CN110747231A - 一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法 - Google Patents

一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本专利申请属于生物工程技术领域，具体公开了一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其成熟区基因进行人源化表达的密码子优化；步骤二、野生型及优化后基因的腺病毒载体构建与重组病毒包装；步骤三、重组腺病毒感染肿瘤细胞，并检测使其在肿瘤细胞中蛋白表达及其抗肿瘤效应。本方案将α‑苦瓜素基因进行密码子优化，构建能感染哺乳动物肿瘤细胞的腺病毒表达载体***，以适合于在肿瘤细胞中表达活性蛋白，克服了现有技术中使用原核细胞表达体系只能在大肠杆菌中表达以及使用植物病毒载体只能在植物细胞中表达而不能在肿瘤细胞中表达和杀伤肿瘤的缺陷。

Description

一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表 达活性蛋白的方法
技术领域：
本发明申请属于生物工程技术领域，更具体的说是涉及一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法。
背景技术：
核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins，RIPs)是一类主要分布于植物体内的毒蛋白，具有RNA N-糖苷酶活性。RIPs在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，能作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成，从而对细胞产生细胞毒作用。RIPs分为三种类型，I型RIP是单肽链蛋白，分子量大约1l～30 可kDa，如苦瓜核糖体失活蛋白、天花粉蛋白(TCS)、美洲商陆蛋白(PAP)、丝瓜毒蛋白(1uffin)、肥皂草素等，大多数核糖体失活蛋白属于I型；Ⅱ型RIP是二聚体蛋白，如蓖麻毒素，不仅有一条能使核糖体失活的毒性多肽A链，而且还有一条结合多肽B链；Ⅲ型较少见。RIPs具有降血糖、抗生育、抗肿瘤、抗病毒以及治疗艾滋病等药理活性，有广阔的临床应用前景。
目前，Lee-Huang等利用pRSET表达载体在大肠杆菌中表达了MAP30基因，发现非糖基化的重组MAP30与天然MAP30具有相同的活性，Arazi T等(2002)报道用葫芦科植物的专用型病毒载体南瓜黄花病毒(ZYMV-AG1I)载体生产的重组MAP30蛋白同样具有抗病毒、抗肿瘤活性。国内学者周鹏(2005年)、黄乾明(2007)、詹金彪(2010)等也先后成功构建了α-MMC和MAP30的表达***，并获得了具有生物活性的苦瓜核糖体失活蛋白。
但核糖体失活蛋白不论是利用原核载体在大肠杆菌中表达亦或是用植物病毒载体***表达，皆不能在哺乳动物细胞中表达，不能用于抗肿瘤的基因治疗。
发明内容：
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法。
为了达到上述目的，本发明的基础方案为：
一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，包括以下步骤:
步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；
步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type 序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因***到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4) 分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；
步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。
进一步，步骤一中获得的核糖体失活蛋白为具有RNA N-糖苷酶活性，即在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，能作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成，能对肿瘤细胞产生细胞毒作用而杀伤肿瘤。
进一步，核糖体失活蛋白的基因可以选用α-苦瓜素、MAP30、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ- 苦瓜素，天花粉蛋白，美洲商陆蛋白，丝瓜毒蛋白以及肥皂草素等Ⅰ型核糖体失活蛋白以及Ⅱ型核糖体失活蛋白(如蓖麻毒蛋白A链)等基因中的任一一种。
进一步，核糖体失活蛋白的基因为α-苦瓜素基因，包括野生型和优化型α-苦瓜素基因。
