CN103283944A

CN103283944A - 一种侧胞芽孢杆菌wy9701制剂的固体发酵生产方法

Info

Publication number: CN103283944A
Application number: CN2013102285260A
Authority: CN
Inventors: 李帅伟; 李本涛
Original assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU GLAM BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明属于微生物领域，涉及采用侧胞芽孢杆菌WY9701通过固体发酵制备微生态制剂的方法。接种于经过优化的固体发酵培养基中，30~33℃培养，经过三级放大而进行大规模发酵生产。生产工艺简单稳定，活菌体密度高，发酵产物无需分离纯化可以直接干燥使用，操作简单，效果稳定，能耗低，降低了生产成本，提高了生产效率，易于推广使用。

Description

一种侧胞芽孢杆菌WY9701制剂的固体发酵生产方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体地说是一种固体培养基经侧胞芽孢杆菌WY9701发酵制备益生菌饲料添加剂的方法及其在养殖业中的应用。

背景技术

侧胞芽孢杆菌（Bacillus Lateraporus）属于芽孢杆菌属（Bacillus），需氧或兼性厌氧，其细胞大小为（0.5~0.8）×（2.5~5.0）μm，革兰氏染色阳性，可变为阴性，芽孢形态为近中生的为椭圆形，侧生、中生或近中生，孢囊膨大，游离芽胞一边比另一边厚（独木舟形），大多数有动力，荚膜，通常过氧化氢酶阳性。侧胞芽孢杆菌是经国家农业部批准使用的一种天然菌种。侧胞芽孢杆菌具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点；侧胞芽孢杆菌能分泌合成多种有机酸、酶等生理活性物质。

由于侧胞芽孢杆菌WY9701具有芽孢，具有耐酸、耐碱、耐高温及耐挤压等特点，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可直达大小肠的活菌，在制粒过程及胃酸环境中均能保持高度的稳定性，在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞，以自身的耗氧来抑制肠道中有害需氧菌的生长，从而促使以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长，提高机体免疫力；能降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，提高饲料的转化率；能产生多种酶类，促进动物对营养物质的吸收，增强机体的免疫功能；侧胞芽孢杆菌WY9701还能产生多种营养物质，如维生素、氨基酸、促生长因子等，参与机体的生长代谢，提高生长速度。此外还能除臭驱蝇，减少污染，控制细菌性疾病，能减少粪便中氮、磷、钙的***量，减少粪便臭味及有害气体排放，从而减少环境污染。

目前，侧胞芽孢杆菌WY9701作为一种新型微生态制剂，在家畜和水产养殖生产中的应用效果及作用机理引起了许多学者的广泛关注和研究。

侧胞芽孢杆菌WY9701的作用及使用效果：（1）具有广谱抗菌作用：侧胞芽孢杆菌WY9701具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌都有一定的拮抗作用，大量的研究表明，饲用侧胞芽孢杆菌WY9701具有拮抗肠道病原细菌，维持和调节肠道微生态平衡的作用；（2）增强机体免疫力：侧胞芽孢杆菌WY9701能刺激机体免疫***，提高机体免疫力，是良好的免疫刺激剂，能有效地提高巨嗜细胞的数量和活性，通过产生抗体和提高嗜菌作用等刺激免疫，激发体液免疫和细胞免疫，致使动物免疫活性增强，芽孢杆菌能促使吞噬细胞吞噬功能增强，机体免疫特别是局部免疫提高，分泌型IgA的分泌增加，从而抵抗感染；（3）提高饲料转化率：侧胞芽孢杆菌WY9701制成微生态制剂饲喂动物，均能提高消化道的酶活性，芽孢杆菌能使机体淀粉酶和总蛋白酶活性升高，对早期生长和提高饲料转化率有良好的效果，使动物肠道酸化而有利于铁、钙及维生素D等的吸收，促进动物生长，缩短养殖周期。

以往的侧胞芽孢杆菌WY9701的发酵方式主要存在以下问题和不足：（1）大量采用胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为培养基主要营养成分，生产成本高；（2）大量采用液体发酵方式，下游处理工艺复杂，处理周期长，对菌种活性影响较大，成本高；（3）发酵产物的活菌密度不够高。

发明内容

本发明的目的是提供一种侧胞芽孢杆菌WY9701活菌制剂的制备方法，以克服现有的侧胞芽孢杆菌WY9701活菌制剂的制备方法上存在的上述不足。

对侧胞芽孢杆菌WY9701固体发酵培养基进行单因素试验和5因素3水平正交试验对其培养基配方进行改进，得到最佳固体培养基配方，以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（玉米粉40~70%；小麦粉15~30%；豆饼粉5~15%），葡萄糖1.5%，NaCl 0.6%，KH₂PO₄0.3%，MnSO₄·H₂O 0.04%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀。将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用。对侧胞芽孢杆菌WY9701发酵条件进行优化以得到其最佳培养温度为32.5℃，起始pH值8.0，接种量2%，此条件下侧胞芽孢杆菌WY9701对数生长期在发酵18小时左右。

