CN106831986B - 一种抗人her2抗体及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗人HER2抗体，其重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GSISSSNWWS、EIYHSGSTNYNPSLKS、MGANSGGYLYGMDV；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：GLSSGSVSTSYYPS、STNTRSS、VLYMGSGIWV。本发明还提供了一种抗人HER2抗体的编码基因以及包含该编码基因的重组质粒和表达***。本发明的抗HER2抗体能用于检测表达HER2的细胞，也可以用于治疗人体疾病；全人源抗HER2抗体，亲和力高，能特异结合HER2，有效预防和***疾病。

Description

一种抗人HER2抗体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗人HER2抗体及其编码基因和应用。

背景技术

人表皮生长因子受体ErbB/HER蛋白家族是受体络氨酸激酶(Receptor TyrosineKinase，简称RTK)中的一组。它们对细胞的生长、分化和生存起着非常重要的作用。该组包括四个成员：人表皮生长因子受体EGFR(又称ErbB1或HER1)、HER2(又称ErbB2或c-neu)、HER3(又称ErbB3)和HER4(又称ErbB4或tyro2)。

由erbB1基因编码的EGFR在表达水平变异的情况下与肿瘤发生相关联。在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、头颈癌等肿瘤中，EGFR均有较高的表达水平。研究发现，这些肿瘤细胞EGFR的高表达又与同类肿瘤细胞所产生的EGFR配体(ligand)和TGF-α的高表达有关。这种自分泌的信号又刺激EGFR传导通路使得肿瘤细胞进一步生长。多种抗EGFR或其配体的单克隆抗体对此类肿瘤有一定的疗效。

ErbB/HER蛋白家族的第二个成员是HER2。该蛋白首先发现于大鼠的成神经细胞瘤(neuroblastoma)，是大鼠原癌基因(proto-oncogen)neu基因的产物。后来发现人的neu基因产物在乳腺癌和卵巢癌中有很高的表达，而且预后效果甚差。随后，研究人员发现HER2的高表达常常与该基因的扩增有关。HER2高表达与其他肿瘤也有关，如：胃癌、肺癌、肾癌、肠癌、胰腺癌、膀胱癌等等。

除了EGFR和HER2外，科技人员在进一步研究后又发现了二个HER受体家族的成员，即HER3和HER4。这二个受体在乳腺癌细胞系中也有高表达。

上述HER受体家族的成员常以不同的组合在细胞中出现。不同的组合可以增加对多种HER配体的结合，以此增加细胞的多样性。例如，EGFR有六种配体：EGF、TGF-α、HB-EGF、amphiregulin、betacellulin和epiregulin等。EGF和TGF-α虽然不直接与HER2结合，但EGF可以刺激EGFR与HER2形成异性二聚体，进一步激活EGFR使异性二聚体的HER2得到反式磷酸化。二聚体内的HER2在被磷酸化后得到激活。

Hudziak等获得多个鼠源的抗HER2抗体，并用人乳腺癌细胞系SK-BR3进行了研究。结果发现，抗HER2单克隆抗体4D5具有很强的抑制人乳腺癌细胞系SK-BR3细胞生长的特性。该单克隆抗体还能使HER2高表达的乳腺肿瘤细胞增加对TNF-α细胞毒性的敏感性。

鼠源的抗HER2抗体4D5经过人源化处理后的抗体rhuMAb HER2(又称huMAb4D5-8，或曲妥珠单抗Trastuzumab，商品名“赫赛汀”HERCEPTIN.RTM.；美国专利号US5821337)在临床上对一部分HER2高表达的乳腺癌病人取得治疗效果，同时也发现对许多同样是HER2高表达的乳腺癌病人没有临床效果。

因此，开发了另一个人源化后的鼠源单克隆抗体rhuMab 2C4(又称Pertuzumab)可以抑制HER2与其他HER受体成员的结合形成异性二聚体，进而抑制由配体引起的磷酸化及下游RAS和AKT通路的激活。在Pertuzumab的临床试验和临床应用中对一部分病人产生一定效果，而对多数HER2高表达的乳腺癌病人同样没有临床效果。

此外，由于Trastuzumab和Pertuzumab抗体药物均源自小鼠单克隆抗体。虽然经过人源化处理，但依然有部分病人对该二种人源化后的抗体药物产生一定的免疫反应副作用，即HAMA反应。

