CN103283493B - 一种广东虫草子实体规模化栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及虫草子实体栽培技术领域，具体涉及一种广东虫草子实体规模化栽培方法，包括如下步骤：A、配料；B、菌种制备：B1、斜面菌种；B2、摇瓶菌种；B3、发酵菌种；C、接种和菌丝体培养；D、子实体培养；E、采收。本发明采用深层发酵的发酵菌种代替现有的多级摇瓶种，深层发酵的菌种菌丝活力强，菌丝球大小均一度较好，在无菌环境下，可以采用自动接种机或人工手动喷洒接种，实现流水线作业，接种量稳定，每瓶为40~60mL，喷洒均一，菌丝萌发快，降低污染率，并且出子实体的时间较现有技术快3~5天，整个生产周期缩短10天左右，与现有技术的摇瓶菌种接种相比还可以节省人工和原材料成本。
Description
技术领域
本发明涉及虫草子实体栽培技术领域，具体涉及一种广东虫草子实体规模化栽培方法。
背景技术
现今世界范围内已发现的虫草属真菌有450多种，国内已报道的超过100种，广东地区则发现了30多种。有资料表明，许多虫草属真菌富含多种氨基酸、微量元素和维生素等营养成分，以及腺苷、虫草素、虫草酸等活性成分，具有抗肿瘤、抗病原、抗氧化以及增强人体免疫力等多种药理功能，随着人们生活水平的提高和对健康食品需求的增加，冬虫夏草日益受到人们的喜爱，但至今为止，冬虫夏草划还未能规模化地人工栽培，而不断增加的需求和高昂的价格导致人们对野生冬虫夏草的过度采集，使其野生资源日益稀缺。因此积极开发利用虫草属真菌资源，实现高活性虫草种类的人工生产种植具有十分重要的意义。
广东虫草（Cordyceps guangdongensis T.H.Li,Q.Y.Lin&B.Song）是目前仅发现于广东地区的一种虫草资源。经分析，这种虫草具有高活性成分，其子实体的腺苷含量达0.81mg/g，虫草酸含量达392mg/g，明显高于冬虫夏草的含量（腺苷0.27mg/g，虫草酸130mg/g），而且气味芳香，味道甘甜无毒。因此广东虫草具有一定的市场潜力，作为冬虫夏草的替代品进行产业化研究不仅是可行的，而且具有较大的经济价值和一定的科学意义。
申请号为200610035774.3的中国发明专利公开了一种高活性野生虫草菌株，其特征在于：该菌株在野外发现并采用组织分离方法获得，该菌株命名为：日本虫草广东变型（Cordyceps japonica f guangdongensis）GDIM-C050423，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC N0：M 206051，简称日木虫草广东变型GDIM-C050423 CCTCC M 206051，其菌株特性为：菌丝生长在固体培养基上，基生菌丝发达，气生菌丝甚少，光照10小时/天，3~4天后，菌丝逐渐转为黄色；子实体形态特征为：子座高5~11cm，头部稍膨大，直径3~6mm，黄褐色至黑褐色，成熟时有颗粒状小点，柄细长，直径2~4mm，褐色。
对比文件还公开了一种高活性野生虫草子实体的人工栽培方法，其特征在于：以日本虫草广东变型GDIM~050423 CCTCC M 206051为出发菌株，经以下栽培阶段：
（1）母种制作：将出发菌株接入无菌的加富PDA斜面培养基中，20~25℃下，暗培养10~15天后，光照4~6天，选取转色较快且菌丝生长整齐的菌种，作为母种；
（2）一级液体菌种制作：将经复壮挑选的母种接至无菌液体培养基中，振荡培养7~10天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2~3毫米的作为一级菌种；
（3）二级生产种：将一级液体菌种按V/V为3%~10%的比例接入液体培养基中，按一级液体菌种的培养方式进行培养，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2~3毫米的作为二级生产种，用于虫草的栽培生产；
（4）接种和出草管理：在无菌室或超净工作台内，将经无菌水稀释的二级生产种接入无菌的栽培培养基中，每瓶接入17~22毫升，再进行避光培养9~14天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强400~1000Lux，空气相对湿度80~90%，18~25℃，经7~12天即可长出子实体原基，再培养40~50天；
（5）采收：待子实体顶部变成圆形，并出现颗粒状小点时，即可采收。
对比文件公开了一种日本虫草广东变型菌株，为后续日本虫草广东变型菌株的研发提供了材料，对比文件公开的栽培方法包括：母种制作→一级液体菌种制作→二级生产种制作→接种和出草管理→采收，对比文件的栽培方法存在以下不足：接种采用多级摇瓶种，多级摇瓶种的菌丝活力较弱，菌丝球大小均一度较差，很难实现大规模的自动化栽培；且菌丝萌发慢，出子实体的时间较慢，导致整个生产周期延长，浪费人力和原材料。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种生产周期短、子实体产量高的广东虫草子实体规模化栽培方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种广东虫草子实体规模化栽培方法，包括如下步骤：
A、配料：分别配制栽培培养基、斜面培养基、液体培养基和发酵培养基，备用；
B、菌种制备：
B1、斜面菌种：将广东虫草菌种接种到所述步骤A中的斜面培养基上进行斜面培养，得到斜面菌种；
B2、摇瓶菌种：将所述斜面菌种转接到所述步骤A中的液体培养基上进行摇瓶培养，得到摇瓶菌种；
B3、发酵菌种：将所述摇瓶菌种接种到所述步骤A中的发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌种；
C、接种和菌丝体培养：将所述发酵菌种接种到所述步骤A中的栽培培养基上，接种后转入培养室进行菌丝体培养，得到菌丝体；
D、子实体培养：将所述长有菌丝体的栽培培养基转入栽培室进行子实体培养，得到子实体；
E、采收：按产品的质量标准要求，待子实体顶端膨大，并出现褐色粉末，即可进行采收。