进一步，所述A步骤中使用三种专业密码子优化软件同时对α苦瓜素成熟区进行哺乳动物密码子优化，分别是MaxCodonTM Optimization Program、DNAWorks、SyntheticGene Designer，综合各软件的优势得到理想的优化结果，提高了目的基因在哺乳动物细胞以及肿瘤细胞中的表达数量和表达效率。
进一步，步骤二中腺病毒载体为哺乳动物细胞表达***腺病毒载体，以及腺病毒、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体中任意一种构建的核糖体失活蛋白运载体；本方案使用了哺乳动物细胞表达***腺病毒载体，其他载体***也具有相同的载体作用，因此，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体构建核糖体失活蛋白运载体也适用。
技术效果：
本方案以α-苦瓜素基因为实验模型，构建含核糖体失活蛋白的基因表达病毒重组体，核糖体失活蛋白具有RNA N-糖苷酶活性，能失活肿瘤细胞的核糖体，抑制蛋白质合成而对肿瘤细胞产生细胞毒作用。
与现有技术相比本方案方法可以使得目的蛋白表达数量和销量更高；表达后的毒理效应更显著，两种重组病毒对乳腺癌MCF-7细胞和***Hela细胞皆有显著的细胞毒效应，优化型效果更为显著；两种重组病毒对乳腺癌MCF-7细胞和***Hela细胞的生长有显著的抑制作用。
本方案中核糖体失活蛋白皆具有RNA N-糖苷酶活性，因此，本发明含核糖体失活蛋白基因的重组病毒同样适用于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、绒毛膜细胞癌、***、滋养层细胞癌、黑色素瘤的细胞。
附图说明:
图1为本发明的流程示意图
图2为本发明的α苦瓜素基因密码子优化前，氨基酸表达率分析示意图；
图3为本发明的α苦瓜素基因密码子优化后偏好密码子，氨基酸表达率分析示意图；
图4腺病毒穿梭载体图谱；
图5为优化序列穿梭质粒载体pDC316-MMC-mCMV-EGFP酶切示意图；
图6为优化序列穿梭质粒载体α苦瓜素基因测序验证示意图；
图7为野生型序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP构建的PCR结果示意图；
图8为pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP腺病毒载体和PCR回收产物双酶切示意图；
图9为野生型序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP的测序结果比对示意图；
图10为两步法QPCR程序示意图；
图11为野生型苦瓜素和优化密码子苦瓜素溶解曲线示意图；
图12为293T细胞转染荧光图；
图13为WB检测结果示意图；
图14为空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt和重组腺病毒Adv-MMC三种病毒感染乳腺癌MCF-7和***Hela的结果示意图；
图15为MTT法检测细胞的吸光度值(OD值)曲线示意图；
图16为重组腺病毒感染肿瘤细胞5天后观察细胞病变结果示意图；
图17重组病毒感染能显著抑制肿瘤细胞生长效果示意图。
序列表简要说明：序列表(一)显示了α苦瓜素基因密码子优化后的核苷酸序列
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围内。
实施例1
步骤一：α苦瓜素基因密码子优化
1实验方法
使用三种专业密码子优化软件同时对α苦瓜素(alpha-momorcharin)成熟区进行哺乳动物密码子优化，综合各软件的优势得到较理想的优化结果。优化过程遵循以下主要原则：①物种密码子使用偏好，②GC 含量，③CpG二核苷酸含量，④隐匿性剪接位点，⑤提前成熟PolyA位点，⑥內滞点和核糖体结合位点，⑦负链CG岛，⑧RNA不稳定基序(ARE)，⑨重复序列，⑩限制性酶切位点。此外使用Kozak序列和 SD序列来提高mRNA翻译效率，并使用使用TGA终止密码子提高翻译终止信号。
2密码子优化结果
2.1优化前，氨基酸表达率分析
见图2。
2.2优化后偏好密码子，氨基酸表达率分析
见图3。
2.3优化后的序列
GCCACC
ATGGACGTGAGCTTCCGCCTGAGCGGCGCCGACCCCCGCAGCTACGGCAT 50
GTTCATCAAGGACCTGCGCAACGCCCTGCCCTTCCGCGAGAAGGTGTACA 100
ACATCCCCCTGCTGCTGCCCAGCGTGAGCGGCGCCGGCCGCTACCTGCTG 150
ATGCACCTGTTCAACTACGACGGCAAGACCATCACCGTGGCCGTGGACGT 200
GACCAACGTGTACATCATGGGCTACCTGGCCGACACCACCAGCTACTTCT 250
TCAACGAGCCCGCCGCCGAGCTGGCCAGCCAGTACGTGTTCCGCGACGCC 300
