CN103320487B - 一种可溶性酶与固定化酶联合水解制备海参肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可溶性酶与固定化酶联合水解海参制备海参肽的方法，其特征在于步骤如下：新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆后与水等体积混合，加入可溶性碱性蛋白酶进行酶解，然后滤除残渣，转入固定化酶反应器中，采用固定化中性蛋白酶与木瓜蛋白酶进行酶解，酶解液再经过滤、超滤、脱腥和浓缩后得到海参肽。该方法首先可溶性碱性蛋白酶对海参进行初步酶解，使不溶性的海参蛋白溶解于水相，滤除残渣后再采用固定化酶进行深度酶解，显著地增大了固定化酶与底物的接触面积，加快了反应速度，同时避免不溶性固形物黏附于固定化酶颗粒，固定化的蛋白酶可从反应体系中回收后重复使用5～10次，极大地降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程和生物技术领域，具体地说是一种可溶性酶与固定化酶联合水解制备海参肽的方法。
背景技术
海参素有“海中人参”之称，富含蛋白质，是典型的低脂肪、极低胆固醇、富含矿物质和维生素的优质食品。海参肽系指海参经蛋白酶水解后得到的以小分子肽为主、多种功效成分共存的水解产物，其中肽以2～10个氨基酸组成的小分子肽为主，分子量低于2000Da的组分占80%以上；除肽外，还含有少量游离氨基酸、粘多糖、硫酸软骨素以及钙、铁、钒等多种微量元素。水解后海参蛋白被转化为更易吸收、生理功能更强的小分子肽，比传统海参制品具有更高的营养价值。
目前，海参肽的生产主要是采用可溶性蛋白酶进行水解。食品级蛋白酶价格高、用量大，无法回收与重复使用，生产成本高。同时，多种酶可溶性蛋白酶共同使用时，虽可提高水解度，但不同蛋白酶间存在相互水解的现象，酶活力损失严重，影响酶解效果，增加生产成本。
与可溶性酶相比，固定化酶稳定性强，不溶于水，可回收后重复使用；但直接采用固定化蛋白酶水解时，因海参浆粘稠，海参蛋白可溶性差，不能进入固定化酶内部，酶与底物接触机率低，如果海参浆直接采用固定化酶进行水解，不仅水解速度慢、产品收率低，而且固定化酶与残渣分离困难，无法回收后重复使用。
本发明所述的可溶性酶与固定化酶联合水解的方法，可以解决上述难题，降低生产成本。目前国内外尚无可溶性酶与固定化酶联合水解海参制备海参肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可溶性蛋白酶与固定化蛋白酶联合水解海参制备海参肽的方法，该方法首先采用可溶性蛋白酶水解海参，使不溶性的海参蛋白水解后可溶于水，滤除残渣后再采用固定化蛋白酶继续水解至分子量2000Da以下，获得海参肽。固定化蛋白酶可以方便的回收后进行重复利用5～10次，减少了蛋白酶的消耗量，降低了生产成本。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种可溶性酶与固定化酶联合水解制备海参肽的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）新鲜海参的预处理后磨浆；
（2）海参原浆与去离子水混合，搅匀，加热，使海参浆中的蛋白质适度变性，冷却，后加入可溶性碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后，滤除残渣，得到澄清滤液；
（3）澄清滤液转入固定化酶反应器继续进行酶解，酶解结束后，放出酶解液，固定化酶截留在反应器中重复使用；
（4）酶解液再经过滤、超滤、脱腥与浓缩后得到海参肽溶液。
本发明所述步骤（1）具体操作为：新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆，得到海参原浆。
本发明所述步骤（2）的具体操作为：将海参原浆与去离子水1:1混合，90～100℃加热10～15min，使蛋白变性，然后冷却至50~55℃，加入可溶性碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后，滤除残渣，得到澄清的滤液。
本发明所述可溶性碱性蛋白酶的用量为500～1000u/g海参原浆，酶解条件为pH8.0～9.0、酶解温度50～55℃、酶解时间1.5～2h。
本发明所述固定化蛋白酶为固定化中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。