优选的，所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取白砂糖15~25g、蛋白胨4~6g、酵母浸膏3~5g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0~7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200~1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米60~100g和所述营养液75~125mL，采用全自动电脑控制灭菌***，90~110℃温度下进行常压灭菌10~12h，冷却至20~30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90~120mm，瓶身的高为120~160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2~4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70~100mm，瓶颈的高为30~50mm。
本发明所采用的聚丙烯塑料栽培瓶，包括瓶体，瓶体包括圆柱形的瓶身和设置于瓶身上部的瓶颈，瓶身中部向内凹陷成弧形，瓶颈的上部设置有瓶口，瓶口的外周缘设置有固定瓶盖的第一环形凸起。所述瓶体为半透明瓶体；所述瓶体的外侧设置有不透光无纺布。
优选的，所述栽培瓶的容量为1350mL，所述栽培瓶瓶身的直径为110mm，瓶身的高为138mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为3mm，所述栽培瓶瓶口的直径为85mm，瓶颈的高为40mm。
本发明所采用的聚丙烯塑料栽培瓶的容积、瓶身高度及直径比较协调，能保证装料容积、出草面积、子实体伸展空间符合广东虫草生长特性的要求，减少子实体的弯曲；且瓶体的半透明性满足培养过程中检查杂菌感染所需透明度要求，另外，瓶体的外侧设置有黑色不透光无纺布，能控制光照，培养基周围边虫草较少，子实体生长整齐，保证广东虫草子实体的品质与单产；瓶口直径适中，成人拳头可伸入，便于人工或机械采收，又不会过大而造成其它不良影响。
本发明所采用的聚丙烯塑料栽培瓶还包括瓶盖，瓶盖包括上盖、下盖以及设置于上盖与下盖之间的过滤层，上盖与下盖可拆卸连接，下盖的内周缘设置有与所述第一环形凸起相配合的第二环形凸起，第二环形凸起与第一环形凸起卡接。所述上盖顶部设置有防滑纹；所述瓶盖的材质为聚丙烯塑料。
本发明所采用的聚丙烯塑料栽培瓶的瓶盖设置有过滤层，保证了本发明的透气性及过滤杂菌的使用效果，设计简单，便于拆卸清洗以及更换过滤介质；且上盖顶部设置有增大摩擦力的防滑纹，层层瓶筐堆码排列时安全性提高。
另一优选的，所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取黄豆3~5g浸泡18~30h后榨汁，取其汁液，加入白砂糖15~25g、牛肉浸膏4~6g、硝酸钾4~6g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0~7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200~1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米60~100g和所述营养液75~125mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，冷却至20~30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90~120mm，瓶身的高为120~160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2~4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70~100mm，瓶颈的高为30~50mm。
优选的，所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含有黄豆芽100~300g、马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g和琼脂10~30g；
斜面培养基的制备：取黄豆芽100~300g和马铃薯100~300g混合后加入1L水，煎煮 15~25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10~30g和琼脂10~30g，补充水至1L，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20~30℃，得到斜面培养基。
另一优选的，所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾2~4g、硫酸镁1~2g、琼脂10~30g和维生素B1 0.04~0.08g；
斜面培养基的制备：取马铃薯100~300g加入1L水，煎煮15~25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾2~4g、硫酸镁1~2g、琼脂10~30g和维生素B1 0.04~0.08g，补充水至1L，调pH值6.5~7.5，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20~30℃，得到斜面培养基。
优选的，所述步骤A中，液体培养基的制备方法包括如下步骤：
液体培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10~30g、蛋白胨3~5g、磷酸二氢钾3~5g、硫酸镁3~5g、牛肉膏3~5g和维生素B1 0.02~0.04g；
液体培养基的制备：取蛋白胨3~5g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾3~5g、硫酸镁3~5g、牛肉膏3~5g和维生素B1 0.02~0.04g，补充水至1L，调pH值6.0~7.0，溶解后进行分装，每500mL三角瓶装液250~350mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，冷却至20~30℃，得到液体培养基。
优选的，所述步骤A中，发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
发酵培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10~20g、蛋白胨5~10g、麦芽汁培养基2~4g和酵母浸膏3~5g；
