CN103283604A - 百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，通过预处理、内生菌浸出、表面消毒、接种培养、连续消毒，采用无菌去离子水浸泡百合外植体，可以使外植体表层细胞破裂，内生菌溢出，易于清除。并采用连续表面消毒，消毒三次后百合外植体的内生菌污染率可以控制在5%左右，为百合组织培养产业解决了内生菌污染严重的问题。该种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，能够有效的杀灭百合鳞片中的内生菌，为百合的组织培养提供了一种易操作、效果好的外植体制备方法，且在整个过程中较大程度地节约材料、降低成本，并能够最大限度的脱除百合外植体中的内生菌，与常规的方法相比大大的节省了百合外植体，减少了人力物力的投入。

Description

百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法
技术领域
   本发明涉及一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法。
背景技术
百合,为百合科百合属多年生球根类花卉，是目前世界上最受欢迎的高档切花之一。除观赏价值外，百合还具有丰富的营养价值与重要的药用价值。其常规繁殖方式为分植小鳞茎，有的种类可用鳞片扦插，但年繁殖率低，数量有限，且百合易受病毒侵染。国内自然繁殖的种球质量普遍不佳，进口的和脱毒种球也不能连年使用，造成百合的国内外市场空缺很大，在鲜切花市场不断走俏。应用植物组培快繁方法在一定程度上解决了百合优质鳞茎短缺的现象，有关百合的快速繁殖技术国内多有报道。
但是，在百合组织培养的初期阶段有一个共同的问题，那就是百合外植体中内生菌无法有效的去除，特别是百合鳞片。目前，百合组织培养中主要使用酒精、升汞、次氯酸等进行百合外植体表面消毒，初期培养中不断观察，凡是有污染的立即去除，往往只能保留下来很少的没有被内生菌污染外植体，这样不仅浪费了材料、而且浪费了人力物力。
    上述问题是在百合组织培养过程中应当予以考虑并解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法解决现有技术中存在的在百合组织培养的初期阶段，百合外植体中，特别是百合鳞片中，内生菌无法有效的去除的问题。
本发明的技术解决方案是：
一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，包括以下步骤：
a、预处理：将百合鳞茎用清水清洗去除表面泥沙，剥下鳞片再次清洗，在超净台中将百合鳞片切成小块；
b、内生菌浸出：将步骤a中所得百合鳞片小块放入装有无菌去离子水的容器中，容器密封后放置将内生菌浸出；
c、表面消毒：在超净台中将步骤b中无菌去离子水浸泡过的百合鳞片小块进行表面消毒；
d、接种培养：将步骤c中表面消毒后的百合鳞片小块接种到固体培养基中，培养观察有无内生菌； 
e、连续消毒：在步骤d的接种后培养观察，如果培养基中长出百合内生菌，取出百合鳞片进行连续消毒后继续接种观察，重复对长出百合内生菌的百合鳞片进行连续消毒与接种观察，直到培养基中无百合内生菌长出。
优选地，所述步骤a的预处理中将百合鳞片去除表皮，并切割成0.5~6.0cm2的小块。
优选地，所述步骤b中所述密封容器放置在温度为25~37℃环境中放置0.5~8h，优选2~5h，进行内生菌浸出。
优选地，所述步骤c中表面消毒的具体步骤为：在超净台中将百合鳞片小块从无菌去离子水中取出，用无菌水清洗1~3遍后，放入75%的乙醇中浸泡0.1~0.5min，再由无菌水清洗2~3次后，放入浓度0.1%的升汞溶液中1~30min，优选8~15min后，再由无菌水清洗5~8次。
优选地，所述步骤c中表面消毒后，切除百合鳞片小块表皮。
优选地，所述步骤e中接种使用的固体培养基的配方为：MS+0.5~2.0mg/L 6-BA+0.01~0.5mg/L NAA+0.1~0.5mg/L 多菌灵+25~35g/L蔗糖+5~10g/L琼脂粉PH5.0~6.8，其中，6-BA为6-苄氨基嘌呤，所述NAA为α-萘乙酸。
优选地，所述使用固体培养基的培养环境为温度25~27℃，光照周期为10~14h/d。
优选地，所述步骤e中连续消毒具体为：在超净台中将百合鳞片从固体培养中取出，无菌水清洗2~3遍后，放入75%的乙醇中浸泡0.1~0.3min，无菌水清洗2~3次，再放入0.1%的升汞溶液中1~15min，优选5~10min，无菌水清洗4~7次。
本发明的有益效果是：本发明一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，能够有效的杀灭百合鳞片中的内生菌，为百合的组织培养提供了一种易操作、效果好的外植体制备方法。该种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，采用无菌去离子水浸泡百合外植体，可以使外植体表层细胞破裂，内生菌溢出，易于清除。并采用连续表面消毒，消毒三次后百合外植体的内生菌污染率可以控制在5%左右，为百合组织培养产业解决了内生菌污染严重的问题。该种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，操作简单，使用仪器或试剂均为植物组织培养中常用品，相关技术人员均能方便的使用该方法。该种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，在整个过程中较大程度地节约材料、降低成本，并能够最大限度的脱除百合外植体中的内生菌，与常规的方法相比大大的节省了百合外植体，减少了人力物力的投入。
具体实施方式
下面详细说明本发明的优选实施例。
一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，包括以下步骤：
a、预处理：将百合鳞茎用清水清洗去除表面泥沙，剥下鳞片再次清洗，在超净台中将百合鳞片切成小块；
b、内生菌浸出：将步骤a中所得百合鳞片小块放入装有无菌去离子水的容器中，容器密封后放置将内生菌浸出；
c、表面消毒：在超净台中将步骤b中无菌去离子水浸泡过的百合鳞片小块进行表面消毒；
d、接种培养：将步骤c中表面消毒后的百合鳞片小块接种到固体培养基中，培养观察有无内生菌； 
e、连续消毒：在步骤d的接种后培养观察，如果培养基中长出百合内生菌，取出百合鳞片进行连续消毒后继续接种观察，重复对长出百合内生菌的百合鳞片进行连续消毒与接种观察，直到培养基中无百合内生菌长出。
本实施例提供一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，通过预处理、内生菌浸出、表面消毒、接种培养、连续消毒，实现对百合鳞茎的有效消毒杀菌，将内生菌污染率控制较小的范围内。
该种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，首先，将百合鳞茎用清水清洗去除表面泥沙，剥下鳞片再次清洗，在超净台中将百合鳞片切成0.5~6.0cm2，优选为2.0~4.0 cm2小块，完成对百合鳞茎的预处理；将所得百合鳞片小块放入装有无菌去离子水的容器中，容器密封后在温度为24-28℃环境中放置4h将内生菌浸出；在超净台中将百合鳞片小块从无菌去离子水中取出，用无菌水清洗1~3遍后，放入75%的乙醇中浸泡0.1~0.5min，再由无菌水清洗2~3次后，放入浓度0.1%的升汞溶液中1~30min，优选8~15min后，再由无菌水清洗5~8次，表面消毒后，切除百合鳞片小块表皮；将表面消毒后的百合鳞片小块接种到固体培养基中，在温度25~27℃、光照周期12h/d条件下培养观察有无内生菌出现；在百合鳞片小块的接种后培养观察，如果培养基中长出百合内生菌，立即取出鳞片，在超净台中将百合鳞片用无菌水清洗2遍后，放入75%的乙醇中浸泡15s，无菌水清洗2次，再放入0.1%的升汞溶液中8min，无菌水清洗6次，消毒完成后，继续培养观察，如果再次出现内生菌，重复连续消毒，如此往复直到培养基中无百合内生菌污染为止。
通过实验的统计数据进一步验证本实施例的有益效果如下：
本实施例方法对东方百合、索邦百合、兰州百合进行一次表面消毒、二次表面消毒的脱除鳞片中内生菌的实验，并与现有方法处理后的脱除鳞片中内生菌以及不经处理的脱除鳞片中内生菌做比较。
现有方法中外植体消毒为：75%酒精浸泡0.2~0.5min，无菌水清洗2~3次，0.1%升汞浸泡10~20min，无菌水清洗5~7次。不处理、现有方法、本实施例方法的百合组织培养中内生菌污染百分率的实验结果如表1所示。由表1中内生菌的污染百分率统计数据可知，本实施例方法处理后的东方百合、索邦百合、兰州百合的内生菌的污染百分率极大幅度地低于现有方法处理与不处理的，有效地将百合外植体的内生菌污染率控制在5%左右，为百合组织培养产业解决了内生菌污染严重的问题。
表1 百合组织培养中内生菌污染百分率的实验结果
Figure 433376DEST_PATH_IMAGE002