因此，能获得全人源抗HER2的抗体对于HER2高表达引起的乳腺癌治疗和减少免疫反应副作用显得非常有意义。

发明内容

本发明提供了一种抗HER2的抗体，该抗体为全人源抗HER2抗体，与HER2具有高亲和力，能用于检测和治疗人体疾病。

抗人HER2抗体，其重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GSISSSNWWS、EIYHSGSTNYNPSLKS、MGANSGGYLYGMDV；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：GLSSGSVSTSYYPS、STNTRSS、VLYMGSGIWV。

CDRH1位于重链可变区第27～36位，CDRH2位于重链可变区第51～66位，CDRH3位于重链可变区第99～112位；

CDRL1位于轻链可变区第23～36位；CDRL2位于轻链可变区第52～58位，CDRL3位于轻链可变区第91～100位。

在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区(CDR)，不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。

抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

抗体为全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述全抗体为IgG型。所述的全抗体优选为IgG1型；所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体，更优选为单链抗体。

抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用；其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。

抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发明抗HER2单链抗体的制备方法为：采用公开号为CN 201510415116.6的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗HER2抗体。

本发明还提供了所述抗HER-2抗体的编码基因，抗体的重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供了含有所述编码基因的重组载体或表达***。所述重组载体的原始载体为pET27b或全长抗体表达载体。

本发明还提供了所述抗人HER2抗体在检测HER2表达细胞中的应用

本发明还提供了所述抗HER2抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明抗HER2抗体能特异地结合HER2蛋白。其中，利用全长重组的人源抗HER2抗体能检测表达HER2的细胞，也可预防和***疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的抗HER2抗体是能用于检测表达HER2的细胞，也可以用于治疗人体疾病，全人源抗HER2抗体，亲和力高，能特异结合HER2，有效预防和***疾病。

附图说明

图1为本发明构建的全人源抗体文库的scFv DNA序列构建示意图。

图2为本发明全人源抗体scFv-HER2-F1对HER2蛋白进行ELISA实验结果。

图3为本发明使用流式细胞技术检测全长抗体Ig-HER2-F1与HER2高表达乳腺癌细胞BT-474表面结合；Ig-HER2-F1抗体结合的信号以Alexa

488标记的平均荧光强度表示。

图4为本发明用MTS方法测定抗HER2全长抗体Ig-HER2-F1抑制HER2高表达乳腺癌细胞BT-474生长。

图5为本发明用MTS方法测定抗HER2全长抗体Ig-HER2-F1抑制HER2高表达乳腺癌细胞SK-BR-3生长。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1、抗人HER2单链抗体的筛选

采用公开号为CN 1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人HER2单链抗体，具体实施过程如下：

1、扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA

以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA(购自Clontech)为模板，利用oligo(dT)和随机引物(random primers)，使用逆向转录酶试剂盒(购自Clontech)，根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。

以上述cDNA为模板，利用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物，进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：

第一组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的5’-端引物(依次为SEQ ID No.5～11)，包括：

VH1b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；

VH2b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；

VH3b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’；

VH4b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)

C(C/T)-3’；

VH5b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGT

CTGG-3’；

VH6b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；

VH7b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)

TCTGG-3’；

第二组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物(依次为SEQ ID No.12～17)，包括：

VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；

VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；

VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；

VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；

VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；

VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；

第三组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物(依次为SEQ ID No.18～26)，包括：

VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；

VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；

VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’；

VL4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；

VL5b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；

VL6b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；

VL7b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；

VL8b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；

VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；

第四组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物(SEQ ID No.27～28)，包括：

VL1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；

VL2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；

第五组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物(SEQ ID No.29～32)，包括：

VK1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；

VK2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；

VK3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；

VK4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；

第六组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物(SEQ ID No.33～36)，包括：

VK1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’；

VK2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3’；

VK3f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3’；

VK4f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’。

扩增人抗体中的重链可变区(VH)时，利用第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应；扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时，利用第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时，利用第五组引物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。

第一组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2(Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,ZhouH,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.)(Hua SB,Qiu M,Chan E,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.)多克隆位点的上游同源序列(下划线部分)；第四组和第六组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2多克隆位点的下游同源序列(下划线部分)；而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列(下划线部分)，连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。

扩增时，PCR反应体系与反应条件均相同，PCR反应体系为：

将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为：94℃解链1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环30次。

2、连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列

(1)以步骤1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物，序列为：

上游引物(引物7，SEQ ID No.37，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列)：

5’-ACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTGTATGGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTAC-3’；

下游引物(引物8，SEQ ID No.38，下划线部分为连接肽反链序列)：

5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCCGCCTGATCCACCACCGCC-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含5’-载体pACT2多克隆位点的上游同源序列和3’-连接肽反链序列的人抗体重链可变区DNA序列。

