CN103278643B - 一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，包括：以硅片为基底材料，以SU-8光刻胶作为掩模层，分别曝光、显影制作模具A和模具B；将PDMS和固化剂混合后，分别浇注在模具A和模具B上，加热固化；分别剥离A-PDMS、B-PDMS；A-PDMS打孔后，与经过处理的玻璃片贴合；将A-PDMS揭掉后，将固定有抗体的玻璃片与B-PDMS对准贴合，并取另一经打孔的玻璃片贴合在B-PDMS的另一面，即得微芯片。本发明的微芯片将全血中血浆的分离、检测连接为一体，可以一次针对多个靶目标的检测，具有特异、快速和高灵敏的特点，可望应用于临床中微量全血中多种蛋白的诊断和检测。
Description
技术领域
本发明属于血浆分离和蛋白质的检测领域，特别涉及一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法。
背景技术
全血是由液态血浆、红细胞、白细胞、血小板等成份组成。在现代医学检测中，由于血细胞或者血红素对光谱分析存在很大的干扰，通常都首先把血浆从血液样品中分离出来，然后用于生化或免疫诊断分析。目前，离心法和过滤法是临床中使用最普遍的方法。离心法是利用惯性离心力和物质沉降系数的原理来达到分离效果，而过滤法是通过滤膜或固体支撑物来实现血浆的分离。但这两种方法都存在一定的不足之处，前者分离设备体积庞大、操作复杂，后者滤膜孔容易被血细胞堵塞导致分离效率降低和样品污染。因此，如何有效地将血浆从全血中分离并与检测有机地结为一体是研究的热点。
近年来，微全分析***因具有微型化、集成化和智能化的特点而备受研究者关注，尤其是分析速度快、所需样品量为几微升或更低，所以微全分析***将为生物医学、分析化学提供更好的检测平台。微流控技术是微全分析***的核心，微芯片尺寸在厘米量级，采用MEMS技术在硅片、玻璃或塑料等基底材料上制造出通道网络、反应混合池、检测器等元器件集一体的多功能芯片。因此，在微芯片上实现微量样品的分离与检测一直是大家关注的焦点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，该微芯片将全血中血浆的分离、检测连接为一体，可以一次针对多个靶目标的检测，具有特异、快速和高灵敏的特点，并且不需要复杂的仪器以及酶反应的实验条件，可望应用于临床中微量全血中多种蛋白的诊断和检测。
本发明的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，包括：
以硅片为基底材料，以SU-8光刻胶作为掩模层，分别曝光、显影制作固定蛋白的模具A和分离检测模具B；将PDMS和固化剂（Sylgard184curing agent）以重量比5～10：1混合后，分别浇注在模具A和模具B上，加热固化；分别剥离模具A上的PDMS结构A-PDMS、模具B上的PDMS结构B-PDMS；A-PDMS打进样孔和出样孔后，与经过处理的玻璃片贴合，用于固定多个抗体；将A-PDMS揭掉后，将固定有抗体的玻璃片与B-PDMS对准贴合，并取另一经打孔的玻璃片贴合在B-PDMS的另一面，构成玻璃-PDMS-玻璃的夹心结构，即得微芯片。
所述A-PDMS的尺寸为100μm高×100μm宽。
所述B-PDMS包括血浆分离管道、细胞沉积管道和废液池，其中血浆分离管道的尺寸为15μm×100μm×23mm，细胞沉积管道的尺寸为100μm×500μm×20mm，废液池的尺寸为100μm×1.6mm×9mm。
所述加热固化的温度为90℃，固化的时间为1小时。
所述经过处理的玻璃片为经过醛基修饰的玻璃片。
所述固定多个抗体的温度为37℃，时间为2小时；其中，多个抗体具体为BSA、CEA、CyFRA21-1和IgG抗体。
所述微量蛋白检测中的微量蛋白为抗原或抗体。
所述得到的微芯片配合纳米金标记抗体应用于全血中血浆的分离和蛋白质的检测；具体步骤包括如下：