Claims (8)

1.一种百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于,包括以下步骤：
a、预处理：将百合鳞茎用清水清洗去除表面泥沙，剥下鳞片再次清洗，在超净台中将百合鳞片切成小块；
b、内生菌浸出：将步骤a中所得百合鳞片小块放入装有无菌去离子水的容器中，容器密封后放置将内生菌浸出；
c、表面消毒：在超净台中将步骤b中无菌去离子水浸泡过的百合鳞片小块进行表面消毒；
d、接种培养：将步骤c中表面消毒后的百合鳞片小块接种到固体培养基中，培养观察有无内生菌； 
e、连续消毒：在步骤d的接种后培养观察，如果培养基中长出百合内生菌，取出百合鳞片进行连续消毒后继续接种观察，重复对长出百合内生菌的百合鳞片进行连续消毒与接种观察，直到培养基中无百合内生菌长出。
2.如权利要求1所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于：所述步骤a的预处理中将百合鳞片去除表皮，并切割成0.5~6.0cm2的小块。
3.如权利要求1所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于：所述步骤b中所述密封容器放置在温度为25~37℃环境中放置0.5~8h，进行内生菌浸出。
4.如权利要求1所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于，所述步骤c中表面消毒的具体步骤为：在超净台中将百合鳞片小块从无菌去离子水中取出，用无菌水清洗1~3遍后，放入75%的乙醇中浸泡0.1~0.5min，再由无菌水清洗2~3次后，放入浓度0.1%的升汞溶液中1~30min后，再由无菌水清洗5~8次。
5.如权利要求4所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于，所述步骤c中表面消毒后，切除百合鳞片小块表皮。
6.如权利要求1-5任一项所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于：所述步骤e中接种使用的固体培养基的配方为：MS+0.5~2.0mg/L 6-BA+0.01~0.5mg/L NAA+0.1~0.5mg/L 多菌灵+25~35g/L蔗糖+5~10g/L琼脂粉PH5.0~6.8。
7.如权利要求6所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于：所述使用固体培养基的培养环境为温度25~27℃，光照周期为10~14h/d。
8.如权利要求1-5任一项所述的百合组织培养中脱除外植体内生菌的方法，其特征在于，所述步骤e中连续消毒具体为：在超净台中将百合鳞片从固体培养中取出，无菌水清洗2~3遍后，放入75%的乙醇中浸泡0.1~0.3min，无菌水清洗2~3次，再放入0.1%的升汞溶液中1~15min，无菌水清洗4~7次。
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