CN110551218B - 一种gd2纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种GD2纳米抗体及其应用，该纳米抗体可应用于GD2分子检测试剂及治疗性抗体的研发。

Description

一种GD2纳米抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种GD2纳米抗体及其应用，该纳米抗体可应用于GD2分子检测试剂及治疗性抗体的研发。
背景技术
双唾液酸神经节苷脂(GD2)分子是一种在胎儿中表达的癌胚抗原。GD2分子在神经干细胞、间充质干细胞、乳腺癌干细胞中也有表达。出生后，可在外周神经元、中枢神经***和皮肤的黑色素细胞中检测到。GD2的生物学作用目前还不是非常明确。已经有报道显示，神经母细胞瘤表面的GD2分子是细胞外基质蛋白介导肿瘤细胞之间的相互连接。与其它抗原相比，神经母细胞瘤表面和肿瘤内部的GD2抗原的表达量更高而且更均质性，患者血清中游离的GD2抗原含量更高。当GD2抗原与抗体结合后GD2分子不会消失。美国国家癌症中心根据抗原的治疗功能、免疫原性、致癌性、特异性、表达水平，以及抗原肿瘤细胞表达比例等标准，GD2抗原是排名第12位的肿瘤抗原。除神经母细胞瘤外，其他恶性肿瘤如黑色素瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、促***增生小圆细胞瘤、小细胞肺癌也表达GD2分子。
纳米抗体技术是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers,R在骆驼血液中发现。普通抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现新型抗体只有两条重链，这些“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。以该“重链抗体”为基础的纳米抗体不仅分子量只是普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易，肿瘤组织穿透性高，且容易偶联其它分子。因此应用纳米抗体技术研发GD2的检测试剂和治疗性抗体具有广阔的前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人进行深入研究，最终完成本发明。
因此，一方面，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，包含框架区(FR)和互补决定区(CDR)，其中，
互补决定区1(CDR1)选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:61；
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优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
框架区1(FR1)，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；
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框架区4(FR4)，其选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:60。
本发明中，各框架区1(FR1)、各互补决定区1(CDR1)、各框架区2(FR2)、各互补决定区2(CDR2)、各框架区3(FR3)、各互补决定区3(CDR3)各框架区4(FR4) 的可选实例之间具有较高的序列同源性，例如80％以上的序列同源性。
更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
框架区1(FR1)，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
框架区1(FR1)，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
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更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，依次包含以下区域，优选由以下区域组成：
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互补决定区3(CDR3)，其如SEQ ID NO:63所示；和
框架区4(FR4)，其选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:60。
还更优选地，本发明提供了一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，其氨基酸序列选自以下：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:64。
又一方面，本发明提供了一种DNA分子，其编码上述GD2纳米抗体。
还一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含上述DNA分子。
再一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述表达载体。
又一方面，本发明提供了上述GD2纳米抗体用作GD2分子检测试剂和/或治疗性抗体的用途。
再一方面，本发明提供了上述GD2纳米抗体的制备方法：包括以下步骤：
1.使神经节苷脂GD2与KLH分子偶联；
2.构建针对GD2分子的纳米抗体文库；
3.筛选针对GD2纳米抗体；
4.用免疫印迹法检测单个阳性克隆；
5.用phage Elisa对阳性克隆进一步验证；
6.在真核表达***中表达纯化GD2纳米抗体。
在一个具体实施方式中，在步骤1中，使用炔基-PEG4-NHS将神经节苷脂GD2与 KLH分子偶联。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明首先偶联了GD2-KLH，使GD2分子具有免疫原性，然后将GD2-KLH分子偶联在免疫管上或者将GD2-KLH生物素标记偶联在链霉亲和素的磁珠上，展示GD2分子的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了GD2 分子特异性的纳米抗体基因，并将此转至真核表达细胞HEK293F中，从而建立了能在 HEK293F中高效表达的纳米抗体株。
附图说明
图1显示实施例1中的GD2-PEG4-KLH的偶联路线。
图2显示实施例1中离子色谱糖型分析结果。其中，A为KLH-Alkyne离子色谱分析图；B为KLH-GD2离子色谱分析图；C为GD2离子色谱分析图；D为GD2为标准品时最后一个峰(P3)的标准曲线。
图3为实施例3中的Output phage免疫印迹图。
图4为实施例5中的phage水平的Elisa检测阳性克隆与KLH-GD2分子的结合活性图。
图5为实施例6中的纳米抗体表达纯化SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
KLH(sigma,H7017),磷酸钠(沪试，20040928)，氯化钠(沪试，10019308)，聚乙烯吡咯烷酮(沃凯，XW252495411)，蔗糖(沪试，10021418)，Alkyne-PEG4-NHS(凯新，1393330-40-9)，BTTAA(Abmole,M9021),GD2(OligoTech,GLY094)，环磷酰胺(Baxter Oncology GmbH)，羊抗M13(Abcam,24229)
实施例1：神经节苷脂GD2-KLH分子的偶联(图1)
(1)载体蛋白KLH配成10mg/mL，最终buffer为31mM磷酸钠，0.46M氯化钠， 2％PVP聚乙烯吡咯烷酮，41mM蔗糖，pH 7.4；(2)取Alkyne-PEG4-NHS 20mg，用 DMSO配制成100mg/mL母液；(3)取400ml KLH母液，并用1N NaOH将pH调节pH 至8.0；(4)向上述溶液中加入40ml的Alkyne母液，室温孵育4小时；(5)超滤浓缩并用50mM,pH 8.0的磷酸钠缓冲液置换，浓缩得到Alkyne-PEG4-KLH；(6)合成Az-异硫氰酸荧光素(Az-FITC)，并通过Az-FITC对Alkyne-KLH进行了荧光分析，确证KLH上携带炔基基团；(7)在配体BTTAA下，通过Cu(I)催化进行点击化学反应，并通过离子色谱进行溶液中GD2-N3含量变化进行分析，间接验证反应的进程；(8)待反应结束，超滤浓缩并置换缓冲液体系；(9)分别取200g的KLH-GD2、KLH-Alkyne以及50g的GD2，分别加入适量水和TFA，终体积为600L，TFA终浓度为2M。将各体系置于100℃加热3 小时后离心冻干。随后，各加入60L的ddH2O重新溶解。并取适当量进行离子色谱糖型分析(图2)。(10)通过上述标准曲线进行计算：KLH-GD2(22g)中GD2含量为： (118.347-46.35-3.9195)/30.434＝2.2g。约占百分比为：10％。