纳米金标记单克隆二抗NP与样品混合后，加入微芯片的进样口，通过分离区域时血细胞沉积，同时血浆和NP流入检测区域，与芯片上固定的单克隆一抗形成NP-抗原-一抗夹心结构，从而造成信号放大，通过纳米金显色得出结果。
所述纳米金标记抗体的制备方法包括：
（1）配置浓度为1mM HAuCl4溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，将HAuCl4溶液加热至130℃，20分钟时加入25ml柠檬酸三钠溶液，持续搅拌至溶液冷却至室温，即形成为酒红色溶液；以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的13nm纳米金溶液，4℃保存备用；
（2）取500μl的上述纳米金溶液，用碳酸钾调节pH为8.2，加入30μl的二抗，放置1～2个小时后多次加入4μl的0.1M NaCl和0.01M PB，4℃保存。
步骤（2）中的纳米金溶液浓度为12.2nM，二抗的浓度为0.1mg/ml。
本发明微流体芯片（简称微芯片）中微结构的示意图如图2所示。利用标准的光刻工艺实现微结构的制作，用玻璃片与微结构可逆封接制备了所需的微芯片。该微芯片将全血中血浆的分离和蛋白质检测连接为一体。整个芯片大小为75mm×25mm,由分离区域和检测区域两个部分组成。
本发明是基于纳米探针和微流控网络结合，将样品的分离、反应及检测集成为一体，通过血细胞的在微管道内的沉积分离血浆，并与微芯片上固定的靶目标结合，在纳米金颗粒上标记抗体，通过信号的逐级放大，达到对微量全血中血浆的分离和蛋白质检测。
有益效果
本发明的微芯片将全血中血浆的分离、检测连接为一体，可以一次针对多个靶目标的检测，具有特异、快速和高灵敏的特点，并且不需要复杂的仪器以及酶反应的实验条件，可望应用于临床中微量全血中多种蛋白的诊断和检测。
附图说明
图1为本发明微芯片的制备以及进行血浆分离和蛋白质的检测的工艺流程图；
图2为本发明微芯片的结构示意图；
图3为实施例1的检测结果；
图4为实施例2的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
健康人全血的血浆分离及蛋白的检测
采用微流体***对健康人全血中血浆分离并对蛋白进行检测，具体步骤如下:
（一）微流体芯片的制备及蛋白固定
1、硅片为基底材料，以SU-8光刻胶作为掩模层，曝光、显影制作固定蛋白的模具A和分离检测模具B；
2、将PDMS、固化剂（Sylgard184curing agent）以10:1（重量比）混合，除气泡后浇注分别浇注在模具A与模具B上，90℃加热固化1小时，制作微结构；
3、剥离模具A上的PDMS块（A-PDMS），用打孔针打孔进样孔和出样孔，然后与醛基修饰的玻璃片可逆贴合在一起；
4、从步骤3的进样口依次加入4种不同的一抗溶液（BSA、CEA、CyFRA21-1和IgG抗体，BSA是作为阴性对照，IgG是阳性对照），在37℃固定2小时；加入PBS缓冲液（含1%BSA）冲洗，自然晾干；揭掉A-PDMS结构，然后对固定有抗体的玻璃片进行对准打孔（进样孔和废液池）。
5、剥离模具B上的PDMS块（B-PDMS），与4中固定蛋白的玻璃片进行对准贴合；
6、然后取普通的玻璃片贴合在B-PDMS的另一面(无图形面)，形成一个玻璃片-PDMS-玻璃片的夹心结构，完成芯片的制作和蛋白的固定。
（二）纳米金的准备及抗体标记
1、纳米金溶液的制备
配置浓度为1mM HAuCl4溶液及浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液。将HAuCl4溶液加热至130℃，保证加热过程中搅拌充分，20分钟时迅速加入新配好的柠檬酸三钠溶液（此过程中注意保温，不要让HAuCl4溶液降温）25ml，持续搅拌至溶液冷却至室温、即形成为酒红色溶液。以0.22μm硝酸纤维尼龙膜过滤溶液，即可得到颗粒均匀的13nm纳米金溶液，4℃保存备用。
2、纳米金标记抗体（NP）
取500μl的胶体金，用碳酸钾调节pH为8.2附近，加入30μl的二抗，放置1个小时后依次加入4μl的0.1M NaCL、0.01M PB（加三次），使溶液维持一定盐浓度，4℃保存。