一种侧胞芽孢杆菌WY9701制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）制备种子菌；

（2）配制固体发酵培养基并高压灭菌；

（3）一级种子接种并固体发酵；

（4）将一级发酵产物作为种子接种固体培养基并且进行二级发酵；

（5）将二级发酵产物作为种子接种固体培养基，控制好温度和湿度，继续放大发酵；

（6）测定发酵培养物活菌数；

（7）将发酵培养物进行干燥、粉碎和包装。

与现有技术相比，本发明的技术优势：

（1）直接利用普通固体发酵罐即可进行生产，操作简单，质量稳定，成本低廉，易于产业化生产；

（2）产品发酵周期明显缩短,产品到达终点酸度或pH值的时间为18～24小时，而传统的侧胞芽孢杆菌WY9701单独发酵达到同样的酸度或pH值需要48小时甚至更长时间；生产周期大大缩短短，易于产业化，从而可将侧胞芽孢杆菌WY9701广泛应用于畜牧养殖业；

（3）产品成本与发酵污染风险降低:本发明由于生产周期缩短，生产成本降低，能较好抑制杂菌污染，产品发酵失败风险大大降低；

（4）本发明采用豆饼粉和玉米粉作为发酵培养基的主要成分，与其他发明采用的胰化蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏及其酶解产物等作为主要成分相比，成本大大降低，并且侧胞芽孢杆菌WY9701菌数含量明显提高，发酵产物活菌浓度可达1.0~2.5×10⁹ CFU/mL；

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1 固体发酵生产侧胞芽孢杆菌WY9701培养物的工艺流程

1.菌种活化：

本发明采用侧胞芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）WY9701作为发酵菌种，菌种保藏编号：SCTCC 100657，购于中国工业微生物菌种保藏中心，将-80℃保存的侧胞芽孢杆菌WY9701菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，调pH8.0，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，33℃培养24小时。

2.制备一级种子：

将活化的侧胞芽孢杆菌WY9701菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL 液体种子培养基中（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，调pH8.0，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，33℃，250rpm，振荡培养24小时后，制得一级种子液。

3.配制固体发酵培养基：

固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（玉米粉70%；小麦粉20%；豆饼粉10%），葡萄糖1.5%，NaCl 0.6%，KH₂PO₄0.3%，MnSO₄·H₂O 0.04%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀。将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用。

4.固体发酵：

将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照5%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为40~60%，温度为33℃培养24个小时，制得二级种子。将二级种子按照5%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为40~60%，温度为33℃培养24个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照5%的接种量进一步扩大培养；将侧胞芽孢杆菌WY9701培养物进行菌落计数，活菌体浓度达2.2×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率92%。

5.将固体发酵的侧胞芽孢杆菌WY9701培养物进行50~65℃干燥不超过60min，粉碎和包装，制成产品。

实施例2 与上述实施例1不同的是：

（1）培养基配方：固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（玉米粉50%；小麦粉35%；豆饼粉15%），葡萄糖1.5%，NaCl 0.6%，KH₂PO₄0.3%，MnSO₄·H₂O 0.04%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀。将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（2）控温发酵：接入保加利亚乳杆菌液体种子的接种量为3%，搅拌均匀，起始pH 8.0，，发酵温度控制在30~32℃，发酵24个小时，放罐，将保加利亚乳杆菌培养物进行菌落计数，经过这样发酵的活菌体浓度为1.45×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率90%。

（3）将固体发酵的侧胞芽孢杆菌WY9701培养物进行低温干燥，粉碎和包装，制成用于畜禽养殖的微生态饲料添加剂。

Claims

1.一种侧胞芽孢杆菌WY9701制剂的制备方法包括以下步骤：

（1）菌种活化：

本发明采用侧胞芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）WY9701作为发酵菌种，菌种保藏编号：SCTCC 100657，购于中国工业微生物菌种保藏中心，将-80℃保存的侧胞芽孢杆菌WY9701菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，调pH8.0，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，33℃培养24~48小时；

（2）制备一级种子：

将活化的侧胞芽孢杆菌WY9701菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL 液体种子培养基中（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，调pH8.0，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，33℃，250rpm，振荡培养24~48小时后，制得一级种子液；

（3）配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（玉米粉40~70%；小麦粉15~30%；豆饼粉5~15%），葡萄糖1.5%，NaCl 0.6%，KH₂PO₄0.3%，MnSO₄·H₂O 0.04%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀；将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照3~5%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为40~60%，温度为30~33℃培养24~28个小时，制得二级种子；将二级种子按照3~5%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为40~60%，温度为30~33℃培养24~48个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照3~5%的接种量进一步扩大培养；将侧胞芽孢杆菌WY9701培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达1.0~2.5×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率在90%以上；

（5）将固体发酵的侧胞芽孢杆菌WY9701培养物进行低温干燥或者50~65℃干燥不超过60min，粉碎和包装，制成产品。

2.根据权利要求1所述的侧胞芽孢杆菌WY9701固体发酵生产，其特征在于所述的固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（玉米粉40~70%；小麦粉15~30%；豆饼粉5~15%），葡萄糖1.5%，NaCl 0.6%，KH₂PO₄0.3%，MnSO₄·H₂O 0.04%。

3.根据权利要求1所述的侧胞芽孢杆菌WY9701固体发酵，其特征在于：培养温度为30~33℃，湿度为40~60%。

4.根据权利要求1所述的侧胞芽孢杆菌WY9701固体发酵，其特征在于：各级种子菌接种量为3~5%的接种量。

5.根据权利要求1所述的侧胞芽孢杆菌WY9701固体发酵，其特征在于：所用的菌种为芽孢杆菌属侧胞芽孢杆菌WY9701。

6.根据权利要求1所述的侧胞芽孢杆菌WY9701发酵，其特征在于：作为饲料添加剂的应用领域为畜禽饲料添加剂。