CN103283961B - 一种益生型发酵豆粕的制备方法 - Google Patents

一种益生型发酵豆粕的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了本发明涉及一种富含小肽、γ-氨基丁酸（GABA）、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法。本发明利用米曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌等菌种，以两阶段固态发酵法，得到益生型发酵豆粕中的小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA和植物乳杆菌活菌数含量高，小肽达8.01～18%，游离氨基酸80～300mg/g，还原糖达20～80mg/g，GABA达0.317～0.5mg/g，植物乳杆菌活菌数达2～6.5×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达2.0×103～7.0×104IU/g，益生型发酵豆粕的收率为82.03～90%。该工艺不仅可以提高豆粕的营养功效，而且可使制得的发酵豆粕具有抗菌功效，可以替代部分抗生素同时也便于防腐保存，工艺简单可行且绿色环保，在饲料行业和养殖业具有应用意义和广阔前景。

Description

一种益生型发酵豆粕的制备方法
（一）技术领域
本发明涉及一种富含小肽、γ-氨基丁酸（GABA）、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法。
（二）背景技术
在农副产品中，豆粕是大豆提取豆油后得到的具有高蛋白的残渣，2012年国内加工总量（不含进口豆粕）大约为1000万吨，具有很高的开发和利用价值。但豆粕蛋白分子量较大，结构复杂，其中11S大豆球蛋白和β-伴球蛋白两种抗原蛋白，占豆粕饲料的30%。β-伴球蛋白的α基团已经被证实是小猪潜在的过敏原，引起腹泻。同时豆粕中还存在胰蛋白酶抑制因子、脲酶、凝集素等抗营养因子，极大地影响了豆粕的饲用价值。
以豆粕为原料，利用米曲霉、黑曲霉、红曲霉、假丝酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等饲料级微生物中的几种进行混合有氧发酵，多种抗营养因子比如脲酶、胰蛋白酶抑制因子、凝血素等大大减少，可解决普通豆粕引起的仔猪腹泻等问题。另外，不容易消化的大分子蛋白减少，容易吸引的小肽大大增加，营养成分全面，可部分代替高价位的动物源蛋白质饲料。同时有些蛋白酶在一定条件下降解大豆蛋白时可以产生能抑制某些致病菌的抗菌肽，可代替部分抗生素的使用。有氧发酵后再用植物乳杆菌继续厌氧发酵豆粕使其含GABA和抗菌肽。植物乳杆菌发酵豆粕不仅可以降解豆粕营养成分、消除抗营养因子，还可以生成大量益生菌、乳酸、细菌素等抑菌成分，使益生型发酵豆粕更容易保存且抗致病菌强，因此是抗生素等化学合成药物的优质替代品。GABA是一种新型饲料添加剂，摄取少量的GABA即可增强动物的免疫性能和抗热应激性能，促进生长，本专利采用的植物乳杆菌能将谷氨酸转化为γ—氨基丁酸，发酵所生产的豆粕将富含小肽、游离氨基酸、还原糖、γ-氨基丁酸（GABA）、植物乳杆菌活菌数、乳酸和抗菌肽等多种营养成分。因此该工艺所产益生型发酵豆粕具有现实意义和广阔的前景。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种富含小肽、γ-氨基丁酸（GABA）、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种富含小肽、γ-氨基丁酸、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法，所述方法包括：
（A）豆粕经膨化、粉碎后，与麸皮混合作为固体发酵培养基主要成分配制固体发酵培养基，熟化后接入米曲霉、黑曲霉、红曲霉、假丝酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种，30～35℃下进行固态发酵，前12h每3～4h翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36～60h（总发酵时间）；麸皮质量用量占豆粕与麸皮质量之和的1～10%；所用菌株为常规市购菌株。
（B）步骤（A）发酵产物加入可溶性淀粉，经增湿后接入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCTCC No：M2011364（该菌株已于在先申请201210219989.6中披露，公开号CN102754782A），30～35℃厌氧静置发酵24～86h；该菌株发酵时既可以产γ-氨基丁酸又可以产细菌素。
（C）发酵结束后，步骤（B）发酵产物经低温干燥或不干燥，获得所述益生型发酵豆粕。产品冷却后密封，置于4℃干燥处保藏。产品出料水分含量≤6%。低温干燥或不经干燥操作条件为：温度35～50℃。
优选的，在步骤（A）与（B）之间，或者在步骤（B）与（C）之间，还包括酶解处理步骤：步骤（A）或（B）发酵产物经增湿后，加入复合酶或者不加入酶，于40～60℃进行酶解（不加酶则为水解）6～15h；所述酶为下列之一或其中两种以上的混合物：蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、鼠李糖苷酶。
优选的，所述步骤（A）中固体发酵培养基质量组成如下：豆粕90～95%，麸皮5～10%，豆粕与麸皮总量为100%，并添加2～5%的硫酸铵，含水量50～55%（水占豆粕和麸皮总质量的40～60%，更优选为54%）。