发酵培养基的制备：取蛋白胨5~10g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10~20g、麦芽汁培养基2~4 g和酵母浸膏3~5g，补充水至1L，调pH值6.0~7.0；在100L发酵罐中加入40~80L所述发酵培养基，采用全自动电脑控制灭菌***，115~135℃温度下、0.2~0.3MPa压力下进行高压灭菌50~70min，冷却至20~30℃，得到发酵培养基。
优选的，
所述步骤B1中，斜面培养的接种采用全自动接种流水线，培养温度为23~27℃，相对湿度为65%~85%，先暗培养6~10天，待菌丝萌发后，再用150~250Lux的光照培养15~25天，选择无污染的，菌种颜色为草绿或绿色，气生菌丝少，菌落表面略有虫草芽的作为斜面菌种；
所述步骤B2中，摇瓶培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶接入3~5块10mm×10mm的菌块，培养温度为23~27℃，摇床转速为200~300r/min，暗培养7~11天，选择无污染的，菌球大小和浓度适宜的作为摇瓶菌种；
所述步骤B3中，发酵培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每个发酵罐接入1.5~2.5瓶摇瓶菌种，培养温度为20~30℃，通气压力为0.06~0.1MPa，培养时间为4~8天。
优选的，所述步骤C中，菌丝体培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶40~60mL，采用电脑自动控制***对菌丝体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21~25℃，培养室内洁净度不低于十万级，自然湿度下暗培养6~10天，当菌丝长满培养基表面，吃料有三分之一瓶至全瓶时，完成菌丝体培养阶段。
将长有菌丝体的栽培瓶从培养室搬出，在无菌环境下将瓶盖换成经过灭菌的透明聚丙烯薄膜，用皮筋固定住，并用0.2mm的针在薄膜上扎5-6个孔，以便透气。或者换成材质为PC等透明的、经过高温灭菌的透气隔菌瓶盖。
优选的，所述步骤D中，采用电脑自动控制***对子实体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21~25℃，相对湿度为65%~75%，光照强度为400~600Lux，光照时间为每天8~12h，光照间隔时间为12h，通风时间为每天1~3h，栽培室内洁净度不低于十万级；当培养基表面长出子实体原基时，调节相对湿度至90%~100%；当子实体长到1~2cm时，调节光照强度至50~150Lux；整个子实体培养周期为45~55天。
广东虫草子实体成熟后要及时采收，否则易形成烂草，子实体会空心，质量下降，重量减少。超过60天仍不采收，易引起病虫害，易感染霉菌，所以采收可偏早，切忌偏晚。
当规模较大时，采用自动去盖机将栽培瓶的盖子去掉后，再使用自动采收机将子实体和培养基质从栽培瓶中取出集中，再进行人工分级，A级：5~10cm条状，B级：1~5cm条状，C级：除A、B级之外的子实体。采收人员宜佩戴帽子、工作服、口罩及手套。
采收所得鲜品可直接销售，也可低温烘干便于储存或进行深加工开发新产品。
本发明的有益效果在于：本发明采用深层发酵的发酵罐菌种代替现有的多级摇瓶种，深层发酵的菌种菌丝活力强，菌丝球大小均一度较好，在无菌环境下，可以采用自动接种机或人工手动喷洒接种，实现流水线作业，接种量稳定，每瓶为40~60mL，喷洒均一，菌丝萌发快，降低污染率，并且出子实体的时间较现有技术快3~5天，整个生产周期缩短10天左右，与现有技术的摇瓶菌种接种相比还可以节省人工和原材料成本。
本发明提供了一套较为成熟的、能够实现规模化生产的广东虫草子实体的规模化栽培方法，为广东虫草菌丝体和子实体深加工系列产品的研发提供了依据，促进了高活性虫草资源商品市场的发展。
具体实施方式：
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
本发明所采用的广东虫草菌种为日本虫草广东变型（Cordyceps japonica f guangdongensis）GDIM-C050423，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC N0：M 206051。
实施例1
一种广东虫草子实体规模化栽培方法，包括如下步骤：
A、配料：分别配制栽培培养基、斜面培养基、液体培养基和发酵培养基，备用；
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取白砂糖15g、蛋白胨4g、酵母浸膏3g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200mL的聚丙烯塑料栽培瓶，将整框空的栽培瓶放在物流线上，用自动装瓶机向每个栽培瓶中加入大米60g，再经下一步的液体自动分装器将配制好的营养液分装到栽培瓶内，每瓶75mL，自动压盖机盖上瓶盖，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在灭菌车上；将灭菌车推入灭菌炉内，采用全自动电脑控制灭菌***，90℃温度下进行常压灭菌10h，灭菌完成后，将灭菌车推至洁净度为十万级的冷却室内冷却至20℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90mm，瓶身的高为120mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70mm，瓶颈的高为30mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含有黄豆芽100g、马铃薯100g、葡萄糖10g和琼脂10g；
斜面培养基的制备：取黄豆芽100g和马铃薯100g混合后加入1L水，煎煮 15min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10g和琼脂10g，补充水至1L，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110℃温度下、0.1MPa压力下进行高压灭菌20min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20℃，得到斜面培养基。
所述步骤A中，液体培养基的制备方法包括如下步骤：
液体培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁3g、牛肉膏3g和维生素B1 0.02g；
