CN103798139B - 一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物快速繁殖技术领域，旨在提供一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法。该种方法包括步骤：材料采取、愈伤诱导培养基配置、外植体接种及愈伤组织诱导、小植株再生、小植株的继代培养、小植株的出瓶种植。本发明突出具有污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高的特点，特别对于本发明以幼嫩花瓣为外植体，污染率可降低为0，可获得达70%的愈伤诱导率，愈伤团块再生率100%，胚性高，每个花蕾所含的幼嫩花瓣一共可获得3‑12株小植株。
Description
技术领域
本发明是关于植物快速繁殖技术领域，特别涉及一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法。
背景技术
百合胚性愈伤组织再生体系相比其他再生体系如芽再生体系，具有最高的增殖率和扩繁率，对优良种质的保存有重要意义。此外，百合胚性愈伤组织再生体系也是百合遗传转化体系的决定性基础，进而影响百合的基因工程改良。
目前建立百合愈伤再生体系多以田间鳞茎的鳞片为外植体，其缺陷是鳞茎由于长期处于土壤环境中，携带病菌多，使组织培养消毒要求严格，污染率较高。此外，当需要建立野生百合种质的实验室离体体系时，以鳞茎为外植体，只能采用花期后挖取种球，其突出的不足有二：首先，野生百合位置的确定和种类的辨认很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰败和花被片脱落使其种类难以辨认，易造成种质资源的混淆；其次，挖取种球等同于对野生资源完全的采集，对于珍稀濒危种类更是难以回复的破坏。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高，且对种质资源的破坏小的建立百合胚性愈伤再生体系的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，包括以下步骤：
步骤一：材料采取：
在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的（幼嫩）花蕾，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；
步骤二：愈伤诱导培养基配置：
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25～1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；
将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入（玻璃或塑料）培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境（如组培室）下存放；
步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：
将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；
消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠（NaClO）溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；
消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片撕掉，取内层的（幼嫩）花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后，接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养25～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；
步骤四：小植株再生：
愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养40～90天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基；
小植株在继代培养基上生长4周后（平均直径达到1cm以上），可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，每4周继代一次，再进行步骤六中的出瓶种植；
所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0～0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8；（α-萘乙酸不是必需的，但一定浓度的萘乙酸将有利于小植株根系生长，6-苄氨基腺嘌呤不是必需的，但一定浓度的6-苄氨基腺嘌呤将有利于小植株增殖）
步骤五：小植株的继代培养：
步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后（平均直径达到1cm以上），不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；
步骤六：小植株的出瓶种植：
出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质（如Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗专用介质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。
提供一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤遗传转化体系的方法，将步骤三中诱导获得的愈伤组织团块切下或用镊子夹下来，作为遗传转化体系的受体，经农杆菌转染或基因枪介导转化，经过筛选和鉴定，并在再生培养基上分化生根、炼苗、移栽获得百合的转基因植株；
再生培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升再生培养基添加4.43gMS粉，再生培养基中还含有30～60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～2.0mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA），再生培养基的pH值为5.8～6.0。