实施例2：针对GD2分子的纳米抗体文库的构建
(1)将1mg实施例1制得的GD2-KLH与等体积的弗氏佐剂混合免疫单峰驼，共免疫7次，在第一次免疫前三天按15μg/kg的量给动物静脉注射环磷酰胺(表1)；(2)7次免疫结束后，提取200mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)反转录获得cDNA并用巢式PCR扩增VHH片段；(4)利用kunkel反应将VHH单链DNA退火到噬菌体载体中；(5)将kunkel产物转化至电转化感受态DH10B中，构建GD2纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.1×10e9。
[表1]
骆驼免疫安排表
免疫次数 免疫时间 佐剂类型 免疫剂量(mg) 免疫途径
0 负三天 环磷酰胺7.5 静脉注射
1 第一天 完全弗氏佐剂 1 皮下注射
2-7 每周一次 不完全弗氏佐剂 1 皮下注射
实施例3：针对GD2纳米抗体的筛选过程
(1)液相淘选：1)用终浓度0.5％casein封闭缓冲液封闭10e12 pfu input phage，室温孵育1h；2)同时取3×100μl链霉亲和素磁珠用无菌PBS洗三次，弃上清，用500μl 1％casein封闭缓冲液室温封闭1h；3)弃掉步骤2)中的封闭液，将1mL封闭好的phage 加至磁珠中，充分混匀，旋转混匀结合15min(阴性筛选)；4)取上清至新的无菌EP管中，加入终浓度为50μg/mL KLH-biotn抗原，室温旋转混匀结合2h；5)弃掉步骤2)中的封闭液，将1mL phage-KLH-biotin混合液转到磁珠中，充分混匀，旋转混匀结合15min； (阴性筛选)；6)取上清至新的无菌EP管中，加入终浓度为100μg/mL GD2-KLH-biotn抗原，室温旋转混匀结合2h；7)同时取100μl链霉亲和素磁珠用无菌PBS洗三次，弃上清，用500μl 1％casein封闭缓冲液室温封闭1h；8)弃掉步骤2)中的封闭液，将1mL phage-GD2-KLH-biotin混合物加至磁珠中，充分混匀，旋转混匀结合15min；9)弃上清，用1×PBS洗10次，收集磁珠；10)将400μl新鲜配置的洗脱缓冲液100mM Triethylamine 加到步骤9)的磁珠中，旋转洗脱10min；11)将400μl上清转移至无菌EP管中，加入 200μl PH6.4 Tris-HCl中和，这就是筛选获得的output phage；
(2)固相淘选：1)用1mL终浓度为50μg/mL KLH/100μg/mL GD2-KLH抗原溶液包被免疫管，4℃孵育过夜；2)第二天，用1×PBS冲洗未包被的免疫管3次，甩干，加 4mL 1％casein封闭缓冲液室温旋转封闭1h；3)用终浓度1％的BSA封闭5×10e12 pfu第一轮input phage，用1×PBS补充到1mL终体积，室温旋转封闭1h；4)弃去未包被抗原的免疫管中的封闭液，将封闭好的phage投入未包被抗原的免疫管中，旋转结合2h；(阴性筛选)；5)同时弃去包被KLH的免疫管中的包被液，用1×PBS冲洗3次，甩干，加4 mL封闭缓冲液室温旋转封闭1h；6)弃去KLH的免疫管中的封闭液，将阴性筛选后的 phage转移到免疫管中，旋转结合2h；7)同时弃去包被GD2-KLH的免疫管中的包被液，用1×PBS冲洗3次，甩干，加4mL封闭缓冲液室温旋转封闭1h；8)弃去GD2-KLH的免疫管中的封闭液，将阴性筛选后的phage转移到免疫管中，旋转结合2h；9)弃去上清，用1×PBST冲洗immunotube管10次，甩干；10)将1ml新鲜配置的洗脱缓冲液100mM Triethylamine加到免疫管中，室温静置孵育10min；11)将1mL洗脱液转移至无菌EP管中，加入500μl PH 6.4Tris-HCl中和，这就是筛选获得的output phage。
实施例4：用免疫印迹法检测单个阳性克隆(Mccafferty J,Griffiths A D,Winter G,et al. Phage antibodies:filamentous phage displaying antibodyvariable domains[J].Nature,1990, 348(6301):552-554.Huse W,Sastry L,Iverson S,et al.Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulinrepertoire in phage lambda[J].Biotechnology,1989, 246(4935):1275-1281.)
(1)铺2000pfu output phage每块LB平板，37℃培养6-8h；(2)用5mL 2μg/mLanti-M13抗体包被whatman 0.45μm NC膜，室温孵育2.5h；(3)弃去包被液，用5mL 1％casein封闭缓冲液封闭NC膜，室温孵育1h；(4)弃去封闭液，用1×PBS洗3次，晾干； (5)将NC膜贴于长有phage的LB平板上，打孔定位，室温培养过夜；(6)第二天揭膜置于新的培养皿中，1×PBS冲洗3次，加入50μg/mL GD2-KLH-biotin室温孵育1h；(7) 0.1％PBST冲洗8次，加入1:1000稀释的Neutravidin-AP室温孵育30min；(8)0.1％PBST 冲洗8次，加入10ml AP显色底物(100μl BCIP+100μl NBT)，室温显色10-30min；(9) 将阳性克隆挑取出来，做plaquePCR，送测序；(10)通过DNAman序列比对软件比对序列，将CDR1、CDR2、CDR3相同的克隆视为同一克隆。
实施例5：用phage Elisa对阳性克隆进一步验证
(1)phage的扩增：1:100接种XL1blue大肠杆菌于LB液体培养基中(含10μg/mL 四环素)，长至OD60＝0.6；将Xl1blue分装到96孔深孔板中，600μl/孔，加入15μl挑取的phageelution；过夜扩增，4000rpm离心30min，取上清，即可用来做phage Elisa；
(2)Elisa检测：1)将50μg/mL GD2-KLH抗原用1×PBS稀释至100nM，按每孔50 μl包被ELISA板，4℃过夜；2)弃去包被液，甩干ELISA板，用1×PBS冲洗3次；3) 1％casein封闭缓冲液每孔加入200μl，室温封闭1h；4)弃去封闭液，在每孔中加入50μl 高滴度phage，室温孵育2h；5)用0.1％PBST冲洗6次，甩干；6)加入1:5000稀释的羊抗M13-HRP抗体，50μl/孔，室温孵育1h。用0.1％PBST冲洗6次，甩干；7)每孔加入50μl TMB显色液，室温显色5min。加入50μl2M的H2SO4终止反应，测OD450值； 8)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍视为阳性。
实施例6：纳米抗体在真核表达***中的表达、纯化
(1)将前面测序分析获得不同克隆株的VHH片段克隆到PINfuse真核表达载体中；
(2)测序正确后，提取质粒；(3)HEK293F悬浮细胞培养在Freestyle 293表达培养基中，密度达到1×10e6/ml，成活率＞90％时用于转染；(4)PEI:质粒的质量比为3:1，按照1μg 质粒/1ml HEK293F细胞的比例转染；(5)转染后5-6天，收集细胞上清，用protein A株纯化获得高纯度的抗体蛋白，并用超滤柱将洗脱缓冲液置换成PBS。
通过上述方法，本发明得到9种GD2纳米抗体：T25；T30；T53；T63；T69；T101； T104；T308；T334。
T25(SEQ ID NO:8):
Figure BDA0002203948760000091
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNYIMSWVRQAPGKGLERVSVINSGGG STYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLRLNSLKTEDTAMYYCALGDARSGGRAIFRGQGT QVTVSS)
SEQ ID NO:1所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR)