液体培养基的制备：取蛋白胨3g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁3g、牛肉膏3g和维生素B1 0.02g，补充水至1L，调pH值6.0，溶解后进行分装，每500mL三角瓶装液250mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110℃温度下、0.1MPa压力下进行高压灭菌20min，冷却至20℃，得到液体培养基。
所述步骤A中，发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
发酵培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10g、蛋白胨5g、麦芽汁培养基2g和酵母浸膏3g；
发酵培养基的制备：取蛋白胨5g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10g、麦芽汁培养基2g和酵母浸膏3g，补充水至1L，调pH值6.0；在100L发酵罐中加入40L所述发酵培养基，采用全自动电脑控制灭菌***，115℃温度下、0.2MPa压力下进行高压灭菌50min，冷却至20℃，得到发酵培养基。
B、菌种制备：
B1、斜面菌种：将广东虫草菌种接种到所述步骤A中的斜面培养基上进行斜面培养，得到斜面菌种；
所述步骤B1中，斜面培养的接种采用全自动接种流水线，培养温度为23℃，相对湿度为65%，先暗培养6天，待菌丝萌发后，再用150Lux的光照培养15天，选择无污染的，菌种颜色为草绿或绿色，气生菌丝少，菌落表面略有虫草芽的作为斜面菌种；
B2、摇瓶菌种：将所述斜面菌种转接到所述步骤A中的液体培养基上进行摇瓶培养，得到摇瓶菌种；
所述步骤B2中，摇瓶培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶接入3块10mm×10mm的菌块，培养温度为23℃，摇床转速为200r/min，暗培养7天，选择无污染的，菌球大小和浓度适宜的作为摇瓶菌种；
B3、发酵菌种：将所述摇瓶菌种接种到所述步骤A中的发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌种；
所述步骤B3中，发酵培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每个发酵罐接入1.5瓶摇瓶菌种，培养温度为20℃，通气压力为0.06MPa，培养时间为4天。
C、接种和菌丝体培养：将所述发酵菌种接种到所述步骤A中的栽培培养基上，接种后转入培养室进行菌丝体培养，得到菌丝体；
所述步骤C中，菌丝体培养的接种采用全自动接种流水线，将栽培筐放在物流线上，进入洁净接种室的层流罩内，将自动接种机与发酵罐连接起来准备接种，接种量为每瓶40mL，再通过物流线运往室外，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在卡板上，用叉车送进培养室，采用电脑自动控制***对菌丝体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21℃，培养室内洁净度不低于十万级，自然湿度下暗培养6天，当菌丝长满培养基表面，吃料有三分之一瓶至全瓶时，完成菌丝体培养阶段。
D、子实体培养：将所述长有菌丝体的栽培培养基转入栽培室进行子实体培养，得到子实体；
所述步骤D中，将长有菌丝体的栽培瓶从培养室搬出，在无菌环境下将瓶盖换成经过灭菌的透明聚丙烯薄膜，放在栽培架上，采用电脑自动控制***对子实体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21℃，相对湿度为65%，光照强度为400Lux，光照时间为每天8h，光照间隔时间为12h，通风时间为每天1h，栽培室内洁净度不低于十万级；当培养基表面长出子实体原基时，调节相对湿度至90%~100%，当子实体长到1cm时，调节光照强度至50Lux，整个子实体培养周期为45天。
E、采收：按产品的质量标准要求，待子实体顶端膨大，并出现褐色粉末，即可进行采收。采用自动去盖机将栽培瓶的盖子去掉后，再使用自动采收机将子实体和培养基质从栽培瓶中取出集中，再进行人工分级。
实施例2
一种广东虫草子实体规模化栽培方法，包括如下步骤：
A、配料：分别配制栽培培养基、斜面培养基、液体培养基和发酵培养基，备用；
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取白砂糖20g、蛋白胨5g、酵母浸膏4g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.5；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1350mL的聚丙烯塑料栽培瓶，将整框空的栽培瓶放在物流线上，用自动装瓶机向每个栽培瓶中加入大米80g，再经下一步的液体自动分装器将配制好的营养液分装到栽培瓶内，每瓶100mL，自动压盖机盖上瓶盖，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在灭菌车上；将灭菌车推入灭菌炉内，采用全自动电脑控制灭菌***，100℃温度下进行常压灭菌11h，灭菌完成后，将灭菌车推至洁净度为十万级的冷却室内冷却至25℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为110mm，瓶身的高为140mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为3mm，所述栽培瓶瓶口的直径为85mm，瓶颈的高为40mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含有黄豆芽200g、马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂20g；
斜面培养基的制备：取黄豆芽200g和马铃薯200g混合后加入1L水，煎煮 20min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖20g和琼脂20g，补充水至1L，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，121℃温度下、0.15MPa压力下进行高压灭菌30min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至25℃，得到斜面培养基。
