶于15mL三氯甲烷中，加入DCC2mmol，DMAP催化量，氨基丙酸叔丁酯1.5mmol，室温搅拌5h，TLC监测原料消失，过滤，将液相水洗，无水NaS2O4干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/5)。

B，将上述产物溶于冰醋酸中，室温搅拌2h，TLC监测原料消失，减压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于1mol/LNaOH溶液，调节pH3～5，乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/1)，得喹诺酮类半抗原。

(2)免疫原的合成

A，A液制备：取15mg诺氟沙星半抗原，溶解于1mL DMF中，取15EDC用0.2ml水充分溶解后于加入溶解有半抗原的DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。

B，BSA偶联：称取BSA40mg，使之充分溶解在3mL PBS(PH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，

C，透析：用0.01mol/lPBS 4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

称取半抗原20mg和OVA 30mg，按上述步骤反应，包被抗原，供包被用。

(3)喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

A，动物免疫：用上述制备出的免疫原(QNS-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

B，细胞融合：按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后在45秒内缓慢加入预热的融合剂(PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO₂培养箱中培养，5天后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。

C，杂交瘤细胞的筛选：细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原(预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和阳性血清稀释度)包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清与100μg/mL的诺氟沙星等体积混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同时用PBS取代诺氟沙星作对照，其余步骤同上。若经诺氟沙星阻断后的OD₄₅₀nm值下降到对照孔的50％以下，则判为阳性，经2～3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。

D，单克隆抗体制备：将2～3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；并取8～10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7～10日后腹腔注射杂交瘤细胞l～2×10⁶/只，7～10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。

实施例2：ELISA检测方法的建立

(1)抗体与包被抗原浓度的优选(方阵)

纵向用每种包被抗原按80.0μg/mL，40.0μg/mL，20.0μg/mL，10.0μg/mL，5.0μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL的系列稀释度包被酶标板，100μL/孔，置于37℃恒温箱2h后，拍干；以150μL/孔封闭溶液封闭，37℃恒温箱放置2小时，洗板一次，拍干；加入50μL/孔一系列稀释的抗体(1∶1000至1∶512000)，再加入50μL/孔的1∶2000的辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG抗体，室温(20～25℃)孵育15min，洗板五次，最后一次拍干；加入100μL/孔的化学发光液，测定发光强度值。以发光强度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。

(2)抗体灵敏度的测定

根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，申请人选择并确定抗体浓度为1∶32000，包被抗原浓度为20.0μg/mL进行抗体的灵敏度的测定：

A，包被：用0.05M pH＝9.6的碳酸盐包被溶液将包被抗原配成20.0μg/mL的溶液，每个聚苯乙烯板的反应孔中加100μL，37℃恒温箱2h。弃去孔内溶液，拍干。

B，封闭：用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，150μL/孔，37℃恒温箱2h然后洗板一次，拍干。

C，加样：加不同浓度的喹诺酮类药物溶液50μL/孔，再加入50μL/孔以稀释的喹诺酮类单克隆抗体((1∶32000)与用洗涤溶液配制成的酶标羊抗鼠抗体工作液(1∶2000)按体积比10∶1比例配置的酶-抗体溶液于以上述已封闭的反应孔中，室温(20～25℃)避光孵育15min，然后洗板五次，最后一次拍干。

D，发光：于各反应孔中加入临时配制的化学发光溶液100μL/孔，反应3min后用化学发光免疫分析仪检测。

E，检测结果以抑制率计算：

相对发光强度(％)＝RLU/RLU₀，RLU是标准品或者样品溶液测定的发光强度值，RLU₀是空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。

计算50％抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。

实施例3：检测喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫试剂盒

(1)检测喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫试剂盒的组成

A，包被有包被原(QNS-OVA)的固相载体(酶标板)；

B，喹诺酮类药物标准溶液：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL。

C，酶标羊抗鼠抗体溶液：酶标羊抗鼠抗体为辣根过氧化酶-羊抗鼠IgG原液，装入，使用时用洗涤溶液配制成1∶2000的工作浓度。

D，喹诺酮类药物抗体溶液：用人工免疫抗原(QNS-BSA)免疫动物制备所得的单克隆抗体，将所得喹诺酮类药物抗体用洗涤溶液稀释成1∶32000工作浓度。

E，发光溶液：A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液，B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液。

F，浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g的水溶液G，浓缩洗涤溶液：含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

(2)酶标板的制备

用包被液将包被抗原稀释成20.0μg/mL，每孔加入100μL，37℃恒温箱放置2h，倾去包被液，拍干，然后每孔加入封闭液150μL，37℃恒温箱放置2h，倾去孔内液体，洗涤液洗涤一次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例4：检测喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫试剂盒的应用

(1)试剂的配制

A，洗涤溶液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用去离子水按1∶19倍稀释后使用。

B，磷酸盐缓冲液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用去离子水按1∶1倍稀释后使用。

C，化学发光溶液：使用前将A液与B液按体积比1∶1混匀。

(2)样品前处理

A，动物组织(猪肉、鸡肉)：

——用均质器均质组织样本；

——称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中；

——加入0.6mL 0.1M盐酸溶液，再加入5.4mL无水乙腈中混合均匀；振荡3min，3000g以上，室温(20～25℃)离心10min；

——取上层有机相1mL至10mL干净玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加入1mL磷酸盐缓冲液涡动20s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层正己烷，取下层50μL用于分析。