优选的，所述步骤（A）中熟化方法为在灭菌锅中90～121℃处理10～30min。
优选的，所述增湿为加水至含水量55～70%（水占豆粕和麸皮总质量的56～55%，更优选为60%）。
优选的，所述酶为纤维素酶或者纤维素酶与果胶酶的混合物，质量用量为豆粕和麸皮质量之和的1～5%（果胶酶单位酶活500～1000U/g，纤维素酶单位酶活20～80U/g）。
优选的，所述可溶性淀粉加入量为豆粕和麸皮总质量的1～3%。
按照本发明方法，得到益生型发酵豆粕中的小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌活菌数和抗菌肽含量高，小肽达8.01～18%，游离氨基酸80～300mg/g，还原糖达20～80mg/g，GABA达0.317～0.5mg/g，植物乳杆菌活菌数达2～6.5×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达2.0×103～7.0×104IU/g，益生型发酵豆粕得收率为82.03～90%。小肽含量测定参考GB/T22492-2008大豆肽粉国标，游离氨基酸测定参考GB/T8314-20，还原糖采用DNS法测得，GABA的含量采用高效液相色谱法可以准确测得，活菌数采用稀释涂布法。抑菌实验采用牛津杯双层平板法。本发明利用米曲霉、植物乳杆菌制作富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕产品，不仅提高豆粕的营养，而且具有抗菌功效，可以替代部分抗生素，工艺简单可行且绿色环保，在饲料行业和养殖业中具有很强的应用价值和广阔的前景。
（四）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中所用米曲霉、黑曲霉、红曲霉、假丝酵母、酿酒酵母购自上海迪发酿造生物制品有限公司。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1：利用多菌混合串联发酵工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用；选择优质干燥麸皮作配料。
2.种子液制备：
（1）米曲霉和红曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）和红曲霉（AS3.972）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL，得孢子悬液。
（2）酿酒酵母种子液制备：
液体种子培养基YEPD：葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH6.0。将酿酒酵母（AS2.399）菌株接种于YEPD固体斜面（液体YEPD加琼脂粉20g/L）培养基中，在30℃下恒温培养36h后，挑取1环，接种于装有60mL无菌YEPD液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃，摇床转速200r/min下恒温培养24h，得酿酒酵母种子液备用。
（3）地衣芽孢杆菌菌种子液制备
液体种子培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，溶剂为水，pH值7.0。将地衣芽孢杆菌（CGMCC No.1.00265）菌株分别接于种子斜面（液体种子培养基加琼脂粉20g/L），37℃生长48小时后将2环斜面菌种接入60ml液体种子培养基中（500mL三角瓶），然后置于37℃、200r/min摇床中培养72h，得地衣芽孢杆菌种子液备用。
（4）植物乳杆菌种子液制备：
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h，得植物乳杆菌种子液备用。
3.多菌串联发酵工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化30min，自然pH，米曲霉和红曲霉孢子悬液、酿酒酵母种子液以及地衣芽孢杆菌种子液各接种量（v/m）为10%（即100g发酵基质接种10mL孢子悬液或种子液），30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。再加入可溶性淀粉2%，增湿使含水量达60%，再接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵64h。
4.检测得小肽含量为9.5%，游离氨基酸为280mg/g，还原糖含量达30.1mg/g，GABA达0.630mg/g,植物乳杆菌活菌数5.6×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达3.6×104IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：87%，水分含量≤5%。小肽含量为8.0%，游离氨基酸为270mg/g，乳酸4.95%，还原糖含量为24mg/g，GABA含量为0.50mg/g，活菌数达3.8×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达3.0×104IU/g。
实施例2：利用多菌混合串联发酵工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1、原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用；选择优质干燥麸皮作配料。
2、种子液制备：
（1）米曲霉和黑曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）和黑曲霉（AS3.4309）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL，得孢子悬液。