所述步骤A中，液体培养基的制备方法包括如下步骤：
液体培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖20g、蛋白胨4g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁4g、牛肉膏4g和维生素B1 0.03g；
液体培养基的制备：取蛋白胨4g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖20g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁4g、牛肉膏4g和维生素B1 0.03g，补充水至1L，调pH值6.5，溶解后进行分装，每500mL三角瓶装液300mL，采用全自动电脑控制灭菌***，121℃温度下、0.15MPa压力下进行高压灭菌30min，冷却至25℃，得到液体培养基。
所述步骤A中，发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
发酵培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖15g、蛋白胨8g、麦芽汁培养基3g和酵母浸膏4g；
发酵培养基的制备：取蛋白胨8g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖15g、麦芽汁培养基3g和酵母浸膏4g，补充水至1L，调pH值6.5；在100L发酵罐中加入60L所述发酵培养基，采用全自动电脑控制灭菌***，125℃温度下、0.25MPa压力下进行高压灭菌60min，冷却至25℃，得到发酵培养基。
B、菌种制备：
B1、斜面菌种：将广东虫草菌种接种到所述步骤A中的斜面培养基上进行斜面培养，得到斜面菌种；
所述步骤B1中，斜面培养的接种采用全自动接种流水线，培养温度为25℃，相对湿度为75%，先暗培养8天，待菌丝萌发后，再用200ux的光照培养20天，选择无污染的，菌种颜色为草绿或绿色，气生菌丝少，菌落表面略有虫草芽的作为斜面菌种；
B2、摇瓶菌种：将所述斜面菌种转接到所述步骤A中的液体培养基上进行摇瓶培养，得到摇瓶菌种；
所述步骤B2中，摇瓶培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶接入4块10mm×10mm的菌块，培养温度为25℃，摇床转速为250r/min，暗培养9天，选择无污染的，菌球大小和浓度适宜的作为摇瓶菌种；
B3、发酵菌种：将所述摇瓶菌种接种到所述步骤A中的发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌种；
所述步骤B3中，发酵培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每个发酵罐接入2瓶摇瓶菌种，培养温度为25℃，通气压力为0.08MPa，培养时间为6天。
C、接种和菌丝体培养：将所述发酵菌种接种到所述步骤A中的栽培培养基上，接种后转入培养室进行菌丝体培养，得到菌丝体；
所述步骤C中，菌丝体培养的接种采用全自动接种流水线，将栽培筐放在物流线上，进入洁净接种室的层流罩内，将自动接种机与发酵罐连接起来准备接种，接种量为每瓶50mL，再通过物流线运往室外，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在卡板上，用叉车送进培养室，采用电脑自动控制***对菌丝体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为23℃，培养室内洁净度不低于十万级，自然湿度下暗培养8天，当菌丝长满培养基表面，吃料有三分之一瓶至全瓶时，完成菌丝体培养阶段。
D、子实体培养：将所述长有菌丝体的栽培培养基转入栽培室进行子实体培养，得到子实体；
所述步骤D中，将长有菌丝体的栽培瓶从培养室搬出，在无菌环境下将瓶盖换成经过灭菌的透明聚丙烯薄膜，放在栽培架上，采用电脑自动控制***对子实体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为23℃，相对湿度为70%，光照强度为500Lux，光照时间为每天10h，光照间隔时间为12h，通风时间为每天2h，栽培室内洁净度不低于十万级；当培养基表面长出子实体原基时，调节相对湿度至95%，当子实体长到1.5cm时，调节光照强度至100Lux，整个子实体培养周期为50天。
E、采收：按产品的质量标准要求，待子实体顶端膨大，并出现褐色粉末，即可进行采收。采用自动去盖机将栽培瓶的盖子去掉后，再使用自动采收机将子实体和培养基质从栽培瓶中取出集中，再进行人工分级。
实施例3
一种广东虫草子实体规模化栽培方法，包括如下步骤：
A、配料：分别配制栽培培养基、斜面培养基、液体培养基和发酵培养基，备用；
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取白砂糖25g、蛋白胨6g、酵母浸膏5g和水1L制得营养液，调营养液pH值7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，将整框空的栽培瓶放在物流线上，用自动装瓶机向每个栽培瓶中加入大米100g，再经下一步的液体自动分装器将配制好的营养液分装到栽培瓶内，每瓶125mL，自动压盖机盖上瓶盖，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在灭菌车上；将灭菌车推入灭菌炉内，采用全自动电脑控制灭菌***，110℃温度下进行常压灭菌12h，灭菌完成后，将灭菌车推至洁净度为十万级的冷却室内冷却至30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为130mm，瓶身的高为160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为100mm，瓶颈的高为50mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含有黄豆芽300g、马铃薯300g、葡萄糖30g和琼脂30g；