SEQ ID NO:2所示的FR2:
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ser
(WVRQAPGKGLERVS)
SEQ ID NO:3所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Arg LeuAsn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala MET Tyr Tyr Cys Ala Leu
(RFTISRDNAKNTLYLRLNSLKTEDTAMYYCAL)
SEQ ID NO:4所示的FR4:
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(RGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:5所示的CDR1:
Asn Tyr Ile MET Ser
(NYIMS)
SEQ ID NO:6所示的CDR2:
Val Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
(VINSGGGSTYYADSVKG)
SEQ ID NO:7所示的CDR3:
Gly Asp Ala Arg Ser Gly Gly Arg Ala Ile Phe
(GDARSGGRAIF)
T30(SEQ ID NO:14):
Figure BDA0002203948760000101
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRRYDMSWVRQTPGKGLEWVSAINSVG GSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLQTEDTGVYYCATDRPGSWYYRPNPRG QGTQVTVSS)
SEQ ID NO:1所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR)
SEQ ID NO:9所示的FR2:
Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
(WVRQTPGKGLEWVS)
SEQ ID NO:10所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln METAsn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
(RFTISRDNAKNTLYLQMNSLQTEDTGVYYCAT)
SEQ ID NO:4所示的FR4:
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(RGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:11所示的CDR1:
Arg Tyr Asp MET Ser
(RYDMS)
SEQ ID NO:12所示的CDR2:
Ala Ile Asn Ser Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
(AINSVGGSTYYADSVKG)
SEQ ID NO:13所示的CDR3:
Asp Arg Pro Gly Ser Trp Tyr Tyr Arg Pro Asn Pro
(DRPGSWYYRPNP)
T53(SEQ ID NO:22):
Figure BDA0002203948760000111
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVGSASRNQMGWFRQAPGKEREEVAVIGLYGRTK YADSVKGRFTISKDNASKTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATPRSAYGTIYAPRYDYWGQ GTQVTVSS)
SEQ ID NO:15所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Ala Ser Arg
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVGSASR)
SEQ ID NO:16所示的FR2:
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala
(WFRQAPGKEREEVA)
SEQ ID NO:17所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Ser Lys Thr Leu Tyr Leu Gln METAsn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala MET Tyr Tyr Cys Ala Thr
(RFTISKDNASKTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAT)
SEQ ID NO:18所示的FR4:
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(WGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:19所示的CDR1:
Asn Gln MET Gly
(NQMG)
SEQ ID NO:20所示的CDR2:
Val Ile Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
(VIGLYGRTKYADSVKG)
SEQ ID NO:21所示的CDR3:
Pro Arg Ser Ala Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Pro Arg Tyr Asp Tyr
(PRSAYGTIYAPRYDY)
T63(SEQ ID NO:30):
Figure BDA0002203948760000121
Figure BDA0002203948760000131
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYYMSWVRQAPGKGLEWVSGITSSDI RTYYADSVKDRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKTEDTAMYYCAKDYNGSWSPRSQGTQV TVSS)
SEQ ID NO:23所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS)
SEQ ID NO:24所示的FR2:
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
(WVRQAPGKGLEWVS)
SEQ ID NO:25所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln LeuAsn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala MET Tyr Tyr Cys Ala Lys
(RFTISRDNAKNTLYLQLNSLKTEDTAMYYCAK)
SEQ ID NO:26所示的FR4:
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(QGTQVTVSS)
SEQ ID NO:27所示的CDR1:
Arg Tyr Tyr MET Ser
(RYYMS)
SEQ ID NO:28所示的CDR2:
Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ile Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp
(GITSSDIRTYYADSVKD)
SEQ ID NO:29所示的CDR3:
Asp Tyr Asn Gly Ser Trp Ser Pro Arg Ser
(DYNGSWSPRS)
T69(SEQ ID NO:36):
Figure BDA0002203948760000141
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFSSFTMYWVRQAPGKGLEWVSAINSGGG TTYYSDSAKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVRTNPRNGLRGQGTQVT VSS)
