CN103254333A - 超高交联树脂sx-01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了超高交联树脂SX-01及其制备方法，将氯甲基化聚苯乙烯树脂在3～8倍重量的邻硝基乙苯中充分溶胀，溶胀后搅拌加入2～5倍氯球重量的胺化试剂，再加入10～30%氯球重量的三氯化铁作傅氏催化剂，在100～150℃进行Friedel-Crafts后交联反应，当树脂残余氯含量为1～3%时停止反应，反应结束后冷却滤出树脂球体，用乙醇、蒸馏水洗涤，真空干燥后制得超高交联树脂SX-01。本发明还公开了该树脂用来分离尿嘧啶核苷酸的新方法。本发明采用吸附柱吸附分离尿苷酸，可减少操作过程中酸碱的用量，减少废水排放量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及超高交联树脂SX-01及其应用。
背景技术
5’-核苷酸是核糖核酸的水解产物,广泛应用于食品、医药和农业等领域。例如，作为功能性食品添加剂添加到面包、饼干等食品中，特别是添加到婴幼儿奶粉中，有助于婴幼儿新陈代谢，提高婴幼儿的免疫力。同时,尿苷酸可参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸的生物合成，药用品制成其二钠盐，可制成片剂及注射液使用。并可用于制造尿苷三磷酸(UTP)、聚腺尿、氟铁龙、阿糖尿苷等药物。此外，核苷酸的混合制剂作为植物生长调节剂在农业上已被应用多年。在果树、蔬菜及农作物的栽培、培养中应用核苷酸制剂，平均增产可达10%。在果树生长方面，以一定比例混合的核苷酸可以增加叶绿素含量，提高光合作用强度，达到保叶、保鲜、保果、增花、增糖、增重的目的。因此,尿苷酸的生产与纯化越来越受到人们的重视。
专利（CN1408719A）公开了一种用阴离子交换树脂从核糖核酸酶解液中分离核苷酸的工艺和装置。其方法是:用两根强碱阴离子交换树脂和四根活性炭柱吸附分离四种核苷酸，将酶解液通过两根串联的强碱阴离子交换树脂柱,使四种核苷酸吸附在两根强碱阴离子交换树脂柱中。然后用酸、碱等溶液洗脱树脂柱和碳柱，分别得到四种核苷酸。该方法分离效果好，树脂用量少，但是每个操作步骤均用到酸或碱，酸碱用量非常大，废液排放量大。
专利(CN101781346A)公开了一种从生物催化转化液中分离尿苷酸的方法,其方法是将生物催化转化液经离心超滤纳滤处理后,进入阴离子交换柱进行吸附,去离子水洗杂,无机盐洗脱,洗脱液经结晶干燥得到尿苷酸晶体。该方法分离效果好，所得产品纯度高，但是阴离子交换柱的解吸及再生需消耗大量的酸、碱溶液，废水排放量大,污染严重。
专利（CN1740334A）公开了一种酶法生产核苷酸的方法,其方法是先酶解核糖核酸得到四种核苷酸混合溶液,然后用活性炭进行脱色,最后通过强酸性阳离子交换树脂进行层析分离得到四种核苷酸.该方法能够得到四种核苷酸,但是分离出的尿苷酸中含有较多杂质,纯度不高。
目前，尿苷酸的生产方法有化学合成法、微生物发酵法、酶解法和生物催化法。但是，4种核苷酸的分离一直是其生产过程的难点。工业上普遍采用阳-阴离子交换树脂吸附分离分别得到4种5’-核苷酸。该工艺易于控制，但是存在工艺繁琐，酸碱用量大，废液污染严重，成本高等缺点。
UMP料液中成分复杂,除了含有要分离得到的UMP外,还有多糖、磷酸盐、无机盐及色素等等。目前，工业上一般采用阴离子交换法分离尿苷酸，该工艺成熟，但是单元操作多且阴离子交换树脂的再生需要消耗大量的酸、碱等试剂，污染严重。
发明内容