斜面培养基的制备：取黄豆芽300g和马铃薯300g混合后加入1L水，煎煮 25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖30g和琼脂30g，补充水至1L，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，130℃温度下、0.2MPa压力下进行高压灭菌40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20~30℃，得到斜面培养基。
所述步骤A中，液体培养基的制备方法包括如下步骤：
液体培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖30g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁5g、牛肉膏5g和维生素B1 0.04g；
液体培养基的制备：取蛋白胨5g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖30g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁5g、牛肉膏5g和维生素B1 0.04g，补充水至1L，调pH值7.0，溶解后进行分装，每500mL三角瓶装液350mL，采用全自动电脑控制灭菌***，130℃温度下、0.2MPa压力下进行高压灭菌40min，冷却至30℃，得到液体培养基。
所述步骤A中，发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
发酵培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖20g、蛋白胨10g、麦芽汁培养基4g和酵母浸膏5g；
发酵培养基的制备：取蛋白胨10g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖20g、麦芽汁培养基4 g和酵母浸膏5g，补充水至1L，调pH值7.0；在100L发酵罐中加入80L所述发酵培养基，采用全自动电脑控制灭菌***，135℃温度下、0.3MPa压力下进行高压灭菌70min，冷却至30℃，得到发酵培养基。
B、菌种制备：
B1、斜面菌种：将广东虫草菌种接种到所述步骤A中的斜面培养基上进行斜面培养，得到斜面菌种；
所述步骤B1中，斜面培养的接种采用全自动接种流水线，培养温度为27℃，相对湿度为85%，先暗培养10天，待菌丝萌发后，再用250ux的光照培养25天，选择无污染的，菌种颜色为草绿或绿色，气生菌丝少，菌落表面略有虫草芽的作为斜面菌种；
B2、摇瓶菌种：将所述斜面菌种转接到所述步骤A中的液体培养基上进行摇瓶培养，得到摇瓶菌种；
所述步骤B2中，摇瓶培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶接入5块10mm×10mm的菌块，培养温度为27℃，摇床转速为300r/min，暗培养11天，选择无污染的，菌球大小和浓度适宜的作为摇瓶菌种；
B3、发酵菌种：将所述摇瓶菌种接种到所述步骤A中的发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌种；
所述步骤B3中，发酵培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每个发酵罐接入2.5瓶摇瓶菌种，培养温度为30℃，通气压力为0.1MPa，培养时间为8天。
C、接种和菌丝体培养：将所述发酵菌种接种到所述步骤A中的栽培培养基上，接种后转入培养室进行菌丝体培养，得到菌丝体；
所述步骤C中，菌丝体培养的接种采用全自动接种流水线，将栽培筐放在物流线上，进入洁净接种室的层流罩内，将自动接种机与发酵罐连接起来准备接种，接种量为每瓶60mL，再通过物流线运往室外，堆垛机将栽培筐一层一层地叠放在卡板上，用叉车送进培养室，采用电脑自动控制***对菌丝体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为25℃，培养室内洁净度不低于十万级，自然湿度下暗培养10天，当菌丝长满培养基表面，吃料有三分之一瓶至全瓶时，完成菌丝体培养阶段。
D、子实体培养：将所述长有菌丝体的栽培培养基转入栽培室进行子实体培养，得到子实体；
所述步骤D中，将长有菌丝体的栽培瓶从培养室搬出，在无菌环境下将瓶盖换成经过灭菌的透明聚丙烯薄膜，放在栽培架上，采用电脑自动控制***对子实体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为25℃，相对湿度为75%，光照强度为600Lux，光照时间为每天12h，光照间隔时间为12h，通风时间为每天3h，栽培室内洁净度不低于十万级；当培养基表面长出子实体原基时，调节相对湿度至90%~100%，当子实体长到2cm时，调节光照强度至150Lux，整个子实体培养周期为55天。
E、采收：按产品的质量标准要求，待子实体顶端膨大，并出现褐色粉末，即可进行采收。采用自动去盖机将栽培瓶的盖子去掉后，再使用自动采收机将子实体和培养基质从栽培瓶中取出集中，再进行人工分级。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取黄豆3g浸泡18h后榨汁，取其汁液，加入白砂糖15g、牛肉浸膏4g、硝酸钾4g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米60g和所述营养液75mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110℃温度下、0.1MPa压力下进行高压灭菌20min，冷却至20℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90mm，瓶身的高为120mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70mm，瓶颈的高为30mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含马铃薯100g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、琼脂10g和维生素B1 0.04g；