（2）假丝酵母种子液制备：
液体种子培养基YEPD：葡萄糖30g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH5.0。将假丝酵母（AS2.1182）菌株接种于YEPD固体斜面（液体YEPD加琼脂粉20g/L）培养基中，在30℃下恒温培养32h后，挑取1环，接种于装有60mL无菌YEPD液体培养基的500mL三角瓶中，在30℃，摇床转速200r/min下恒温培养24h，得假丝酵母种子液备用。
（3）枯草芽孢杆菌种子液制备
液体种子培养基（g/L）：蛋白胨10g，牛肉膏10g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。将枯草芽孢杆菌（CGMCC No.1.00775）菌株分别接于种子斜面（液体种子培养基加琼脂粉20g/L），37℃生长48小时后将2环斜面菌种接入60ml液体种子培养基中（500mL三角瓶），然后置于37℃、200r/min摇床中培养72h，得枯草芽孢杆菌种子液。
（4）植物乳杆菌种子液制备：
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h，得植物乳杆菌种子液。
3、多菌串联发酵工序：
豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化30min，自然pH，米曲霉和黑曲霉孢子悬液、酿酒酵母种子液以及枯草芽孢杆菌种子液各接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。再加入可溶性淀粉2%，增湿使含水量达60%，再接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵60h。
4、检测得小肽含量为10.5%，游离氨基酸为310mg/g，还原糖含量达32.1mg/g，GABA达0.610mg/g,植物乳杆菌活菌数7.6×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达5.6×104IU/g。
5、对益生型发酵豆粕进行低温干燥，温度为35～50℃。
6、干燥后发酵豆粕得收率为：85%，水分含量≤5%。小肽含量为9.0%，游离氨基酸为290mg/g，乳酸4.55%，还原糖含量为28mg/g，GABA含量为0.58mg/g，活菌数达4.8×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达4.0×104IU/g。实施例3：利用米曲霉发酵后直接深度酶解生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、抗菌肽益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用；选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL，得孢子悬液。
3.米曲霉单菌发酵工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化20min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。增湿至含水量65%，再转移至温度为55℃水解罐中进行水解10h。4.水解结束后，检测得小肽含量为13.4%，游离氨基酸为160mg/g，还原糖含量达47.1mg/g，抗菌肽抑菌效价达0.82×104IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：90%，水分含量≤4%。小肽含量为12.4%，游离氨基酸为149mg/g，还原糖含量达44.1mg/g，抗菌肽抑菌效价达0.75×104IU/g。
实施例4：利用串联发酵工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用；选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL，得孢子悬液。
（2）植物乳杆菌种子液制备：
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h。
3.两菌串联发酵工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化30min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。再加入可溶性淀粉2%，增湿使含水量达60%，接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵84h。
4.30℃静置培养84h后，检测得小肽含量为8.3%，游离氨基酸为260mg/g，还原糖含量达20.1mg/g，GABA达0.501mg/g,植物乳杆菌活菌数6.5×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达3.21×104IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥或不经干燥加工，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：89%，水分含量≤4%。小肽含量为7.0%，游离氨基酸为240mg/g，乳酸4.95%，还原糖含量为15mg/g，GABA含量为0.317mg/g，活菌数达3×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达3.0×104IU/g。
