RU2235324C1 - Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника - Google Patents
Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника Download PDFInfo
- Publication number
- RU2235324C1 RU2235324C1 RU2003105528/15A RU2003105528A RU2235324C1 RU 2235324 C1 RU2235324 C1 RU 2235324C1 RU 2003105528/15 A RU2003105528/15 A RU 2003105528/15A RU 2003105528 A RU2003105528 A RU 2003105528A RU 2235324 C1 RU2235324 C1 RU 2235324C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- agar
- zones
- proteolysis
- casein
- added
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, биохимии. Способ определения проводят в супернатантах фекалий, свободных от бактерий, при помощи хлороформа, при котором 20 мкл супернатанта вносится в лунку со специальной питательной средой, в которую вносится казеин. 1,5%-ный раствор казеина на 0,2 Н NaOH вносят к расплавленному питательному агару в соотношении 1:10, автоклавируют при 121°С 15 мин, доводят рН до 7,2-7,4 и разливают в стерильные чашки Петри. После охлаждения чашек в агаре делают лунки диаметром 6 мм. После культивирования в термостате при 37°С 6-8 ч зоны протеолиза проявляют внесением на агар 5 мл 5%-ного водного раствора соляной кислоты. Диаметры зон протеолиза измеряют в миллиметрах (мм). В результате измерения зон протеолиза активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-16 мм, высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм. Изобретение обеспечивает быстроту и легкость осуществления.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, микробиологии и биохимии. В последнее время при самых разнообразных внешних воздействиях (загрязнение окружающей среды, повышенный радиационный фон, магнитные возмущения и др.), экстремальных условиях, стрессовых ситуациях, гиподинамии, нарушениях биоритмов, в случаях снижения иммунологического статуса, развития в желудочно-кишечном тракте патологических состояний и воспалительных процессов как инфекционной, так и неинфекционной этиологии происходят экологические сдвиги в микробном пейзаже кишечника (Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактериозы. Теория и практика. Н.Новгород, 1999; Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. и др. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека. Журн. микробиол. 2002, 5:98-104).
Развитие дисбактериозов кишечника различной этиологии отягощает течение основного заболевания, ухудшает его прогноз. В ряде случаев дисбактериозы становятся в последующем определяющим фактором в формировании патологического состояния организма, приводят к выраженным функциональным нарушениям в пищеварительном тракте и могут быть причиной развития инфекционного заболевания. По данным многих авторов, дисбактериоз кишечника наблюдается среди 70-90% больных желудочно-кишечными, сердечно-сосудистыми, неврологическими, аллергическими и др. заболеваниями (Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины. Вестн. РАМН, 1997, 3:4-7. Salminen S., Isolauri E., Onnela Т. Gut flora in normal and disordered states. Chemotherapy. 1995, 41 (suppl.l):5-15).
В медицинской практике для диагностики дисбактериозов кишечника используется, как правило, классический бактериологический анализ, требующий наличия большого количества дорогостоящих питательных сред и длительный во времени (не менее 5 дней). Следует отметить, что только в кишечнике человека обитают около 500 видов микроорганизмов нормальной микрофлоры. При этом соотношение анаэробов к аэробам 1000:1, и учесть все столь отдаленные в таксономическом отношении микроорганизмы при классическом бактериологическом анализе практически невозможно.
Для скрининговых исследований на дисбактериоз требуется разработка достаточно быстрых биохимических методов, легко осуществляемых на практике.
Аналогом, по мнению авторов, является метод определения казеинолитической (протеолитической) активности микробов на казеиново-агаровых пластинках, предложенный В.М. Никитиным (Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев, 1986, с.117-119).
Принцип. При взаимодействии протеиназ бактериальных культур с казеином, содержащимся в агаровой среде, происходит его расщепление. При добавлении коагулянта белка на мутном фоне агара выявляются зоны просветления вокруг роста казеинолитически активных микроорганизмов.