发明目的：本发明的第一个目的是提供超高交联树脂SX-01。本发明的第二个目的是提供超高交联树脂SX-01的制备方法。本发明的第三个目的是提供一种利用该超高交联树脂SX-01进行分离尿嘧啶核苷酸的新方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：超高交联树脂SX-01，其特征在于，所述超高交联树脂SX-01具有如下结构单元：
该树脂的骨架为聚苯乙烯，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m2/g,平均孔容为0.54～0.82cm3/g。该结构单元是通过图1的红外分析光谱分析得出：3100-3200cm-1处为N-H的伸缩振动吸收峰，2900-3000cm-1处为C-H的伸缩振动吸收峰；1500-1670cm-1处为苯环的骨架振动峰；1395cm-1处为C-N的伸缩振动吸收峰。
所述的超高交联树脂SX-01的制备方法，包括如下步骤：将氯甲基化聚苯乙烯树脂在3～8倍重量的邻硝基乙苯中充分溶胀，溶胀后搅拌加入2～5倍氯球重量的胺化试剂，再加入10～30%氯球重量的三氯化铁作傅氏催化剂，在100～150℃进行Friedel-Crafts后交联反应，当树脂残余氯含量为1～3%时停止反应，反应结束后冷却滤出树脂球体，用乙醇、蒸馏水洗涤，真空干燥后制得超高交联树脂SX-01。
一种分离尿嘧啶核苷酸的新方法，包括以下步骤，
1）上料：将3.6g/L～9g/L的UMP料液通过所述的超高交联树脂SX-01的吸附柱；
2）吸附：通过循环水预加热步骤1）的超高交联树脂SX-01吸附柱内的UMP料液，维持柱温在15℃～20℃，吸附流速为0.5～3BV/h，吸附95～340min后停止进料，并将柱内的液体排干；
3）洗脱：用50～70℃的去离子水洗脱吸附饱和的吸附柱，通过循环水预加热吸附饱和的吸附柱，维持柱温为50～70℃，洗脱流速为1.5～4BV/h，用3-4BV的纯水将UMP从吸附柱上洗脱下来，收集UMP洗脱液；
4）浓缩：将UMP洗脱液进行纳滤膜浓缩处理，再加入1～4倍去离子水反复进行浓缩，直至UMP浓度为80～150g/L，pH为6.0～8.0，工作压力0.8～1MPa，温度为20～50℃；
5）结晶：将步骤4）中得到的UMP纳滤透过液作为母液，在温度20～60℃，流加无水乙醇体积为母液1～5倍，搅拌速率60～200rpm下使得母液结晶，干燥后得到尿苷酸二钠晶体。
优选地，所述胺化试剂为甲胺或二甲胺。
优选地，所述纳滤膜为聚酰胺膜。
优选地，所述吸附柱高径比为8～15:1。
优选地，所述吸附柱至少有两个。保证始终有一根吸附柱处于吸附操作状态。
优选地，所述步骤2）中吸附柱内的UMP料液流向是自柱顶至柱底，循环水流向是自柱底至柱顶。
优选地，所述步骤3）中去离子水流向是自柱顶至柱底，循环水流向是自柱底至柱顶。
本发明采用吸附柱吸附分离尿苷酸，可减少操作过程中酸碱的用量，减少废水排放量。本发明使用的吸附剂为超高交联吸附树脂，该吸附树脂可以直接吸附尿苷酸，同时对共存的杂质离子基本不吸附。加之，通过热解吸的方法可以将尿苷酸从吸附剂中洗脱下来，减少环境污染。在吸附操作过程中，尿苷酸被选择性的吸附，不含尿苷酸的流出液从吸附柱的另一端流出，当吸附剂吸附饱和后，停止进料，转向洗脱操作。将柱内的液体排干后以50～70℃的去离子水作为洗脱剂洗脱柱上的尿苷酸，维持柱温50～70℃收集洗脱液得到尿苷酸溶液。用截留分子量为100～300的纳滤膜进行纳滤,加入去离子水反复进行,去除无机盐及色素,同时达到浓缩的目的，经结晶得到尿苷酸二钠晶体。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：（1）本发明的超高交联树脂SX-01吸附树脂具有对尿苷酸吸附选择性好的优点；（2）本发明提供的一种分离尿苷酸的新方法，选择的吸附树脂属于热再生树脂，在温度较低时，可吸附尿苷酸，在温度较高时，失去对尿苷酸的吸附作用，因此热水可将尿苷酸洗脱下来；（3）本发明的超高交联树脂SX-01吸附树脂对共存的杂质离子基本不吸附，从而实现尿苷酸与杂质离子的分离；（4）采用热解吸技术进行常温吸附高温解吸操作，不仅一步完成树脂的解吸和再生，而且热再生树脂不需要消耗酸碱或有机溶剂，可降低能耗减少废水排放量，避免环境污染问题，是一种清洁环保的生产工艺。