(2)以步骤1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物，序列如下：

上游引物(引物10，SEQ ID No.39，下划线部分为连接肽顺链序列)：

5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；

下游引物(引物9，SEQ ID No.40，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列)：

5’-GAGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA-3’；

进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含3’-载体pACT2多克隆位点的下游同源序列和5’-连接肽顺链序列的人抗体轻链可变区DNA序列。

3、连接单链抗体

将步骤2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合，以该混合DNA为模板，分别以引物7和引物9为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。

如图1所示，反应完成后得到包括人抗体重链可变区DNA序列、轻链可变区DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA。

4、构建人单链抗体基因文库

将步骤3得到的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook,PT3024-1)共同转入酵母菌株Y187(MATα ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4Δ,gal80Δ,met-,URA3::GAL1_UAS-GAL1_TATA-lac Z,MEL1)内，经细胞内同源重组后将单链抗体DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体文库，单链抗体DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域(Activation Domain，AD)融合在一起。

为检查该单链抗体基因文库的质量，从中随机挑出了21个克隆，对***片段进行测序分析。分析结果表明，所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体DNA片段，而且所有单链抗体DNA序列都是独特的。

经同源重组而得到的酵母双杂交单链抗体基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×10⁸个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。

5、筛选抗体

(1)抗体筛选

使用人HER2作为抗原，对酵母双杂交单链抗体基因文库进行抗体筛选。

将编码人HER2的N端成熟蛋白细胞外部分(ECD)(Thr23-Thr652)的DNA(序列见GenBank的ID号NM_004448)重组到载体pGBKT7中，构建pGBK-Her2。pGBK-Her2编码Gal4 DNA结合区域(Binding Domain，简称BD)，并在其C端融合了人HER2的N端蛋白细胞外部分的序列。

在编码人HER2蛋白细胞外部分的的DNA序列得到验证后，将pGBK-Her2质粒DNA转化入酵母菌株AH109(MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3,GAL2_UAS-GAL2_TATA-ADE2,URA3::MEL1_UAS-MEL1_TATA-lac Z)；带有pGBK-Her2质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。

将等量的含pGBK-Her2的MATa型酵母细胞(AH109菌株)与含单链抗体基因文库的MATa型酵母细胞(Y187菌株)进行共同培养，使此二型细胞交配结合。由于载有单链抗体基因文库的pACT2载体含有Leu2基因，且pGBK-Her2包含Trp1基因，因此，包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和色氨酸的酵母合成培养基(SD/-LW)。

存在单链抗体scFv与HER2的N端蛋白细胞外部分相互作用的酵母细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基(SD/-AHLW)上，并在该平板培养基上形成菌落。

(2)特异性抗体筛选

1)β半乳糖苷酶分析

由于存在scFv与HER2的N端蛋白细胞外部分的相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lacZ，因此检测酵母细胞内β半乳糖苷酶是否表达可判断酵母细胞内scFv/HER2蛋白的存在。

在筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出46个菌落，使用β半乳糖苷酶检测法检测lac Z表达。检测方法如下：

①将存在scFv/HER2蛋白相互作用的酵母接种到筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长；

②将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上；

③将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂；

④将滤纸从液氮中取出，并置于30℃的烘箱内；重复步骤③和④两次；

⑤将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37℃的温箱内约15分钟；若菌落处显示蓝色，表明为β半乳糖苷酶阳性，即lac Z基因被激活表达。

其中，X-gal溶液配方如下：

16.1 g/L Na₂HPO₄·7H₂O；

5.50 g/L NaH₂PO₄·H₂O；

0.75 g/L KCl；

0.246 g/L MgSO₄·7H₂O；

35mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)；

5mMβ-巯基乙醇；pH 7.0。

检测结果：上述挑选出的46个菌落中，有33个是β半乳糖苷酶阳性，表明在这些菌落中报告基因lacZ被激活了。

2)特异结合分析

对上述33个β半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以验证单链抗体scFv是否特异性地与人HER2的N端蛋白结合。

从上述33个β半乳糖苷酶阳性的酵母中提取含有scFv的pACT2质粒DNA，再分别与pGBKT7空载体DNA、pGBK-Her2质粒DNA、pGBKT-Lam质粒DNA(编码Gal4DNA结合区域并在其C端融合有人核纤层蛋白C)共同转化到AH109酵母细胞内；转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上；对长出的菌落作β半乳糖苷酶分析，验证为阳性的菌落视为含有非特异性的scFv，将其剔除。