CGCCGCAAGATCACCCTGCCCTACAGCGGCAACTACGAGCGCCTGCAGAT 350
CGCCGCCGGCAAGCCCCGCGAGAAGATCCCCATCGGCCTGCCCGCCCTGG 400
ACAGCGCCATCAGCACCCTGCTGCACTACGACAGCACCGCCGCCGCCGGC 450
GCCCTGCTGGTGCTGATCCAGACCACCGCCGAGGCCGCCCGCTTCAAGTA 500
CATCGAGCAGCAGATCCAGGAGCGCGCCTACCGCGACGAGGTGCCCAGCC 550
TGGCCACCATCAGCCTGGAGAACAGCTGGAGCGGCCTGAGCAAGCAGATC 600
CAGCTGGCCCAGGGCAACAACGGCATCTTCCGCACCCCCATCGTGCTGGT 650
GGACAACAAGGGCAACCGCGTGCAGATCACCAACGTGACCAGCAAGGTGG 700
TGACCAGCAACATCCAGCTGCTGCTGAACACCCGCAACATCGCCGAGGGC 750
GACAACGGCGACGTGAGCACCACCCACGGCTTCAGCAGCTACTAA(终止密码子)
步骤二：α苦瓜素基因重组腺病毒载体构建与重组病毒包装
1实验原理
α苦瓜素Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入 pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；α苦瓜素密码子优化后序列进行全序列合成，然后构建到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证。将穿梭载体与腺病毒骨架质粒 pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的重组腺病毒。
2实验方法
2.1腺病毒穿梭载体图谱
见图4。
2.2野生型(WT)序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP构建
①根据α苦瓜素的成熟区序列，设计带酶切位点+保护碱基的PCR上下游引物，序列如下：
引物名称 序列
WT-Mature-F GGAATTCGCCACCATGGATGTTAGCTTTCGTTTGTCG
WT-Mature-R CGGGATCCTTAGTAGCTCGAAAAGCCAT
②以质粒DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：
Figure BDA0002251400860000061
PCR循环过程如下：
Figure BDA0002251400860000062
③PCR产物跑胶检测，胶回收；
④回收PCR产物和腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP双酶切，酶切体系如下：
反应组分 体积(μL)
DdH2O Up to 40
10×Buffer 4.0μL
NotI 1.0μL
HindIII 1.0μL
PCR产物或者pDC316-mCMV-EGFP 30或者4ug
37℃酶切1hr后，80℃灭活10min后进行跑胶检测，胶回收目的条带。
⑤PCR片段与pDC316-mCMV-EGFP载体酶切片段连接，体系如下：
Figure BDA0002251400860000071
⑥连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂板，挑单克隆，测序验证。构建成功的质粒命名为 pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP。
2.3优化后序列穿梭质粒载体pDC316-MMC-mCMV-EGFP构建
①按优化后序列进行全序列合成；
②NotI&HindIII双酶切合成片段与pDC316-mCMV-EGFP连接；
③转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂板，挑单克隆；
④测序验证。构建成功的质粒命名为pDC316-MMC-mCMV-EGFP。
2.4包装病毒，获得重组腺病毒Adv-MMCwt和Adv-MMC
①将293细胞接种于六孔板中，每孔5×105个细胞。待细胞生长至底面积的80％～90％时，分别取穿梭质粒(pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP或pDC316-MMC-mCMV-EGFP)和骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre，以Lipofectamine2000脂质体转染细胞。双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒。实验设空载pDC316-mCMV-EGFP对照。