优选的，所述固定化中性蛋白酶的用量为400～600u/g海参原浆，固定化木瓜蛋白酶的用量为320～480 u/g海参原浆。
进一步优选的，所述固定化蛋白酶中，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为（1～2 ）：1 。
所述固定化蛋白酶的制备方法如下：将蛋白酶以8～12%(w/w)的浓度溶于水中，滤去残渣，再加入8～12%（v/v）的保护剂，然后与5～7%(w/w)海藻酸钠溶液等体积混均，再逐滴滴入2～4%(w/w)的氯化钙溶液中，凝结成微球，两种蛋白酶可以分别固定化后再共同使用，也可以先混配成复合蛋白酶再进行固定化。
所述保护剂为甘露醇。
所述固定化酶的酶解条件为45~50℃，pH6.0~7.0，水解时间为，3~4h。
本发明所述步骤（4）的具体操作为：酶解液采用过滤或离心的方法进行固液分离，去除少量不溶性残渣，清液采用截断分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，截留液返回固定化酶反应器继续酶解，透过液经活性炭吸附脱腥后，于70～80℃进行真空浓缩，真空度为0.06～0.08MPa，浓缩倍数为2～3倍。
本发明的有益效果是：
1）本发明使用可溶性碱性蛋白酶与固定化蛋白酶联合水解海参进而制备海参肽，固定化酶可以回收后重复使用5～10次，降低了生产成本。
2）采用可溶性碱性蛋白酶对海参进行初步水解，可降低海参浆的粘度，增加海参蛋白的可溶性，将其转入水相，滤除固态残渣后再采用固定化酶进行水解，可增大固定化酶与底物接触面积，提高反应速度，同时避免不溶性杂质堵塞固定化酶颗粒的内部孔道。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明：
以下实施例所用海参产地为山东威海，所用可溶性粉碱性蛋白酶（酶活力为2×105 u/g）与固定化中性蛋白酶（酶活力为1.3×105 u/g）均购自泰安信得利生物工程公司；木瓜蛋白酶（酶活力为2×105 u/g）购自南宁东恒华道生物科技有限公司。
实施例1
（1）称取中性蛋白酶（1.3×105 u/g）10g，溶于90～110mL水中，充分搅拌，滤去残渣，再加入9～11mL甘露醇，然后与5～7%(w/w)海藻酸钠溶液等体积混合，用蠕动泵将混合液于3～5cm高度逐滴滴入2～4%(w/w)的氯化钙溶液中，得到颗粒均匀、形状规则的海藻酸钠微球，即为固定化中性蛋白酶。
（2）称取木瓜蛋白酶（2×105 u/g）5g，溶于40～60mL水中，充分搅拌，滤去残渣，再加入4.5～5.5mL甘露醇，然后与5～7%(w/w)海藻酸钠溶液等体积混合均匀，用蠕动泵将混合液于3～5cm高度逐滴滴入2～4%(w/w)的氯化钙溶液中，得到颗粒均匀、形状规则的海藻酸钠微球，即为固定化木瓜蛋白酶。
（3）上述蠕动泵的乳胶管终端所接喷淋头上的小孔内径为0.6～0.8mm。
（4）新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆，即为海参原浆；称取2600g海参原浆，置于10L的酶解罐中，加入2600mL去离子水，搅拌均匀；向夹套中通入蒸汽升温至90～100℃，维持10～15min使蛋白质适度变性，然后冷却至50～55℃，调节pH值至pH8～9；
（5）加入9～11g的可溶性碱性蛋白酶（2×105u/g），于50～55℃恒温水解1.5h～2h，其作用是将不溶于水的海参蛋白初步分解，使其溶于水中，转入水相；
（6）采用布氏漏斗进行真空抽滤，获得澄清的滤液，所用布氏漏斗中铺2层中速滤纸，并预铺4～6mm厚的硅藻土滤层；
（7）将滤液转入10L搅拌罐式固定化酶反应器中，加入（1）与（2）所制备的固定化中性蛋白酶与木瓜蛋白酶，20～30rpm搅拌下于45～50℃酶解3~4h；
（8）酶解结束后，将酶解液从固定化酶反应器中放出，固定化酶被截留在反应器中重复使用，所放出的酶解液再采用预铺有4～6mm厚的硅藻土滤层的布氏漏斗进行抽滤，除去少许浑浊物，得到澄清的酶解液；
（9）酶解液采用截断分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，截留液返回固定化酶反应器继续酶解，透过液采用活性炭吸附法脱腥，然后于70～80℃、真空度0.06～0.08MPa的条件下真空浓缩2～3倍，即为海参肽溶液。
(10) 本实施例所生产的海参肽溶液澄清透明，浅褐色至褐色，具有轻微海参特有的腥味，其理化指标如下：总氮0.3~0.5g/100g，肽含量1.5~2.5g/100g，相对分子质量小于2000Da的肽段的比例≥85%。
实施例2