斜面培养基的制备：取马铃薯100g加入1L水，煎煮15min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、琼脂10g和维生素B1 0.04g，补充水至1L，调pH值6.5，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110℃温度下、0.1MPa压力下进行高压灭菌20min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20℃，得到斜面培养基。
本实施例的其余部分与实施例5相同，这里不再赘述。
实施例5
本实施例与实施例2的不同之处在于：
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取黄豆4g浸泡24h后榨汁，取其汁液，加入白砂糖20g、牛肉浸膏5g、硝酸钾5g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.5；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1350mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米80g和所述营养液100mL，采用全自动电脑控制灭菌***，120℃温度下、0.15MPa压力下进行高压灭菌30min，冷却至25℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为110mm，瓶身的高为140mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为3mm，所述栽培瓶瓶口的直径为85mm，瓶颈的高为40mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂20g和维生素B1 0.06g；
斜面培养基的制备：取马铃薯200g加入1L水，煎煮20min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、琼脂20g和维生素B1 0.06g，补充水至1L，调pH值7.0，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，120℃温度下、0.15MPa压力下进行高压灭菌30min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至25℃，得到斜面培养基。
本实施例的其余部分与实施例5相同，这里不再赘述。
实施例6
本实施例与实施例3不同之处在于：
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取黄豆5g浸泡30h后榨汁，取其汁液，加入白砂糖25g、牛肉浸膏6g、硝酸钾6g和水1L制得营养液，调营养液pH值7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米100g和所述营养液125mL，采用全自动电脑控制灭菌***， 130℃温度下、0.2MPa压力下进行高压灭菌40min，冷却至30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为120mm，瓶身的高为160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为100mm，瓶颈的高为50mm。
所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含马铃薯300g、葡萄糖30g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁2g、琼脂30g和维生素B1 0.08g；
斜面培养基的制备：取马铃薯300g加入1L水，煎煮25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖30g、磷酸二氢钾4g、硫酸镁2g、琼脂30g和维生素B1 0.08g，补充水至1L，调pH值7.5，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，130℃温度下、0.2MPa压力下进行高压灭菌40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至30℃，得到斜面培养基。
本实施例的其余部分与实施例5相同，这里不再赘述。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种广东虫草子实体规模化栽培方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、配料：分别配制栽培培养基、斜面培养基、液体培养基和发酵培养基，备用；
所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取黄豆3~5g浸泡18~30h后榨汁，取其汁液，加入白砂糖15~25g、牛肉浸膏4~6g、硝酸钾4~6g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0~7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200~1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米60~100g和所述营养液75~125mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，冷却至20~30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90~120mm，瓶身的高为120~160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2~4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70~100mm，瓶颈的高为30~50mm；
或者，所述步骤A中，栽培培养基的制备方法包括如下步骤：
营养液的制备：取白砂糖15~25g、蛋白胨4~6g、酵母浸膏3~5g和水1L制得营养液，调营养液pH值6.0~7.0；
栽培培养基的制备：使用全自动装瓶流水线进行装瓶，取容量为1200~1500mL的聚丙烯塑料栽培瓶，加入大米60~100g和所述营养液75~125mL，采用全自动电脑控制灭菌***，90~110℃温度下进行常压灭菌10~12h，冷却至20~30℃，得到栽培培养基；所述栽培瓶瓶身的直径为90~120mm，瓶身的高为120~160mm，瓶身的直径与内陷部分中间处的直径之差为2~4mm，所述栽培瓶瓶口的直径为70~100mm，瓶颈的高为30~50mm；