本发明提供的上述方法可以用于百合愈伤组织再生体系和遗传转化体系中，具体为：对上述方法获得的愈伤组织进行继代培养后分切成小块，接种到相应继代培养基上培养；用该愈伤组织在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得百合的组织培养植株；或将该愈伤组织作为遗传转化体系的受体，在再生培养基上分化生根，炼苗、移栽即可获得百合的转基因植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以百合幼嫩花瓣为外植体，具有污染率低、材料易得的特点，其突出的优势在于体系高效率、外植体幼嫩、少病毒。对于野生百合的种质资源保存来说，在百合花期取得幼嫩花瓣用于建立实验室愈伤再生体系，而不是花期后挖取种球，以花瓣特点更容易确认野生百合的种类，并极大地减少了对野生种质资源的破坏。本发明还突出具有污染率低、愈伤诱导率高、愈伤团块大、愈伤胚性好、再生能力强、增殖率高的特点，特别对于本发明以幼嫩花瓣为外植体，污染率可降低为0，可获得达70%的愈伤诱导率，愈伤团块再生率100%，胚性高，每个花蕾所含的幼嫩花瓣一共可获得3-12株小植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，包括以下步骤：
步骤一：材料采取：
在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作。
步骤二：愈伤诱导培养基配置：
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25～1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)；愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8。
将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入玻璃或塑料的培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在组培室或其他无菌洁净环境下存放。
步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：
将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；
消毒方法如下：用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v的次氯酸钠（NaClO）溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；
消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片撕掉，取内层的幼嫩花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养25～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块。
步骤四：小植株再生：
愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养40～90天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基；
小植株在继代培养基上生长4周后，平均直径达到1cm以上，可进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，每4周继代一次，再进行步骤六中的出瓶种植。
所述继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0～0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8。其中，α-萘乙酸不是必需的，但一定浓度的萘乙酸将有利于小植株根系生长，6-苄氨基腺嘌呤不是必需的，但一定浓度的6-苄氨基腺嘌呤将有利于小植株增殖。
步骤五：小植株的继代培养：
步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后，平均直径达到1cm以上，不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新配置的继代培养基上，继续步骤四的培养。
步骤六：小植株的出瓶种植：
出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的小植株在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质（如Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗基质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立。
下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1以东方百合‘索邦’花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系
（1）花蕾期取0.5cm长的百合幼嫩花苞，在封口袋中冷藏于4摄氏度冰箱中，冷藏一周后取出进行处理。
（2）将花苞在添加了洗涤精的自来水中浸泡30min，在流水下冲洗75min，清洗干净后，在超净工作台上用添加了0.1%v/v吐温的1%w/v次氯酸钠溶液，进行表面消毒8min，然后用无菌水冲洗3遍。用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片(已为消毒液破坏)撕掉，取内层的幼嫩花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、完全黑暗条件下培养25天开始出现愈伤组织，污染率为0。
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、1.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)；愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8。
愈伤团块若在愈伤诱导培养基上培养130天后直径最大可达4.80mm。其中，愈伤团块大小以游标卡尺测量，由于愈伤团块近球形或长宽相等，故以其直径作为愈伤团块大小衡量标准，并伴随着小植株的分化。
（3）愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块一起在超净工作台上转接到柱形瓶中的新鲜愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下培养40天，平均每块外植体可分化出4棵小植株，将小植株从外植体上分切下来，转接到新鲜的继代培养基上。
继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基添加4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、8g/L琼脂，继代培养基的pH值为5.8。
（4）步骤（3）中的小植株在继代培养基上生长4周后，鳞茎平均直径达到1cm以上，小植株直接进行出瓶种植。将继代培养基上的小植株置于5摄氏度黑暗条件下进行低温处理40天；将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15min，然后种入育苗专用介质（Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗基质中的深度在1cm，进行栽培管理。小植株生长健壮，存活率100%。该体系增殖效率达到1：12，即平均每个花蕾所含的幼嫩花苞（3片）最终产生12棵小植株。