SEQ ID NO:31所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFS)
SEQ ID NO:24所示的FR2:
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
(WVRQAPGKGLEWVS)
SEQ ID NO:32所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln METAsn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
(RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCVR)
SEQ ID NO:4所示的FR4:
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(RGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:33所示的CDR1:
Ser Phe Thr MET Tyr
(SFTMY)
SEQ ID NO:34所示的CDR2:
Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala Lys Gly
(AINSGGGTTYYSDSAKG)
SEQ ID NO:35所示的CDR3:
Thr Asn Pro Arg Asn Gly Leu
(TNPRNGL)
T101(SEQ ID NO:43):
Figure BDA0002203948760000151
(DVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCKASAYTYYSYCMGWIRQAPGKEREGVAGIDRDGS TSYTDSVKGRFTISKDNAKRTLYLQMDSLKPEDTALYYCAAETRPGYCNTDYRRAPSY NYRGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:37所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Tyr Tyr
(DVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCKASAYTYY)
SEQ ID NO:38所示的FR2:
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
(WIRQAPGKEREGV)
SEQ ID NO:39所示的FR3:
Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu Gln MET AspSer Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala
(FTISKDNAKRTLYLQMDSLKPEDTALYYCAA)
SEQ ID NO:4所示的FR4:
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(RGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:40所示的CDR1:
Ser Tyr Cys MET Gly
(SYCMG)
SEQ ID NO:41所示的CDR2:
Ala Gly Ile Asp Arg Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val Lys GlyArg
(AGIDRDGSTSYTDSVKGR)
SEQ ID NO:42所示的CDR3:
Glu Thr Arg Pro Gly Tyr Cys Asn Thr Asp Tyr Arg Arg Ala Pro Ser TyrAsn Tyr
(ETRPGYCNTDYRRAPSYNY)
T104(SEQ ID NO:50):
Figure BDA0002203948760000161
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASGSIYSNRCAGWFRQVPGKAREGVAAIYTGGA STYYADSVKGRFTISQDNAKNTLYLQMDSLNPEDTAIYYCAASRPRYGFTSCGLSQISY THWGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:44所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCVASGSIYS)
SEQ ID NO:45所示的FR2:
Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala
(WFRQVPGKAREGVA)
SEQ ID NO:46所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln METAsp Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
(RFTISQDNAKNTLYLQMDSLNPEDTAIYYCAA)
SEQ ID NO:18所示的FR4:
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(WGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:47所示的CDR1:
Asn Arg Cys Ala Gly
(NRCAG)
SEQ ID NO:48所示的CDR2:
Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
(AIYTGGASTYYADSVKG)
SEQ ID NO:49所示的CDR3:
Ser Arg Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ser Cys Gly Leu Ser Gln Ile Ser TyrThr His
(SRPRYGFTSCGLSQISYTH)
T308(SEQ ID NO:56):
Figure BDA0002203948760000171
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYSSYCMGWFRQAPGKEREGVATIDIDGS TTYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYYCAADRVWGSCRRTSGNFGY WGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:51所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser
(DVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTYS)
SEQ ID NO:52所示的FR2:
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
(WFRQAPGKEREGV)
SEQ ID NO:53所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln METAsn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala MET Tyr Tyr Cys Ala Ala
(RFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDSAMYYCAA)
SEQ ID NO:18所示的FR4:
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(WGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:40所示的CDR1:
Ser Tyr Cys MET Gly
(SYCMG)
SEQ ID NO:54所示的CDR2:
Ala Thr Ile Asp Ile Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
(ATIDIDGSTTYADSVKG)
SEQ ID NO:55所示的CDR3:
Asp Arg Val Trp Gly Ser Cys Arg Arg Thr Ser Gly Asn Phe Gly Tyr