②在25cm2细胞瓶中培养293细胞，待细胞生长至90％满时，取上述第一代毒种500μL接种于细胞上，待细胞完全病变时冻融细胞3次，离心收集病毒上清液，取50μL第二代毒种上清液，加入2μL蛋白酶K，56℃温育，煮沸10min，冰浴冷却，取1μL作为模板，进行聚合酶链反应鉴定。
③病毒用DNase酶消化后，滤膜过滤，然后进行柱纯化，使用Adeno-X VirusPurification Kit试剂盒。将纯化后的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用0.22μm过滤除菌，获得无菌的纯化病毒，分别命名为重组腺病毒Adv-MMCwt和Adv-MMC，空载病毒为Adv-mCMV。
3实验结果
3.1优化序列穿梭质粒载体pDC316-MMC-mCMV-EGFP酶切和测序结果
(1)双酶切验证：
见图5。
条带M：KB Ladder
条带1：构建好的质粒电泳
条带2：质粒用NotI&HindIII双酶切后电泳
(2)测序验证：
见图6。
序列比对结果完全正确，载体构建成功。
3.2野生型序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP构建结果
(1)PCR结果：
见图7。
PCR条带大小在500bp-750bp之间，为预期大小。
(2)pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP腺病毒载体和PCR回收产物双酶切：
见图8。
(3)测序结果比对：
见图9。
注：用DNAstar软件包中的MegAlign对测序结果进行比对，完全正确。
3.3质粒转染和mRNA表达分析
3.3.1实验原理
将对照空白质粒，Wild Type苦瓜素重组穿梭质粒pDC316-MMC-mCMV-EGFP和优化后的苦瓜素重组穿梭质粒pDC316-MMC-mCMV-EGFP分别转染人***Hela细胞，转染后48hr收集细胞，使用Trizol法抽提总RNA，最后QPCR检测苦瓜素mRNA的表达量。
3.3.2实验方法
(1)细胞转染
接种1×106 Hela细胞至六孔板细胞培养皿，加入2ml完全培养基过夜培养。在细胞汇合率在60％～ 80％，在转染前1～2h为细胞换2ml新鲜完全培养基。准备3个1.5ml无菌离心管，按下表量分别加入各质粒和转染稀释液：
空白对照质粒/WT苦瓜素质粒/优化后苦瓜素质粒 2.0μg
转染稀释液 100.0μL
充分混匀后，室温静置5分钟；然后往每个离心管中分别加入6.0μl转染试剂Nanofusion，充分混匀后，室温静置15分钟；静置完毕，用200.0μl枪头来回吹打3次后，均匀加入到Hela细胞中，十字交叉法或八字法充分摇匀后，将细胞放回培养箱中继续培养。
(2)总RNA提取
将各样本组织在液氮中充分研磨，转移至1.5ml EP管中，加入1ml RNAiso Plus裂解液；在涡旋仪上震荡1min，然后室温静置10min；加入1/5体积的氯仿，在涡旋仪上震荡1min，充分乳化后室温静置10min； 4度13000rpm离心15min；将上层水相小心转入预冷的1.5ml EP管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，充分混匀后室温静置10min；4度13000rpm离心15min；去掉上清，加入70％乙醇洗一遍后，干燥8-10min；加入适量的DEPC水溶解RNA。
(3)RNA浓度测定(分光光度法)
分别取2μL样本加入到痕量分光光度计中，分别测定230nm、260nm、280nm的吸收峰值和比值，计算各样本中RNA的浓度和纯度。
(4)RNA反转录
按下列组份配制反应液(反应液配制在冰上进行)：
试剂 使用量(μl)
5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 2.0
Total RNA 200ng
RNase Free dH<sub>2</sub>O up to 10.0
轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：
37℃ 15min
85℃ 5s
4℃ ∞
(5)QPCR
a.设计并合成引物：
引物名称 序列
wtMMC-F CTCCCAGCGTTGGATAGTGC
wtMMC-R CCTCCGCAGTGGTCTGAATG
opMMC-F TCATCAAGGACCTGAGGAACG
opMMC-R GATGGTCTTGCCGTCATAGTTG
ACTB-F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
ACTB-R CTCCTTAATGTCACGCACGAT
注：wtMMC：野生型苦瓜素；opMMC：优化密码子苦瓜素
b.按下列组份配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行)：
试剂 使用量
TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 10μl
PCR Forward Primer(10μM) 0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM) 0.8μl
ROX Reference DyeI I(50×) 0.4μl
cDNA溶液 2μl
灭菌水 6μl
Total 20μl
c.两步法QPCR程序：
见图10。
3.3.3实验结果
(1)各RNA样本浓度和纯度
样本名称 浓度(ng/μl) OD260/OD280 OD260/OD230
Ctr1 177.6 1.86 1.93
wtMMC 165.3 1.89 1.97
opMMC 160.9 1.93 1.88
(2)溶解曲线
见图11。
(3)苦瓜素mRNA表达量
通过计算在野生型苦瓜素过表达的细胞中，其野生型苦瓜素的表达量为对照的184083倍，在优化密码子苦瓜素过表达的细胞中，其优化型苦瓜素的表达量为对照的6566379倍。
3.4质粒转染和目的蛋白表达分析
3.4.1实验原理
将对照空白质粒、Wild Type苦瓜素重组穿梭质粒pDC316-MMC-mCMV-EGFP和优化后的苦瓜素重组穿梭质粒pDC316-MMC-mCMV-EGFP分别转染人胚肾293T细胞，转染后48h进行荧光拍照，然后收集细胞，裂解后收集蛋白进行浓度测定，最后WB检测苦瓜素蛋白的表达量。
3.4.2实验方法
(1)细胞转染
接种1×106 293T细胞至六孔板细胞培养皿，加入2ml完全培养基过夜培养。在细胞汇合率在60％～80％，在转染前1～2h为细胞换2ml新鲜完全培养基。准备3个1.5ml无菌离心管，按下表量分别加入各质粒和转染稀释液：
空白对照质粒/WT苦瓜素质粒/优化后苦瓜素质粒 2.0μg/4.0μg
转染稀释液 100.0μL
充分混匀后，室温静置5分钟；然后往每个离心管中分别加入6.0μL/12μL转染试剂Nanofusion，充分混匀后，室温静置15分钟；静置完毕，用200.0μL枪头来回吹打3次后，均匀加入到293T细胞中，十字交叉法或八字法充分摇匀后，将细胞放回培养箱中继续培养。
(2)转染后细胞荧光拍照
对转染后的三组细胞进行荧光拍照，观察荧光的表达情况。
(3)细胞总蛋白提取
a.质粒转染48h后，弃掉培养基，用1XPBS洗1次，加入500μL胰酶消化2分钟。b.加入1mL完全培养基终止消化，用枪头吹下所有细胞，转移至EP管中。c.1000rpm离心5分钟。d.弃掉上清，加入预冷1XPBS洗一次，1000rpm离心5分钟。e.弃掉上清，加入0.1mL含蛋白酶抑制剂的RIPA Lysis buffer。f.用枪头充分吹打细胞，然后冰上裂解30分钟。g.12000rpm，4℃离心15min后，将上清转移至新EP 管中，进行浓度测定。
3.4.3实验结果
(1)293T细胞转染荧光图
见图12。
(2)WB检测结果
见图13。
细胞荧光图片、WB结果显示，密码子优化后的苦瓜素蛋白在人源细胞293T中的表达水平明显高于野生型。
步骤三：重组苦瓜素腺病毒对肿瘤细胞的毒理效应
1实验原理
将空载病毒Adv-mCMV、野生型重组腺病毒Adv-MMCwt和优化重组腺病毒Adv-MMC分别感染人乳腺癌MCF-7细胞和人***Hela细胞，转染后48h进行荧光拍照，然后将细胞传入96孔板中进行 MTT细胞毒性实验或者传少量转染后细胞到10cm细胞培养皿中进行细胞克隆形成实验，观察胞内表达的苦瓜素对肿瘤细胞生长的影响。
2实验方法
2.1苦瓜素重组病毒在肿瘤细胞中表达荧光
①细胞准备
分别接种1×106个MCF-7细胞或者Hela细胞至6孔板细胞培养皿，加入2mL完全培养基过夜培养。在细胞汇合率在60％～80％，在转染前1～2h为细胞换2mL新鲜完全培养基。
②病毒颗粒感染细胞
以体积为1.0ml MOI＝10的病毒感染量分别接入空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt 和重组腺病毒Adv-MMC到如上MCF-7细胞或者Hela细胞培养板孔中。十字交叉法或八字法充分摇匀后，将细胞放回培养箱中继续培养。4小时后，更换新鲜培养基，继续培养。
③对转染后的三组细胞进行荧光拍照，观察荧光的表达情况。
2.2苦瓜素重组病毒对肿瘤细胞的毒理效应
①细胞准备
分别接种1×106个MCF-7细胞或者Hela细胞至6孔板细胞培养皿，加入2mL完全培养基过夜培养。在细胞汇合率在60％～80％，在转染前1～2h为细胞换2mL新鲜完全培养基。
②病毒颗粒感染细胞
以体积为1.0ml MOI＝10的病毒感染量分别接入空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt 和重组腺病毒Adv-MMC到如上MCF-7细胞或者Hela细胞培养板孔中。十字交叉法或八字法充分摇匀后，将细胞放回培养箱中继续培养。4小时后，更换新鲜培养基，继续培养。
③感染后48h，用胰酶消化细胞，传入96孔板中进行MTT检测，每个孔铺10000个细胞；