实施例2以东方百合‘索邦’花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系
（1）花蕾期取1.5cm长的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4摄氏度冰箱冷藏一周后，再进行后续操作。
（2）将花苞在添加了洗涤精的自来水中浸泡18min，在流水下冲洗30min，清洗干净后，在超净工作台上用添加了0.1%（v/v）吐温的1%(w/v)次氯酸钠溶液进行表面消毒10min，然后用无菌水冲洗3遍。用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片(已为消毒液破坏)撕掉，取内层的幼嫩花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、完全黑暗条件下培养32天开始出现愈伤组织，污染率为0。
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)；愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8。
愈伤团块若在愈伤诱导培养基上培养130天后直径最大可达4.83mm。其中，愈伤团块大小以游标卡尺测量，由于愈伤团块近球形或长宽相等，故以其直径作为愈伤团块大小衡量标准，并伴随着小植株的分化。
（3）愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块一起在超净工作台上转接到柱形瓶中的新鲜愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下培养60天，平均每块外植体可分化出3棵小植株，将小植株从外植体上分切下来，转接到新鲜的继代培养基上。
继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基添加4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、6g/L琼脂、0.1mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.1mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,NAA），继代培养基的pH值为5.8。
（4）步骤（3）中的小植株在继代培养基上生长4周后，鳞茎平均直径在1.2cm，达到1cm以上，小植株直接进行出瓶种植。将继代培养基上的小植株置于4摄氏度黑暗条件下进行低温处理50天；将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒25min，然后种入育苗专用介质（Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗基质中的深度在1.5cm，进行栽培管理。小植株生长健壮，存活率100%。该体系增殖效率达到1：9，即平均每个花蕾所含的幼嫩花苞（3片）最终产生9棵小植株。
实施例3以东方百合‘索邦’花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系
（1）花蕾期取2cm长的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4摄氏度冰箱，冷藏一周后取出外植体进行处理。
（2）将花苞在添加了洗涤精的自来水中浸泡5min，在流水下冲洗120min，清洗干净后，在超净工作台上用添加了0.1%（v/v）吐温的1%（w/v）次氯酸钠溶液进行表面消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍。用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片(已为消毒液破坏)撕掉，取内层的幼嫩花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、完全黑暗条件下培养40天开始出现愈伤组织，污染率为0。
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)；愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8。
愈伤团块若在愈伤诱导培养基上培养130天后，直径最大可达3.60mm。其中，愈伤团块大小以游标卡尺测量，由于愈伤团块近球形或长宽相等，故以其直径作为愈伤团块大小衡量标准，并伴随着小植株的分化。
（3）愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块一起在超净工作台上转接到柱形瓶中的新鲜愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下培养90天，平均每块外植体可分化出2棵小植株，将小植株从外植体上分切下来，转接到新鲜的继代培养基上。小植株在继代培养基上生长4周，鳞茎平均直径在1.3cm。
继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基添加4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4g/L琼脂、0.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid,NAA），继代培养基的pH值为5.8。
（4）步骤（3）中的小植株在继代培养基上生长4周，鳞茎平均直径在1.3cm，达到1cm以上，小植株直接进行出瓶种植。将继代培养基上的小植株置于1摄氏度黑暗条件下进行低温处理30天；将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒30min，然后种入育苗专用介质（Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗基质中的深度在2cm，进行栽培管理。小植株生长健壮，存活率100%。该体系增殖效率达到1：6，即平均每个花蕾所含的幼嫩花苞（3片）最终产生6棵小植株。
实施例4以东方百合‘索邦’花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系
（1）花蕾期取2cm长的百合幼嫩花苞，封在口袋中冷藏于4摄氏度冰箱，冷藏一周后取出外植体进行处理。
（2）将花苞在添加了洗涤精的自来水中浸泡5min，在流水下冲洗120min，清洗干净后，在超净工作台上用添加了0.1%（v/v）吐温的1%（w/v）次氯酸钠溶液进行表面消毒15min，然后用无菌水冲洗3遍。用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片(已为消毒液破坏)撕掉，取内层的幼嫩花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、完全黑暗条件下培养40天开始出现愈伤组织，污染率为0。