附图说明
图1本发明超高交联树脂SX-01的红外光谱图；
图2本发明超高交联树脂SX-01的扫描电镜图（SEM图）；
图3本发明超高交联树脂SX-01的BET图；
图4本发明超高交联树脂SX-01的孔径分布图；
图5本发明实施例3中UMP在不同温度下的吸附等温线；
图6本发明实施4中尿苷酸和PO4 3-的柱穿透曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：UMP料液的获得
RNA的酶解工艺，采用核酸酶溶液作用于RNA溶液得到4种5’-单核苷酸，即为5’-腺苷酸(AMP)、5’-胞苷酸(CMP)、5’-鸟苷酸(GMP)和5’-尿苷酸(UMP)。具体步骤如下：
（1）配制pH=5.5的6%RNA溶液600mL。先用NaOH将pH调至12后加入RNA（36g）进行溶解，再用NaOH调pH=5.5，置于70℃水浴锅中预热至70℃。
（2）向RNA溶液中加入预热半小时的酶液50mL，摇匀，反应温度控制在70℃，酶解185min。
（3）再加入0.2%（1.2g）活性炭，继续酶解50min。
（4）最后冷却至45℃酶解结束，离心（400rpm，10min），抽滤得到RNA酶解液。
将RNA酶解液自上而下经过装有NH-1树脂的吸附柱,柱高径比为15:1，吸附流速为1mL/min，吸附125min后停止进料，收集吸附流出液,得到UMP料液。
实施例2:超高交联树脂SX-01的获得
在洁净、干燥的2000mL三口烧瓶中,加入200g干燥的氯甲基化聚苯乙烯树脂（氯球）,加入1200g邻硝基乙苯，搅拌混匀，室温下充分溶胀2h以上，溶胀后搅拌加入4倍氯球重量的甲胺，再加入催化剂无水三氯化铁20g，在搅拌下程序升温至135～150℃，再此温度下进行Friedel-Crafts后交联反应一定时间，控制残余氯含量在1～3%，停止反应，冷却后吸出母液，用工业酒精反复抽提树脂至提取流出液无色清亮为止，在依次用4%盐酸和蒸馏水洗涤树脂至中性，烘干备用。
所得产物为棕色圆颗粒形状，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m2/g,平均孔容为0.54～0.82cm3/g。通过图1的红外光谱图推导出树脂的化学结构式，通过图2和图3计算树脂比表面积得到比表面积，通过图4得到树脂的孔径及最可几孔径。
实施例3:超高交联树脂SX-01的吸附等温线的绘制
图5是用Langmuir模拟UMP的吸附等温线，其实验过程为：配制不同浓度pH=1.6的UMP溶液,分别移取50mL于100mL的三角烧瓶中,在分别加入5g的超高交联树脂SX-01。封口后分别置于293K，313K，333K的恒温摇床中，设定转速为160rpm，待吸附平衡后，测定溶液中UMP的浓度。对实验数据采用Langmuir等温方程式进行拟合。
结果如图5所示，可见UMP的吸附过程符合Langmuir吸附等温模型。随着温度的升高，超高交联树脂SX-01对UMP的吸附容量减少，说明该树脂对UMP的吸附过程可能是放热过程。升高温度加速UMP回到溶液中，而不是吸附到树脂上。由此可以推断，升高温度有利于UMP从该树脂上解吸下来。
实施例4：UMP料液的分离浓缩结晶的过程