Реагенты и материалы. Исследуемые суточные культуры микробов на МПБ или МПА; раствор 1% казеина на 1/15 М фосфатном буфере рН 7,2; 2% агар на физрастворе, рН 7,2, в пробирке или колбочку; проявители для белка (казеина): а) 10% раствор трихлоруксусной кислоты во флаконе с притертой пробкой или б) ледяная уксусная кислота 1 г, метиловый спирт 4,5 мл, дист. вода 4,5 мл; красители для белка (казеина) - амидочерный 10 В или кумаси ярко-синий R-250 во флаконах из темного стекла с притертой стеклянной пробкой; пробирки, пипетки, чашки Петри, предметные стекла, пробойники для создания лунок (колодцев) в агаре и др. лабораторное оборудование.
Приготовление раствора-красителя, используемого для окраски белковых преципитатов казеина: амидочерный 10 В (или кумаси ярко-синий R-250) 50,0 г + этиловый спирт 96° 4,5 л + ледяная уксусная кислота 1,0 л + дист. вода 4,5 л. Краску растворяют, и раствор оставляют на ночь при комнатной температуре, затем фильтруют и используют. Применение красителя повышает чувствительность метода.
Методика внесения казеина в агар. В 10 мл расплавленного и охлажденного до 60-65°С 2% агара в пробирке приливают 1 мл 1% раствора казеина, перемешивают и содержимое быстро выливают в стерильную чашку Петри или на поверхность двух предметных стекол. После застывания агара в нем проделывают лунки диаметром 5-7 мм. В каждую лунку вносят густую взвесь испытуемых микробов, заполняя ее до краев. Чашки (предметные стекла) с посевами помещают в термостат при 37°С. Через 6-12 ч на поверхность агара с пробами наносят проявитель “а” или “б” в объеме 4-5 мл (пробы на предметном стекле опускают в чашку с проявителем), выдерживают 7-10 мин и удаляют.
Регистрация результатов осуществляется визуально. На мутном фоне казеинового агара при положительном результате отмечаются зоны просветления с казеинолитическими микробными культурами. При отрицательной реакции агаровая среда вокруг лунки остается равномерно мутной. Применение красителей способствует повышению чувствительности методики, поскольку мутные преципитаты казеина становятся более контрастными, приобретая черно-синий цвет, а зоны лизиса, наоборот, бывают неокрашенными и светлыми и лучше выявляются, особенно слабые степени бактериального казеинолизиса.
Некоторыми недостатками предлагаемого способа являются:
- плохая растворимость казеина в фосфатном буфере,
- неравномерное его введение в питательную среду.
В качестве прототипа авторы предлагают биохимический экспресс-метод, разработанный в лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Лучшев Л.И., Бондаренко В.М., Исаева Н.П., Земскова Л.И., Шахмарданов М.З., Грицевская Н.Ю. Косвенный метод экспресс-диагностики дисбактериозов кишечника у больных сальмонеллезом и дизентерией. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996, 1:52-54), основанный на определении протеолитической (казеинолитической) активности содержимого толстой кишки, что позволяет в общей сложности оценить состояние микробного биоценоза и дать ориентировочный ответ через 18 ч от начала исследования.
Тестирование казеинолитической активности проводили на чашках Петри с казеиновым агаром после 18-часовой инкубации в термостате. Зоны протеолиза проявляли добавлением 5% трихлоруксусной кислоты.
Активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-15 мм и высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм.
Недостатками прототипа является отсутствие данных о заборе материала для исследований, о способе внесения в питательную среду казеина, о приготовлении питательной среды для определения казеинолитической активности.
Авторами предлагается способ определения казеинолитической (протеолитической) активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериозов в супернатантах фекалий.
Для анализа порции фекалий собирали в стерильную посуду либо сбор материала осуществляли стерильным зондом с декроновым или ватным тампоном, который вводили в прямую кишку как можно выше, и вращательными движениями, избегая соприкосновения со стенками кишечника, собирали материал, который переносили в пробирку с физиологическим раствором. До отправки в лабораторию образцы можно хранить в течение нескольких дней при +5-8°С.