经上述特异性分析后，得到一个对HER2的N端蛋白具有特异性的单链抗体，编号为scHer2-F1，使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析，结果显示：编号scHer2-F1重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.3所示。重链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.1)为：EVQLVESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMGANSGGYLYGMDVWGQGTTVTVSS

其中下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3；

编号scHer2-F1的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No.4所示，轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：

QAVVIQEPSFSVSPGGTVTLTCGLSSGSVSTSYYPSWYQQTPGQAPRTLIYSTNTRSSGVPDRFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCVLYMGSGIWVFGGGTKLTVL；

下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3。

实施例2、单链抗体表达与纯化

将单链抗体scHer2-F1的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中，构建得到pET27b-scHer2-F1；

将pET27b-scHer2-F1转化入表达细菌E.coli BL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG(0.5mM)诱导表达；表达出的目标蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔(periplasmic space)中；scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物，方便目标蛋白的纯化；

应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗HER2的单链抗体蛋白scFv-HER2-F1。

实施例3、ELISA测试单链抗体对HER2的特异性

HER2的N端胞外部分的蛋白(Met1-Thr652)购自北京义翘神州(目录号10004-HCCH)。

ELISA测试方法如下：

(1)用HER2蛋白包被96-孔板，在2-8℃过夜；

(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；

(3)将单链抗体scFv-HER2-F1在0.02％BSA中作系列稀释后加入已包被有HER2蛋白的96-孔中，与HER2蛋白结合；

(4)将96-孔板清洗后，加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；

(5)将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；

(6)将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；

(7)用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱。

检测结果如图2所示，表明单链抗体scFv-HER2-F1能有效地结合HER2蛋白。

实施例4、抗HER2全长抗体IgG

委托北京义翘神州生物技术有限公司制备全长重组人源抗HER2抗体。

首先将scHER2-F1克隆的重链和轻链可变区分别构建至真核细胞表达IgG重链和轻链的载体中，构建后的真核表达载体以瞬转(transient expression)方式转化至CHO细胞中进行表达，所获得的全长抗体Ig-HER2-F1为IgG1，κ型。CHO细胞表达的全长IgG抗体用Protein A亲和层析纯化得到相应的全长抗体蛋白。

该全长IgG抗体Ig-HER2-F1的可变区氨基酸序列与前述的单链抗体蛋白scFv-HER2-F1的可变区序列相同。

实施例5、抗HER2全长抗体IgG检测肿瘤细胞表面HER2/ErbB2蛋白

我们采用流式细胞技术(Flow Cytometry)，将相同浓度(10μg/ml)的不同抗体(Ig-HER2-F1蛋白或对照用的人IgG蛋白)分别与HER2/ErbB2分子高表达的乳腺癌细胞BT-474共同孵育，然后加入二抗Alexa

488山羊抗人IgG(H+L)抗体(经1:500稀释)，测定各个抗体结合细胞表面HER2/ErbB2分子平均荧光强度。检测结果见图3。

图3中结果表明全人源抗体Ig-HER2-F1可与HER2/ErbB2结合，可以用于检测表达HER2/ErbB2蛋白的乳腺癌细胞。

实施例6、抗HER2全长抗体IgG抑制乳腺癌细胞生长

为进一步验证全人源抗体Ig-HER2-F1对肿瘤细胞的抑制作用，我们选取两株HER2/ErbB2分子高表达的乳腺癌细胞系BT-474及SK-BR-3进行体外增殖抑制实验(图4、图5)。细胞增殖抑制实验应用标准的MTS法。实验结果表明，全人源抗体Ig-HER2-F1具有明显的乳腺癌细胞生长抑制活性，且与曲妥珠单抗Trastuzumab的抑制作用相似。

Claims (6)

1.抗人HER2抗体，其特征在于，抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GSISSSNWWS、EIYHSGSTNYNPSLKS、MGANSGGYLYGMDV；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为：GLSSGSVSTSYYPS、STNTRSS、VLYMGSGIWV；

所述抗体为全抗体或全抗体的抗原结合部分，所述抗原结合部分为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段或单链抗体。

2.如权利要求1所述的抗人HER2抗体，其特征在于，所述全抗体为IgG型。

3.如权利要求1所述的抗人HER2抗体，其特征在于，所述全抗体为IgG1型。

4.如权利要求1所述的抗人HER2抗体的编码基因，其特征在于，抗体的重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.一种含有如权利要求4所述编码基因的重组载体和表达***。

6.如权利要求1～3任一所述的抗人HER2抗体在制备抗乳腺癌药物中的应用。

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