(DRVWGSCRRTSGNFGY)
T334(SEQ ID NO:64):
Figure BDA0002203948760000181
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSYPMSWVRQPPGKELEWVSGIRSDGG NTHYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQLNSLKTEDTAMYYCTKGYNRPTTQLGGGQGT QVTVSS)
SEQ ID NO:57所示的FR1:
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
(DVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFS)
SEQ ID NO:58所示的FR2:
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
(WVRQPPGKELEWV)
SEQ ID NO:59所示的FR3:
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln LeuAsn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala MET Tyr Tyr Cys Thr Lys
(RFTISRDNAKNTLYLQLNSLKTEDTAMYYCTK)
SEQ ID NO:60所示的FR4:
Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
(GGQGTQVTVSS)
SEQ ID NO:61所示的CDR1:
Ser Tyr Pro MET Ser
(SYPMS)
SEQ ID NO:62所示的CDR2:
Ser Gly Ile Arg Ser Asp Gly Gly Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val LysGly
(SGIRSDGGNTHYADSVKG)
SEQ ID NO:63所示的CDR3:
Gly Tyr Asn Arg Pro Thr Thr Gln Leu Gly
(GYNRPTTQLG)。
SEQUENCE LISTING
<110> 达石药业（广东）有限公司
上海迈石生物技术有限公司
深圳创石生物医药有限公司
<120> 一种GD2纳米抗体及其应用
<130> DI19-1475-XC37
<160> 64
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg
20 25 30
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 2
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 3
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Arg
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Leu
20 25 30
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 4
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 5
Asn Tyr Ile Met Ser
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 6
Val Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 7
Gly Asp Ala Arg Ser Gly Gly Arg Ala Ile Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T25
<400> 8
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ile Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Val
35 40 45
Ser Val Ile Asn Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Gly Asp Ala Arg Ser Gly Gly Arg Ala Ile Phe Arg Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 9
Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 10
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
20 25 30
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 11
Arg Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 12
Ala Ile Asn Ser Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 13
Asp Arg Pro Gly Ser Trp Tyr Tyr Arg Pro Asn Pro
1 5 10
<210> 14
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T30
<400> 14
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Ser Val Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Arg Pro Gly Ser Trp Tyr Tyr Arg Pro Asn Pro Arg Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 15
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Ala Ser Arg
20 25
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 16
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 17
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Ser Lys Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 18
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 19
Asn Gln Met Gly
1
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 20
Val Ile Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 21
Pro Arg Ser Ala Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Pro Arg Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T53
<400> 22
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Ala Ser Arg Asn Gln Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ala Val Ile
35 40 45
Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Ser Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Pro Arg
85 90 95
Ser Ala Tyr Gly Thr Ile Tyr Ala Pro Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 23
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 24