④12h后，细胞完全贴壁，进行第一次MTT测定，每组检测5个复孔；
⑤此后每隔12h进行一次MTT测定，共检测6个时间点，每组检测5个复孔。
⑥于最后一次MTT测定前细胞形态观察并拍照。
2.3苦瓜素重组病毒对肿瘤细胞克隆形成能力的抑制作用
①空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt和重组腺病毒Adv-MMC分别感染人乳腺癌 MCF-7细胞和人***Hela细胞；
②转染后48h，用胰酶消化细胞，传200个细胞至10cm细胞培养皿中；
③待细胞完全贴壁后，连续培养7d，在相差显微镜下观察并计数细胞克隆总数。
3实验结果
3.1重组病毒在肿瘤细胞中表达明亮荧光
重组病毒颗粒在感染细胞后，病毒会增殖并表达出荧光素蛋白，显现出绿色荧光。从下图结果可看出，不论空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt还是重组腺病毒Adv-MMC，在乳腺癌MCF-7 细胞中皆呈现出明亮的强荧光，密码子优化的Adv-MMC表达荧光尤为鲜明。相应感染细胞的非荧光图片也显示出，同空载体病毒相比，培养细胞较为稀疏，在Adv-MMC组的细胞生长状态较差。三种病毒感染***Hela的结果基本相同，如图14所示。
见图14。
3.2重组病毒对肿瘤细胞有显著的细胞毒效应
重组病毒感染乳腺癌MCF-7细胞和***Hela细胞24h后，每12h MTT法检测细胞的吸光度值(OD 值)，作图如下。实验结果非常清晰地显示，随着病毒感染的时间推移，能表达苦瓜素的Adv-MMCwt组和Adv-MMC组皆有较强的细胞毒作用，OD值降低明显，与空载体病毒组有显著性差异，其中，优化组 Adv-MMC效果更加明显。苦瓜素重组腺病毒对MCF-7和Hela细胞的细胞毒效应相近，如图15所示。
见图15。
重组腺病毒感染肿瘤细胞5天后观察细胞病变，如图16所示。阴性对照空载病毒组的细胞状态良好，但Adv-MMCwt组和Adv-MMC组细胞有大片脱落、死亡，细胞层生长稀疏，细胞形态不规则，胀大和坏死明显。其中，优化病毒组的坏死效应更强。
见图16。
3.3重组病毒感染能显著抑制肿瘤细胞克隆形成
空载腺病毒Adv-mCMV、分别感染人乳腺癌MCF-7细胞和人***Hela细胞后接种，7d后能观察到，空载腺病毒Adv-mCMV尚能形成较大的片状岛形细胞克隆，Adv-MMCwt和Adv-MMC感染组只能有小岛状细胞克隆，如图17所示。
见图17。

Claims (6)

1.一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；
步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因***到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；
步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。
2.根据权利要求1所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，步骤一中选取的核糖体失活蛋白为具有RNA N-糖苷酶活性，在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成。
3.根据权利要求2所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，步骤一选取的核糖体失活蛋白的基因可以选用α-苦瓜素、MAP30、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素，天花粉蛋白，美洲商陆蛋白，丝瓜毒蛋白以及肥皂草素等Ⅰ型核糖体失活蛋白以及Ⅱ型核糖体失活蛋白如蓖麻毒蛋白A链等基因中的任一一种。
4.根据权利要求3所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，核糖体失活蛋白的基因为α-苦瓜素基因。
5.根据权利要求4所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，所述A步骤中使用三种专业密码子优化软件同时对α苦瓜素成熟区进行哺乳动物密码子优化，分别是：MaxCodonTM Optimization Program、DNAWorks、Synthetic Gene Designer，综合各软件的优势得到较理想的优化结果。
6.根据权利要求5所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，步骤二中腺病毒载体为哺乳动物细胞表达***腺病毒载体，以及腺病毒、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体中任意一种构建的核糖体失活蛋白运载体。
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