将浓度为4g/L的UMP料液自上而下,经过装有超高交联树脂SX-01的吸附柱,柱高径比为13:1，通过循环水预加热树脂，维持柱温在20℃，吸附流速为1.5BV/h，吸附185min后停止进料,并将柱内的液体排干。用60℃的纯水洗脱吸附饱和的吸附柱，通过循环水预加热吸附饱和的吸附柱，维持柱温为60℃，用4BV的纯水以1.5BV/h流速将UMP从吸附柱上洗脱下来,收集洗脱液，实现UMP的分离。向洗脱后的吸附柱中以2BV/h的流速通入纯水冷却，12min后吸附柱降至常温，即可用于下一次的吸附操作。本实施例中，洗脱收率为93.6%,洗脱液中UMP的纯度为98.2%，磷酸根去除率达到94.4%,色素去除率为82%。（如图6）
将UMP洗脱液进行纳滤浓缩处理,后加入2倍去离子水反复进行浓缩，直至UMP浓度为100g/L停止。所述的纳滤膜为聚酰胺膜,截留分子量为150，工作压力为1MPa，纳滤温度为30℃,纳滤pH值为7.0。100g/L的UMP纳滤透过液作为母液经结晶、干燥后得到尿苷酸二钠晶体。操作条件为：维持温度30℃、搅拌速率100rpm向结晶母液中流加无水乙醇，流加体积为结晶母液的3倍。当有晶体出现时，停止流加无水乙醇，空转1h，再继续流加无水乙醇直至流加完毕。所得晶体纯度为98.8%，结晶收率为92%。
实施例5：UMP料液的分离浓缩结晶的过程
将浓度为5.8g/L UMP阳柱流出液自上而下,经过装有超高交联树脂SX-01的吸附柱,柱高径比为9:1，通过循环水预加热树脂，维持柱温在25℃，吸附流速为2BV/h，直至吸附饱和。吸附结束后停止进料,并将柱内的液体排干。用70℃的去离子水洗脱吸附饱和的吸附柱，通过循环水预加热吸附饱和的吸附柱，维持柱温为70℃，洗脱流速为2BV/h，用3BV的纯水将UMP从吸附柱上洗脱下来,收集洗脱液，实现UMP的分离。向洗脱后的吸附柱中以2BV/h的流速通入去离子水冷却，20min后吸附柱降至常温，即可用于下一次的吸附操作。本实施例中，洗脱收率为95%,洗脱液中UMP的纯度为97.6%，磷酸根去除率达到93.4%,色素去除率为88%。
将UMP洗脱液进行纳滤浓缩处理,后加入2倍去离子水反复进行浓缩，直至UMP浓度为140g/L停止。所述的纳滤膜为聚酰胺膜,截留分子量为150，工作压力为1MPa，纳滤温度为30℃,纳滤pH值为7.0。140g/L的UMP纳滤透过液作为母液经结晶、干燥后得到尿苷酸二钠晶体。操作条件为：维持温度30℃、搅拌速率100rpm向结晶母液中流加无水乙醇，流加体积为结晶母液的2.5倍。当有晶体出现时，停止流加无水乙醇，空转1h，再继续流加无水乙醇直至流加完毕。所得晶体纯度为98.1%，结晶收率为94.5%。
实施例6：UMP料液的分离浓缩结晶的过程
将浓度为8g/L UMP料液自上而下,经过装有超高交联树脂SX-01的吸附柱,柱高径比为11:1，通过循环水预加热树脂，维持柱温在20℃，吸附流速为2.5BV/h，直至吸附饱和。吸附结束后停止进料,并将柱内的液体排干。用65℃的去离子水洗脱吸附饱和的吸附柱，通过循环水预加热吸附饱和的吸附柱，维持柱温为65℃，洗脱流速为2.5BV/h，用4BV的纯水将UMP从吸附柱上洗脱下来,收集洗脱液，实现UMP的分离。向洗脱后的吸附柱中以2BV/h的流速通入纯水冷却，16min后吸附柱降至常温，即可用于下一次的吸附操作。本实施例中，洗脱收率为96.1%,洗脱液中UMP的纯度为98.0%，磷酸根去除率达到93.7%,色素去除率为85%。