Исследование протеолитической (казеинолитической) активности супернатантов фекалий осуществляли в порции фекалий 1-2 г, которую разводили физиологическим раствором 1:10. После 20 мин отстаивания жидкость над осадком отсасывали и переносили в пробирки, приливали к пробе не более 0,05 мл (1 каплю) хлороформа (для лизиса бактерий и обеззараживания), отстаивали в течение 30-40 мин и вносили в лунки (не более 9 на чашке) со специально приготовленной питательной средой по 20 мкл. В одну из лунок для контроля вносили казеинолитически активную пробу с известной степенью протеолиза.
Способ приготовления питательной среды с казеином состоит из следующих этапов. Вначале готовили 100 мл 3,5% стандартного питательного агара, содержащего дрожжевой или рыбный экстракт и другие ингредиенты (производство г.Махачкала и др.), предназначенного для 5 чашек Петри, и доводили до кипения. Затем готовили 1,5% раствор казеина на 0,2 Н NaOH (0,15 г казеина на 10 мл щелочи). При этом добивались полного растворения казеина в щелочном растворе. После этого питательный агар и раствор казеина смешивали 10:1, автоклавировали при 121°С 15 мин, доводили рН до 7,2-7,4 и разливали в стерильные чашки Петри. После охлаждения чашек на ровной поверхности в агаре делали лунки диаметром 6 мм специальным пробойником или штампом. Таким образом, питательная среда с казеином была готова для внесения в лунки супернатантов фекалий для определения в них казеинолитической (протеинолитической) активности.
После культивирования в термостате при 37°С 6-8 ч зоны протеолиза проявляли внесением на агар 5 мл 5% водного раствора соляной кислоты. При этом не требуется дополнительно подкрашивать агар для проявления зон протеолиза, что сокращает количество этапов и делает способ более экономичным.
Способ позволяет оценить состояние микробного биоценоза, обладает быстротой и легкостью осуществления, что позволяет использовать его в скрининговых исследованиях.
Предложенный способ позволяет полностью растворять казеин и вносить его без остатка в питательную среду. При этом можно увеличить концентрацию казеина в растворе, что повышает чувствительность определения. Время культивирования в термостате сокращается до 6-8 ч. При проявлении реакции не требуется дополнительного подкрашивания среды, т.е. исключается дополнительный этап реакции, что делает способ более экономичным во времени и в плане материальных затрат.
Диаметры зон протеолиза измеряли в миллиметрах (мм). В результате измерения зон протеолиза на нашей среде активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-16 мм, высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм.
При параллельном исследовании фекалий на дисбактериоз с помощью классического бактериологического анализа и с использованием экспресс-метода, проведенным на большом количестве пациентов (543 чел.), была установлена корреляция между снижением популяционного уровня анаэробной облигатной и факультативной нормальной микрофлоры, повышением численности аэробной условно патогенной грамнегативной микрофлоры и размерами зон протеолиза супернатантов фекалий. Это связано с возрастанием количества бактерий, продуцирующих различные протеазы.
Совпадение результатов при использовании классического и экспресс-методов составило 89,8%. Прослеживалась прямая корреляция между диаметрами зон протеолиза и степенью выраженности дисбактериоза, что может применяться с диагностической целью и служить критерием эффективности проводимой терапии.