（1）将中性蛋白酶（1.3×105 u/g）与木瓜蛋白酶（2×105 u/g）按2：1（w/w）的比例混配成复合蛋白酶；
（2）称取15g复合蛋白酶，以8～12%的浓度溶于水中，充分搅拌，滤除残渣，留取酶液，加入8～12%（v/v）的甘露醇，混合均匀后与5～7%(w/w)海藻酸钠溶液等体积充分混合，用蠕动泵于3～5cm高度逐滴滴入2～4%(w/w)的氯化钙溶液中，得到颗粒均匀、形状规则的海藻酸钠微球，即为固定化复合蛋白酶；
（3）上述蠕动泵的乳胶管终端所接喷淋头上的小孔直径为0.6～0.8mm；
（4）新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆，得到海参原浆；称取2600g海参原浆，置于10L的酶解罐中，加入2600mL去离子水，搅拌均匀，向夹套中通入蒸汽升温至90～100℃，维持10～15min使蛋白质适度变性，然后冷却至50～55℃，调节pH值至pH8～9；
（5）加入9～11g的可溶性碱性蛋白酶（2×105u/g），于50～55℃恒温水解1.5h～2h，其作用是将不溶于水的海参蛋白初步分解，使其溶于水中，转入水相；
（6）采用离心机进行固液分离，转速3500～4000rpm，时间10～20min，弃去沉渣，留取上清液；
（7）将上清液转入10L搅拌罐式固定化酶反应器中，加入（2）所制备的固定化复合酶，20～30rpm搅拌下于45～50℃酶解3~4h；
（8）酶解结束后，将酶解液从固定化酶反应器中放出，固定化酶被截留在反应器中重复使用，所放出的酶解液再采用预铺有4～6mm厚的硅藻土滤层的布氏漏斗进行抽滤，除去少许浑浊物，得到澄清的酶解液；
（9）酶解液采用截断分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，截留液返回固定化酶反应器继续酶解，透过液采用活性炭吸附法脱腥，然后于70～80℃、真空度0.06～0.08MPa的条件下真空浓缩2～3倍，即为海参肽溶液；
(10) 本实施例所生产的海参肽溶液澄清透明，浅褐色至褐色，具有轻微海参特有的腥味，其理化指标如下：总氮0.3~0.4g/100g，肽含量1.5~2.0g/100g，相对分子质量小于2000Da的肽段的比例≥80。
Claims (1)
1.一种可溶性酶与固定化酶联合水解制备海参肽的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆，即为海参原浆，海参原浆与去离子水混合，搅匀，加热，使海参蛋白变性，冷却，冷却后采用可溶性碱性蛋白酶进行酶解，然后滤除残渣，得到澄清滤液；
（2）将澄清滤液转入固定化酶反应器中，加入固定化蛋白酶继续进行酶解；
（3）酶解结束后，酶解液经过滤、超滤、脱腥与浓缩后，得到海参肽溶液；
其中，步骤（1）具体操作为：新鲜海参吐净泥沙后，去除内脏，切成小块，磨浆，即为海参原浆；海参原浆与去离子水1：1混匀，加热至90～100℃维持10～15min，使海参蛋白适度变性，冷却后，加入可溶性碱性蛋白酶进行酶解，酶解结束后滤除残渣，得到澄清滤液，所述每克海参原浆加入所述可溶性碱性蛋白酶500～1000u，酶解条件为pH8.0～9.0，50～55℃，时间0.5～1h，
步骤（2）所述固定化蛋白酶为固定化中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分别固定化后共同使用，或将所述中性蛋白酶和木瓜蛋白酶按2:1 w/w的比例混合 ，所述固定化中性蛋白酶的用量为400～600u/g海参原浆，固定化木瓜蛋白酶的用量为320～480u/g海参原浆，
步骤（3）所述的具体操作为：酶解结束后，将酶解液从固定化酶反应器中放出，固定化酶被截留在反应器中重复使用；所放出的酶解液再采用预铺有4～6mm厚的硅藻土滤层的布氏漏斗进行抽滤，除去少许浑浊物，得到澄清滤液；滤液采用截断分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，截留液返回固定化酶反应器继续酶解，透过液采用活性炭吸附法脱腥后，于70～80℃进行真空浓缩，真空度为0.06～0.08MPa，浓缩倍数为2~3倍，
所述固定化蛋白酶的制备方法如下：将蛋白酶以8～12%w/w的浓度溶于水中，滤去不溶性载体残渣，加入8～12%v/v的保护剂，然后与5～7%w/w的海藻酸钠溶液等体积混均，再逐滴滴入2～4%w/w的氯化钙溶液中，凝结成微球，所述保护剂为甘露醇。
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