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 25
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 26
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 27
Arg Tyr Tyr Met Ser
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 28
Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ile Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 29
Asp Tyr Asn Gly Ser Trp Ser Pro Arg Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T63
<400> 30
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Ser Ser Asp Ile Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Tyr Asn Gly Ser Trp Ser Pro Arg Ser Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 31
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser
20 25 30
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 32
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg
20 25 30
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 33
Ser Phe Thr Met Tyr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 34
Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 35
Thr Asn Pro Arg Asn Gly Leu
1 5
<210> 36
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T69
<400> 36
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Thr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Ser Gly Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Thr Asn Pro Arg Asn Gly Leu Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 37
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Tyr Tyr
20 25 30
<210> 38
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 38
Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
1 5 10
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 39
Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu Gln Met
1 5 10 15
Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 40
Ser Tyr Cys Met Gly
1 5
<210> 41
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 41
Ala Gly Ile Asp Arg Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 42
Glu Thr Arg Pro Gly Tyr Cys Asn Thr Asp Tyr Arg Arg Ala Pro Ser
1 5 10 15
Tyr Asn Tyr
<210> 43
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T101
<400> 43
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Tyr Tyr Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Arg Asp Gly Ser Thr Ser Tyr Thr Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Arg Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Glu Thr Arg Pro Gly Tyr Cys Asn Thr Asp Tyr Arg Arg Ala Pro
100 105 110
Ser Tyr Asn Tyr Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 44
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser
20 25 30
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 45
Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 46
Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asp Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 47
Asn Arg Cys Ala Gly
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 48
Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 49
Ser Arg Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ser Cys Gly Leu Ser Gln Ile Ser
1 5 10 15
Tyr Thr His
<210> 50
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T104
<400> 50
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Tyr Ser Asn Arg
20 25 30
Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Thr Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ser Arg Pro Arg Tyr Gly Phe Thr Ser Cys Gly Leu Ser Gln
100 105 110
Ile Ser Tyr Thr His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 51
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser
20 25 30
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 52
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
1 5 10
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 53
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
20 25 30
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 54