NP探针用于捕获待检测的微量抗原，由于抗原抗体反应形成NP-抗原复合物。
（三）检测与结果判读
1、将抽过负压的PDMS块放在上述制备好的夹心微芯片的出样孔。
2、将10μl新鲜的健康人全血（经鉴定不含CEA和CyFRA21-1抗原）与0.5μl NP探针混合均匀，取3μl全血-NP混合溶液加在芯片的进样口，在负压作用下血液流入微管道内，血细胞自然沉降在管道内，血浆-NP混合液分离后流入检测区域，与芯片表面固定的蛋白质形成了三明治结构（即NP-抗原-蛋白微芯片），37℃孵育30分钟。
3、在出样口加入3μl的10mM PBS磷酸盐，pH7.4清洗三次。将未反应的NP探针、血浆等洗掉，废液从进样口流出。
4、在出样口加入3μl纳米金染色试剂，10min后观察结果。仅仅固定IgG抗体的区域出现黑色，其余均无黑色出现，结果说明此份样本不含CEA和CyFRA21-1抗原（见图3）。
实施例2
临床全血的血浆分离及蛋白的检测
（一）微流体芯片的制备
与实施例1中（一）相同。
（二）纳米金的准备及抗体标记
与实施例1中（二）相同。
（三）检测与结果判读
1、将抽过负压的PDMS块放在上述制备好的夹心微芯片的出样孔。
2、将10μl新鲜的肺癌全血（经鉴定里面含有CEA和CyFRA21-1抗原）、0.5μlNP探针混合均匀，取3μl全血-NP混合溶液加在芯片的进样口，在负压作用下血液流入微管道内，血细胞自然沉降在管道内，血浆/NP混合液分离后流入检测区域，与芯片表面固定的蛋白质形成了三明治结构（即NP-抗原-蛋白微芯片），37℃孵育30分钟。
3、在出样口加入3μl的10mM PBS磷酸盐，PH7.4清洗三次。将未反应的NP探针、血浆等洗掉，废液从进样口流出。
4、在出样口加入3μl纳米金染色试剂，10min后观察结果。固定IgG抗体、CEA抗体和CyFRA21-1的区域出现黑色，BSA无黑色出现，结果说明此份样本的CEA和CyFRA21-1抗原检测为阳性（见图4）。
Claims (5)
1.一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，包括：
以硅片为基底材料，以SU-8光刻胶作为掩模层，分别曝光、显影制作固定蛋白的模具A和分离检测模具B；将PDMS和固化剂以重量比5～10：1混合后，分别浇注在模具A和模具B上，加热固化；分别剥离模具A上的PDMS结构A-PDMS、模具B上的PDMS结构B-PDMS；A-PDMS打进样孔和出样孔后，与经过处理的玻璃片贴合，用于固定多个抗体；将A-PDMS揭掉后，将固定有抗体的玻璃片与B-PDMS对准贴合，并取另一经打孔的玻璃片贴合在B-PDMS的另一面，构成玻璃-PDMS-玻璃的夹心结构，即得微芯片；其中，A-PDMS的尺寸为100μm高×100μm宽；B-PDMS包括血浆分离管道、细胞沉积管道和废液池，其中血浆分离管道的尺寸为15μm×100μm×23mm，细胞沉积管道的尺寸为100μm×500μm×20mm，废液池的尺寸为100μm×1.6mm×9mm。
2.根据权利要求1所述的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，其特征在于：所述加热固化的温度为90℃，固化的时间为1小时。
3.根据权利要求1所述的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，其特征在于：所述经过处理的玻璃片为经过醛基修饰的玻璃片。
4.根据权利要求1所述的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，其特征在于：所述固定多个抗体的温度为37℃，时间为2小时；其中，多个抗体具体为BSA、CEA、CyFRA21-1和IgG抗体。
5.根据权利要求1所述的一种用于微量蛋白检测的微芯片的制备方法，其特征在于：所述微量蛋白检测中的微量蛋白为抗原或抗体。
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