B，水产品(鱼肉、虾肉)：

——取2.0±0.05g均质样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入1mL 0.1M盐酸溶液，再加入5mL乙腈，立即用振荡3min；3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——取1mL上清液于10mL玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；

——加入1mL正己烷用涡旋仪涡动30s，再加入1mL磷酸盐缓冲液，涡动20s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——除去上层有机相，取下层50μL用于分析。

C，肝脏(猪肝、鸡肝)：

——取2.0±0.05g均质样本至50mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL 3％NaCL，再加入2mL甲醇，涡动30s，3000g以上，室温(20～25℃)离心5min；

——取上层清液200μL与600μL磷酸盐缓冲液混匀；

——取50μL用于分析。

D，蜂蜜：

——称取蜂蜜样本1.0±0.05g至10mL聚苯乙烯离心管中；

——加入1mL去离子水，涡动混匀5min，使其充分溶解；

——取100μL与900μL磷酸盐缓冲液稀释，涡动混匀1min；

——取50μL用于分析。

(3)检测步骤

A，加样：向酶标板微孔中加入喹诺酮类药物系列标准浓度溶液或样品溶液50μL，然后每孔加入酶标羊抗鼠抗体溶液50μL，再加入喹诺酮类药物抗体溶液50μL，室温(20～25℃)恒温孵育15min；

B，洗涤：倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液250μL，洗涤5次，拍干；

C，加发光溶液：每孔加入发光溶液100μL，反应3min；

D，检测：用化学发光免疫分析仪测定每孔的发光强度。

(4)结果判断

所获得的标准品和样品发光强度值的平均值除以第一个标准(0标准)的发光强度值再乘以100，以抑制率为纵坐标，喹诺酮类药物浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。

实施例5：试剂盒特异性试验

以环丙沙星作为标准，设环丙沙星的交叉反应率为100％，用于抗体交叉反应性研究的药物均为与环丙沙星结构或者功能相似的喹诺酮类药物：环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、依诺沙星、恶喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星。按试剂盒程序操作，但加入的竞争物分别为不同的喹诺酮类类似物，制作抑制曲线，根据线性方程计算各竞争物50％抑制浓度(IC₅₀)。交叉反应率(％CR)即为抗体对环丙沙星的IC₅₀与抗体对氟喹诺酮类竞争物的IC₅₀之比的百分数，按下式进行计算：

结果列于表1：

表1喹诺酮类药物试剂盒特异性试验

竞争物	IC₅₀(ng/mL)	交叉反应率(％)
			环丙沙星	0.222	100.0
恩诺沙星	0.267	83.0
			氧氟沙星	0.222	100.0
达氟沙星	0.296	75.0
			诺氟沙星	0.140	158.6
洛美沙星	0.308	72.0
			培氟沙星	0.131	169.0
依诺沙星	0.267	83.2
			恶喹酸	0.244	91.0
氟甲喹	0.304	73.0
			麻保沙星	0.257	86.4
氨氟沙星	0.222	100.0
			双氟沙星	222.000	＜0.1
沙拉沙星	246.667	＜0.1

实施例6：试剂盒精密度和准确度试验

分别以不同的喹诺酮类药物添加猪肉、鸡肉、猪肝、鸡肝、鱼肉、虾肉和蜂蜜样本进行添加回收试验，计算不同药物在不同样本中得回收率，从而确定试剂盒的准确度，每个样本添加1个浓度，每个浓度添加6个样本，抽取3个批次试剂盒进行试验。

根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算，结果见下表2。

表2喹诺酮类药物试剂盒准确度试验

从上述测定结果看，猪肉样本的回收率在75.2～95.0％之间、鸡肉样本的回收率在80.3～89.9％之间、猪肝样本的回收率在80.0～99.7％之间、鸡肝样本的回收率在76.3～94.9％之间、鱼肉样本的回收率在80.2～109.9％之间、虾肉样本的回收率在80.2～109.7％之间、蜂蜜样本的回收率在70.8～89.5％之间。总体回收率在70～110％之间，表明本试剂盒有很好的准确度。

Claims

1.一种喹诺酮类药物的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂；其特征在于，所述酶标板的各孔包被有以诺氟沙星衍生物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：喹诺酮类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。

2.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。

3.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述包被抗原浓度为20μg/mL。

4.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述喹诺酮类单克隆抗体的工作浓度为1∶32000。

5.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述喹诺酮类的单克隆抗体是由诺氟沙星衍生物与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。

6.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述喹诺酮类系列标准溶液浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL。

7.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH₂PO₄·2H₂O 5.74g、Na₂HPO₄·12H₂O 32.6g的水溶液。

8.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液.

9.根据权利要求1所述喹诺酮类的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001M pH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na₂HPO₄2.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液，所述百分比为质量百分比。