Claims (1)
- Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериозов кишечника, включающий определение протеолитической активности супернатантов фекалий по зонам лизиса на питательной среде, отличающийся тем, что помещенную в пробирку порцию фекалий массой 1-2 г разводят физиологическим раствором 1:10, после 20 мин отстаивания отсасывают жидкость и переносят ее в пробирки, приливают к пробе не более 0,05-0,1 мл хлороформа, после отстаивания в течение 30-40 мин вносят в лунки с питательной средой по 20 мкл супернатанта, а в одну из лунок - контрольную казеинолитически активную пробу, после чего культивируют в термостате 6-8 ч и зоны лизиса проявляют внесением на агар 5 мл 5%-ного водного раствора соляной кислоты и измеряют диаметры зон просветления, причем среду готовят из 100 мл стандартного питательного агара, доведенного до кипения, приготавливают 1,5%-ный раствор казеина на 0,2 Н NaOH и доводят до полного растворения его в щелочном растворе, после чего питательный агар и раствор казеина смешивают 10:1, автоклавируют при 121°С 15 мин, доводят рН до 7,2-7,4 и разливают в стерильные чашки Петри, а после охлаждения делают лунки диаметром 6 мм в количестве не более 9.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003105528/15A RU2235324C1 (ru) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003105528/15A RU2235324C1 (ru) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2235324C1 true RU2235324C1 (ru) | 2004-08-27 |
RU2003105528A RU2003105528A (ru) | 2004-08-27 |
Family
ID=33414038
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003105528/15A RU2235324C1 (ru) | 2003-02-25 | 2003-02-25 | Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2235324C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2487943C1 (ru) * | 2012-05-25 | 2013-07-20 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий относительно холерных вибрионов in vitro |
-
2003
- 2003-02-25 RU RU2003105528/15A patent/RU2235324C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
НИКИТИН В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. - Кишинев, 1986, с.117-119. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2487943C1 (ru) * | 2012-05-25 | 2013-07-20 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий относительно холерных вибрионов in vitro |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106238112A (zh) | 一种微流控芯片及其在病原体的鉴定与药敏实验中的应用 | |
CN110343780A (zh) | 加德纳杆菌、白色念珠菌和***毛滴虫多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法 | |
CN103266163B (zh) | 一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒 | |
CN111286474B (zh) | 副干酪乳杆菌及其应用 | |
CN101402989A (zh) | 注射器型微生物培养装置 | |
CN104450860A (zh) | 一种肺炎支原体培养基 | |
RU2619834C2 (ru) | Способ исследования кала на дисбактериоз кишечника | |
RU2235324C1 (ru) | Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника | |
CN109385381B (zh) | 一种泌尿生殖道支原体双相培养基 | |
CN108285917A (zh) | 同时检测大肠菌群和沙门氏菌的显色培养基及检测片 | |
Özkalp | Isolation and identification of Salmonellas from different samples | |
RU2768493C1 (ru) | Способ диагностики степени пародонтита по определению протеинолитической активности микроорганизмов ротовой жидкости | |
US5091307A (en) | Procedure for the counting, detection and identification of mycoplasms in general and urinogenital mycoplasms in particular and a biological medium specially adapted to this effect | |
CN105803044A (zh) | 淀粉降解微生物检测试剂盒及检测淀粉降解微生物的方法 | |
CN104178550A (zh) | 结核分枝杆菌药敏指示剂的使用方法 | |
Saha et al. | Prevalence of Salmonella associated with goats in Bangladesh | |
WO2016079733A1 (en) | Method for early diagnosis of cancer | |
RU2553548C1 (ru) | Набор для лабораторной диагностики инфекций, вызываемых mycoplasma hominis и ureaplasma urealyticum | |
RU2088938C1 (ru) | Способ выявления кишечного дисбиоза и кишечной инфекции | |
ES2966679T3 (es) | Métodos y composiciones para mejorar la detección de microorganismos | |
Sahu et al. | Isolation and Biochemical Characterization of Canis Lupus Familiaris and Human Saliva against the Pathogenic Bacteria and Analysis of Antimicrobial Activity | |
RU2261903C1 (ru) | ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Mycoplasma hominis И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМОЗОВ | |
CN211051257U (zh) | 一种无菌检查薄膜过滤装置 | |
RU2027996C1 (ru) | Способ определения степени тяжести дисбактериоза кишечника у детей | |
CN105886595A (zh) | 一种快速检测人体粪便中蛋白质水解细菌的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070226 |