B、菌种制备：
B1、斜面菌种：将广东虫草菌种接种到所述步骤A中的斜面培养基上进行斜面培养，得到斜面菌种；
所述步骤B1中，斜面培养的接种采用全自动接种流水线，培养温度为27℃，相对湿度为65%~85%，先暗培养6~8天，待菌丝萌发后，再用150~250Lux的光照培养15~25天，选择无污染的，菌种颜色为草绿或绿色，气生菌丝少，菌落表面略有虫草芽的作为斜面菌种；
B2、摇瓶菌种：将所述斜面菌种转接到所述步骤A中的液体培养基上进行摇瓶培养，得到摇瓶菌种；
所述步骤B2中，摇瓶培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶接入3~5块10mm×10mm的菌块，培养温度为23℃或27℃，摇床转速为200~300r/min，暗培养11天，选择无污染的，菌球大小和浓度适宜的作为摇瓶菌种；
B3、发酵菌种：将所述摇瓶菌种接种到所述步骤A中的发酵培养基上进行发酵培养，得到发酵菌种；
所述步骤B3中，发酵培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每个发酵罐接入1.5~2.5瓶摇瓶菌种，培养温度为20~30℃，通气压力为0.06~0.1MPa，培养时间为6~8天；
C、接种和菌丝体培养：将所述发酵菌种接种到所述步骤A中的栽培培养基上，接种后转入培养室进行菌丝体培养，得到菌丝体；
所述步骤C中，菌丝体培养的接种采用全自动接种流水线，接种量为每瓶40~60mL，采用电脑自动控制***对菌丝体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21~25℃，培养室内洁净度不低于十万级，自然湿度下暗培养6~8天，当菌丝长满培养基表面，吃料有三分之一瓶至全瓶时，完成菌丝体培养阶段;
D、子实体培养：将所述长有菌丝体的栽培培养基转入栽培室进行子实体培养，得到子实体；
所述步骤D中，采用电脑自动控制***对子实体培养的生长条件进行全程监控，培养温度为21~25℃，相对湿度为65%~75%，光照强度为400~600Lux，光照时间为每天8~12h，光照间隔时间为12h，通风时间为每天1~3h，栽培室内洁净度不低于十万级；当培养基表面长出子实体原基时，调节相对湿度至90%~100%；当子实体长到1~2cm时，调节光照强度至50~150Lux；整个子实体培养周期为45~55天；
E、采收：按产品的质量标准要求，待子实体顶端膨大，并出现褐色粉末，即可进行采收。
2.根据权利要求1所述的一种广东虫草子实体规模化栽培方法，其特征在于：所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含有黄豆芽100~300g、马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g和琼脂10~30g；
斜面培养基的制备：取黄豆芽100~300g和马铃薯100~300g混合后加入1L水，煎煮 15~25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10~30g和琼脂10~30g，补充水至1L，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20~30℃，得到斜面培养基。
3.根据权利要求1所述的一种广东虫草子实体规模化栽培方法，其特征在于：所述步骤A中，斜面培养基的制备方法包括如下步骤：
斜面培养基的配方：每1L培养基中含马铃薯100~300g、葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾2~4g、硫酸镁1~2g、琼脂10~30g和维生素B1 0.04~0.08g；
斜面培养基的制备：取马铃薯100~300g加入1L水，煎煮15~25min后过滤，得到滤液，将滤液分别加入葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾2~4g、硫酸镁1~2g、琼脂10~30g和维生素B1 0.04~0.08g，补充水至1L，调pH值6.5~7.5，溶解后用试管进行分装，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，将装有培养液的试管摆成斜面后冷却至20~30℃，得到斜面培养基。
4.根据权利要求1所述的一种广东虫草子实体规模化栽培方法，其特征在于：所述步骤A中，液体培养基的制备方法包括如下步骤：
液体培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10~30g、蛋白胨3~5g、磷酸二氢钾3~5g、硫酸镁3~5g、牛肉膏3~5g和维生素B1 0.02~0.04g；
液体培养基的制备：取蛋白胨3~5g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10~30g、磷酸二氢钾3~5g、硫酸镁3~5g、牛肉膏3~5g和维生素B1 0.02~0.04g，补充水至1L，调pH值6.0~7.0，溶解后进行分装，每500mL三角瓶装液250~350mL，采用全自动电脑控制灭菌***，110~130℃温度下、0.1~0.2MPa压力下进行高压灭菌20~40min，冷却至20~30℃，得到液体培养基。
5.根据权利要求1所述的一种广东虫草子实体规模化栽培方法，其特征在于：所述步骤A中，发酵培养基的制备方法包括如下步骤：
发酵培养基的配方：每1L培养基中含葡萄糖10~20g、蛋白胨5~10g、麦芽汁培养基2~4g和酵母浸膏3~5g；
发酵培养基的制备：取蛋白胨5~10g用500mL热水溶化，分别加入葡萄糖10~20g、麦芽汁培养基2~4 g和酵母浸膏3~5g，补充水至1L，调pH值6.0~7.0；在100L发酵罐中加入40~80L所述发酵培养基，采用全自动电脑控制灭菌***，115~135℃温度下、0.2~0.3MPa压力下进行高压灭菌50~70min，冷却至20~30，得到发酵培养基。
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|---|---|
| CN103283493A (zh) | 2013-09-11 |
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