实施例5：利用串联发酵与纤维素酶酶解工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备
用。选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL。得孢子悬液。
（2）植物乳杆菌种子液制备
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h。
3.串联发酵及酶解工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，90℃熟化30min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。增湿至含水量为60%，加入10mg/g纤维素酶（以发酵基质质量为基准添加市售商品纤维素酶，纤维素酶酶活20～80U/g酶）（购自无锡雪梅制剂科技有限公司），在55℃条件下酶解10h后再加入可溶性淀粉2%，接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵84h。
4.30℃静置培养64h后，检测得小肽含量为9.3%，游离氨基酸为240mg/g，还原糖含量达40.1mg/g。GABA达0.321mg/g,植物乳杆菌活菌数3.6×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达4.31×103IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥或不经干燥加工，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：86%，水分含量≤4%。小肽含量为8.1%，游离氨基酸为220mg/g，还原糖含量为30mg/g，GABA含量为0.301mg/g，活菌数达1.5×1010cfu/ml，抗菌肽抑菌效价达4.02×103IU/g。
实施例6：利用串联发酵与纤维素酶、果胶酶混合酶解工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用。选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL。得孢子悬液。
（2）植物乳杆菌种子液制备
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h。
3.串联发酵及酶解工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化20min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。增湿至含水量为60%，加入10mg/g纤维素酶和果胶酶（3:1，m/m）混合酶（以发酵基质质量为基准添加由市售商品纤维素酶和果胶酶组成的混合酶，纤维素酶酶活20～80U/g酶，果胶酶酶活500～1000U/g酶）（购自无锡雪梅制剂科技有限公司），在55℃条件下酶解10h后再加入可溶性淀粉2%，接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30～35℃厌氧静置发酵84h。
4.30℃静置培养84h后，检测得小肽含量为14.2%，游离氨基酸270mg/g，还原糖含量达55.2mg/g，GABA达0.501mg/g,植物乳杆菌活菌数7.6×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达7.82×103IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥或不经干燥加工，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：88%，水分含量≤4%。小肽含量为12.2%，游离氨基酸270mg/g，还原糖含量为41mg/g，GABA含量为0.401mg/g，活菌数达4.5×1010cfu/ml，抗菌肽抑菌效价达7.51×103IU/g。
实施例7：利用先串联发酵后纤维素酶酶解工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用。选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL。得孢子悬液。
（2）植物乳杆菌种子液制备
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h。
3.串联发酵及酶解工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，110℃熟化20min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。增湿至含水量为60%，加入可溶性淀粉2%，接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵64h，调pH至7.0左右后加入10mg/g纤维素酶，在50℃条件下酶解10h。