Ala Thr Ile Asp Ile Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 55
Asp Arg Val Trp Gly Ser Cys Arg Arg Thr Ser Gly Asn Phe Gly Tyr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T308
<400> 56
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asp Ile Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Arg Val Trp Gly Ser Cys Arg Arg Thr Ser Gly Asn Phe Gly
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 57
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR1
<400> 57
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
20 25 30
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR2
<400> 58
Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
1 5 10
<210> 59
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR3
<400> 59
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr Lys
20 25 30
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FR4
<400> 60
Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 61
Ser Tyr Pro Met Ser
1 5
<210> 62
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 62
Ser Gly Ile Arg Ser Asp Gly Gly Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 63
Gly Tyr Asn Arg Pro Thr Thr Gln Leu Gly
1 5 10
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T334
<400> 64
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Arg Ser Asp Gly Gly Asn Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Lys Gly Tyr Asn Arg Pro Thr Thr Gln Leu Gly Gly Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (7)

1.一种GD2纳米抗体，其是针对于神经节苷脂GD2分子抗原表位的纳米抗体，包含框架区（FR）和互补决定区（CDR），其中，所述互补决定区（CDR）包括互补决定区1（CDR1）、互补决定区2（CDR2）、互补决定区3（CDR3），
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:5所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQ IDNO:6所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:7所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:11所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:12所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:13所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:19所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:20所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:21所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:27所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:28所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:29所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:33所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:34所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:35所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:40所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:41所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:42所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:47所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:48所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:49所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:40所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:54所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:55所示；或者
其中，所述互补决定区1（CDR1）如SEQ ID NO:61所示，所述互补决定区2（CDR2）如SEQID NO:62所示，并且所述互补决定区3（CDR3）如SEQ ID NO:63所示。
2.根据权利要求1所述的GD2纳米抗体，依次包含框架区1（FR1）、互补决定区1（CDR1）、框架区2（FR2）、互补决定区2（CDR2）、框架区3（FR3）、互补决定区3（CDR3）和框架区4（FR4），
其中，所述框架区1（FR1）选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:57；
所述框架区2（FR2）选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQID NO:38、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:58；
所述框架区3（FR3）选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:59；和
所述框架区4（FR4）选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:60。
3.根据权利要求1所述的GD2纳米抗体，其氨基酸序列选自以下中的任一种：SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:64。
4.一种DNA分子，其编码权利要求1-3中任一项所述的GD2纳米抗体。
5.一种表达载体，其包含权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。
7.权利要求1-3中任一项所述的GD2纳米抗体在制备GD2分子检测试剂和/或治疗性试剂中的用途。
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