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为愈伤诱导培养基溶液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)；愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8。
愈伤团块若在愈伤诱导培养基上培养130天后，直径最大可达3.60mm。其中，愈伤团块大小以游标卡尺测量，由于愈伤团块近球形或长宽相等，故以其直径作为愈伤团块大小衡量标准，并伴随着小植株的分化。
（3）愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块一起在超净工作台上转接到柱形瓶中的新鲜愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下培养90天，平均每块外植体可分化出2棵小植株，将小植株从外植体上分切下来，转接到新鲜的继代培养基上。小植株在继代培养基上生长4周，鳞茎平均直径在1.3cm。
继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升继代培养基添加4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4g/L琼脂、0.2mg/L6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.2mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthaleneaceticacid,NAA），继代培养基的pH值为5.8。
（4）步骤（3）中的小植株在继代培养基上生长4周后，鳞茎平均直径在1.3cm，达到1cm以上，小植株不出瓶，进行继代以维持百合离体鳞茎再生体系：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到按步骤（3）配置的新鲜的继代培养基上，继续进行继代培养；
（5）小植株在继代培养基上生长4周后，再生出小植株，对小植株直接进行出瓶种植。将继代培养基上的小植株置于1摄氏度黑暗条件下进行低温处理30天；将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒30min，然后种入育苗专用介质（Custom growing mix,Fafard）中，小植株种入育苗基质中的深度在2cm，进行栽培管理。小植株生长健壮，存活率100%。该体系增殖效率达到1：6，即平均每个花蕾所含的幼嫩花苞（3片）最终产生6棵小植株。
最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：材料采取：
在百合花期，取百合长0.5～2.0cm的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4摄氏度的冰箱中冷藏1周后，再进行后续操作；
步骤二：愈伤诱导培养基配置：
愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige
and Skoog, 1962) 为基本培养基，即采用每升纯水中溶解4.43gMS粉作为培养基基础液，愈伤诱导培养基溶液中还含有30g/L的蔗糖、5g/L琼脂、0.25 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0.25～1.5 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic，2,4-D)，愈伤诱导培养基溶液的pH值为5.8；
将配置好的愈伤诱导培养基溶液灭菌后，在超净工作台上进行分装，即将愈伤诱导培养基溶液倒入培养皿中，待愈伤诱导培养基溶液凝固成愈伤诱导培养基后，用保鲜膜或锡纸将至少一个盛有愈伤诱导培养基的培养皿包裹好，放在无菌洁净环境下存放；
步骤三：外植体接种及愈伤组织诱导：
将步骤一中处理后的花蕾，在添加了洗涤精的自来水中浸泡5～30min，再在流水下冲洗0.5～2 h清洗干净，然后在超净工作台上进行消毒接种；
消毒方法如下：用添加了0.1% v/v吐温的1% w/v 的次氯酸钠（NaClO）溶液，将清洗干净的花蕾进行表面消毒8～15min，然后用无菌水冲洗3遍；
消毒后进行接种：用镊子和解剖刀将花蕾最外层的苞片撕掉，取内层的花瓣，用解剖刀在其表面处理出划痕、切口或创伤后，接种于盛有愈伤诱导培养基的培养皿上，并使创伤面接触培养基表面；将接种了外植体的培养基在25摄氏度、黑暗条件下培养25～40天，完成愈伤组织的诱导，出现愈伤组织团块；
步骤四：小植株再生：
愈伤组织诱导后，将外植体连同愈伤组织团块转接到新鲜的愈伤诱导培养基上，在照度为1800lux、12h光照/12h黑暗的光照条件下，培养40～90天后，在超净工作台上将小植株从愈伤组织团块上分离下来，转入继代培养基；
小植株在继代培养基上生长4周后，平均直径达到1cm以上，进行步骤六中的出瓶种植，或者不出瓶，进行步骤五中的继代以维持百合离体鳞茎再生体系，每4周继代一次，再进行步骤六中的出瓶种植；
所述继代培养基以MS培养基(Murashige
and Skoog, 1962) 为基本培养基，即每升继代培养基中添加有4.43gMS粉，继代培养基中还含有60g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂、0～0.2 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-benzyladenine,6-BA）、0～0.2 mg/L α-萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid,
NAA），继代培养基的pH值为5.8；
步骤五：小植株的继代培养：
步骤四中的小植株在继代培养基上生长4周后，平均直径达到1cm以上，不出瓶，进行继代的方法是：小植株在继代培养基上生长，基生根生长健壮，根部上端转绿后，进行小植株的转接；转接方法是：在超净工作台上，将小植株取出，将其根全部切除，叶片也从基部切除，仅保留小鳞茎和少量鳞茎盘，将小鳞茎转接到新鲜的继代培养基上，继续步骤四的培养；
步骤六：小植株的出瓶种植：
出瓶前进行低温锻炼，将组培容器中的继代培养基上培养的小植株，在1～5摄氏度、黑暗条件下进行30～50天的低温处理；低温处理后，将组培容器中的小植株整个取出，在流水下冲洗，洗净根部的培养基，再将小植株放入网兜中，在多菌灵1000倍溶液中浸泡消毒15～30min，然后种入育苗专用介质中，小植株种入育苗专用介质中的深度在1～2cm范围内，即小鳞茎顶端距土表一球高左右，进行栽培管理，即完成百合胚性愈伤再生体系的建立；
且在百合胚性愈伤再生体系的建立中，污染率为0，愈伤诱导率达70%，愈伤团块再生率为100%，每个花蕾所含的幼嫩花瓣能获得3～12株小植株。
2.根据权利要求1所述的一种以花瓣为外植体建立百合胚性愈伤再生体系的方法，其特征在于，所述育苗专用介质采用Custom growing mix, Fafard。
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