将UMP洗脱液进行纳滤浓缩处理,后加入2倍去离子水反复进行浓缩，直至UMP浓度为110g/L停止。所述的纳滤膜为聚酰胺膜,截留分子量为150，工作压力为1MPa，纳滤温度为30℃,纳滤pH值为7.0。100g/L的UMP纳滤透过液作为母液经结晶、干燥后得到尿苷酸二钠晶体。操作条件为：维持温度30℃、搅拌速率100rpm向结晶母液中流加无水乙醇，流加体积为结晶母液的3倍。当有晶体出现时，停止流加无水乙醇，空转1h，再继续流加无水乙醇直至流加完毕。所得晶体纯度为98.3%，结晶收率为92.3%。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.超高交联树脂SX-01，其特征在于，所述超高交联树脂SX-01具有如下结构单元：
该树脂的骨架为聚苯乙烯，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m2/g,平均孔容为0.54～0.82cm3/g。
2.权利要求1所述的超高交联树脂SX-01的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将氯甲基化聚苯乙烯树脂在3～8倍重量的邻硝基乙苯中充分溶胀，溶胀后搅拌加入2～5倍氯球重量的胺化试剂，再加入10～30%氯球重量的三氯化铁作傅氏催化剂，在100～150℃进行Friedel-Crafts后交联反应，当树脂残余氯含量为1～3%时停止反应，反应结束后冷却滤出树脂球体，用乙醇、蒸馏水洗涤，真空干燥后制得超高交联树脂SX-01。
3.一种分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，包括以下步骤，
1）上料：将3.6g/L～9g/L的UMP料液通过权利要求1所述的超高交联树脂SX-01的吸附柱；
2）吸附：通过循环水预加热步骤1）的超高交联树脂SX-01吸附柱内的UMP料液，维持柱温在15℃～20℃，吸附流速为0.5～3BV/h，吸附95～340min后停止进料，并将柱内的液体排干；
3）洗脱：用50～70℃的去离子水洗脱吸附饱和的吸附柱，通过循环水预加热吸附饱和的吸附柱，维持柱温为50～70℃，洗脱流速为1.5～4BV/h，用3-4BV的纯水将UMP从吸附柱上洗脱下来，收集UMP洗脱液；
4）浓缩：将UMP洗脱液进行纳滤膜浓缩处理，再加入1～4倍去离子水反复进行浓缩，直至UMP浓度为80～150g/L，pH为6.0～8.0，工作压力0.8～1MPa，温度为20～50℃；
5）结晶：将步骤4）中得到的UMP纳滤透过液作为母液，在温度20～60℃，流加无水乙醇体积为母液1～5倍，搅拌速率60～200rpm下使得母液结晶，干燥后得到尿苷酸二钠晶体。
4.根据权利要求1所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述胺化试剂为甲胺或二甲胺。
5.根据权利要求3所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述纳滤膜为聚酰胺膜。
6.根据权利要求3所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述吸附柱高径比为8～15:1。
7.根据权利要求3所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述吸附柱至少有两个。
8.根据权利要求3所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述步骤2）中吸附柱内的UMP料液流向是自柱顶至柱底，循环水流向是自柱底至柱顶。
9.根据权利要求3所述的分离尿嘧啶核苷酸的新方法，其特征在于，所述步骤3）中去离子水流向是自柱顶至柱底，循环水流向是自柱底至柱顶。
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Granted publication date: 20150218 Termination date: 20160521 |