4.50℃酶解10h后，检测得小肽含量为7.3%，游离氨基酸为270mg/g，还原糖含量达50.1mg/g，GABA达0.361mg/g,植物乳杆菌活菌数1.7×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达4.62×104IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥或不经干燥加工，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：84%，水分含量≤4%。小肽含量为6.3%，游离氨基酸255mg/g,还原糖含量为42.1mg/g，活菌数达7.6×109cfu/ml，GABA含量为0.301mg/g，抗菌肽抑菌效价达3.71×104IU/g。
实施例8：利用先串联发酵后纤维素酶、果胶酶混合酶酶解工艺生产富含小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕
1.原料准备：优质豆粕膨化，粉碎过40目筛，密封后放于通风干燥处备用。选择优质干燥麸皮作配料。
2.米曲霉孢子悬液和植物乳杆菌种子液制备：
（1）米曲霉孢子悬液的制备：
培养基（PDA）：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为水，pH自然。
米曲霉（沪酿3.042）从PDA斜面接种于PDA茄子瓶斜面中培养3天，用无菌水洗脱，使孢子浓度达107个/mL。得孢子悬液。
（2）植物乳杆菌种子液制备：
植物乳杆菌种子培养基（MRS）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸氢二钾3.3g/L，吐温801mL/L，MnSO4·H2O0.05g/L，MgSO4·7H2O0.02g/L，溶剂为水，pH6.2～6.4。
种子培养：250mL三角瓶中装入50mL MRS培养液，挑取纯化的植物乳杆菌CCTCC No：M2011364接入MRS培养液，用保鲜膜封口，于30℃静置培养18h。
3.串联发酵及酶解工序：豆粕91%，麸皮9%，硫酸铵3.6%，含水量为54%，100℃熟化30min，自然pH，接种量（v/m）为10%，30～35℃，前12h每3～4小时翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36h。增湿至含水量为60%，加入可溶性淀粉2%，接入植物乳杆菌种子液，接种量（v/m）为10%，30-35℃厌氧静置发酵54h，调pH至6.0左右后加入10mg/g纤维素酶和果胶酶混合酶（3:1，m/m）（以发酵基质质量为基准添加由市售商品纤维素酶和果胶酶组成的混合酶，纤维素酶酶活20～80U/g酶，果胶酶酶活500～1000U/g酶）（购自无锡雪梅制剂科技有限公司），在50℃条件下酶解10h。
4.50℃酶解10h后，检测得小肽含量为7.8%，游离氨基酸280mg/g，还原糖含量达60.1mg/g GABA达0.381mg/g,植物乳杆菌活菌数1.5×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达6.87×104IU/g。
5.对益生型发酵豆粕进行低温干燥或不经干燥加工，温度为35～50℃。
6.干燥后发酵豆粕得收率为：89%，水分含量≤4%。小肽含量为6.4%，游离氨基酸260mg/g，还原糖含量为49.1mg/g，活菌数达7.2×109cfu/ml，GABA含量为0.311mg/g，抗菌肽抑菌效价达6.32×104IU/g。

Claims (7)

1.一种富含小肽、γ-氨基丁酸、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法，所述方法包括：
（A）豆粕经膨化、粉碎后，与麸皮混合作为固体发酵培养基主要成分配制固体发酵培养基，熟化后接入米曲霉、黑曲霉、红曲霉、假丝酵母、酿酒酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种或多种，30～35℃下进行固态发酵，前12h每3～4h翻曲，12～24h静置培养，24h翻曲后静置培养至36～60h；麸皮质量用量占豆粕与麸皮质量之和的1～10%；
（B）步骤（A）发酵产物加入可溶性淀粉，经增湿后接入植物乳杆菌CCTCC No：M2011364，30～35℃厌氧静置发酵24～86h；
（C）发酵结束后，步骤（B）发酵产物经低温干燥或不干燥，获得所述益生型发酵豆粕。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤（A）与（B）之间，或者在步骤（B）与（C）之间，还包括酶解处理步骤：步骤（A）或（B）发酵产物经增湿后，加入复合酶或者不加入酶，于40～60℃进行酶解或水解6～15h；所述酶为下列之一或其中两种以上的混合物：蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、鼠李糖苷酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（A）中固体发酵培养基组成如下：豆粕90～95%，麸皮5～10%，豆粕与麸皮总量为100%，并添加2～5%的硫酸铵，含水量40～60%。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步骤（A）中熟化方法为在灭菌锅中90～121℃处理10～30min。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述增湿为加水至含水量55～70%。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述酶为纤维素酶或者纤维素酶与果胶酶的混合物。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述可溶性淀粉加入量为豆粕和麸皮总质量的1～3%。
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