CN103331035A

CN103331035A - 一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法

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Publication number: CN103331035A
Application number: CN2013102694366A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 焦朋飞; 吴菁岚; 刘俊; 周精卫; 张宇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-10-02
Anticipated expiration: 2033-06-28
Also published as: CN103331035B

Abstract

本发明一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法，将核苷酸酶解液通过超高交联树脂SX-01进行色素吸附，吸附饱和后，超高交联树脂SX-01利用再生剂进行再生；其中，所述的超高交联树脂SX-01具有如下结构单元，该树脂的骨架为聚苯乙烯，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m²/g，平均孔容为0.54～0.82cm³/g。本发明方法酶解液脱色率达到80%以上，处理量达到11倍床层体积（Bed Volumn,BV），四种核苷酸损失率均低于5%，再生剂消耗量为5BV。

Description

一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法

技术领域

本发明属于5’-核苷酸的分离纯化领域，具体涉及超高交联树脂SX-01在核苷酸酶解液脱色中的应用。

背景技术

核苷、核苷酸是构成生物遗传信息DNA和RNA的基础，在生物细胞的物质代谢和能量转换中起着重要作用。5’-单核苷酸及其衍生物在遗传工程、医药、食品、农业生产及科研领域有着十分重要的用途。在保健品、婴幼儿食品中添加核苷酸有利于人体补充核苷酸，使核苷酸代谢处于旺盛状态，可以达到抵抗衰老、延长人体寿命、提高人体免疫功能及治疗疾病的目的；在农业方面，核苷酸作为植物生长刺激剂利用潜力很大，实验证明，核苷酸能提高种子内含物的转化能力、出苗率和苗的质量，促进植物根系的生产，并能加深叶色，提高叶绿素含量；在化妆品方面，由于核苷酸具有促进蛋白质合成的作用，核苷酸制品在化妆行业的应用也很广泛，可添加于洗涤剂、乳化剂、雪花膏、乳液、戏剧化妆品中，能够促进皮肤的新陈代谢、具有防皱、生肌保湿、控制皮脂分泌、阻止紫外线吸收、使皮肤柔软的作用，对雀斑、荞麦皮肤、青春痘香港脚等各种皮肤病都能发挥极强的渗透力，治疗效果显著。

核苷酸的生产方法主要有4种：化学合成法、RNA酶解法、微生物发酵法及生物催化法，其中酶解法是国内外核苷酸生产所用的主要技术。但是在RNA酶解液中含有大量色素，如果不经预处理直接用树脂分离，尽管树脂会过滤掉一部分杂质，但还是会有很大一部分色素残留于核苷酸的洗脱液中，对核苷酸的后分离和结晶工序都带来很大的压力，影响核苷酸产品的纯度和色度，而且被吸附于树脂上的色素会造成树脂不同程度的毒化，从而降低树脂的重复利用率。因此有必要除去酶解液中的色素，从而减轻下游分离的压力。

目前对核苷酸酶解液脱色的研究较多，其中张剑秋公开了申请号为200510094493.0的专利《酶法生产核苷酸的工艺》，使用酸性脱色树脂对核苷酸酶解液进行了脱色；大连珍奥生物技术有限公司公开了申请号为200810228964.6的专利《高纯度5’-核苷酸的生产新工艺》，使用活性炭粉末对酶解后的核苷酸进行了脱色；肖林平的论文《5’-尿苷酸分离纯化工艺的研究》中使用超滤膜超滤酶解液然后再使用活性炭粉末对酶解液进行脱色。但是，酸性脱色树脂再生的过程中要消耗大量的酸，活性炭回收较难，而且酸性脱色树脂和活性炭对核苷酸都有少量的吸附，会损失一部分核苷酸，而本发明所使用的超高交联度树脂SX-01对四种核苷酸吸附较少，而且脱色效果较好，脱色率较高，再生工艺简单，再生剂消耗量较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法，将核苷酸酶解液通过超高交联树脂SX-01进行色素吸附，吸附饱和后，超高交联树脂SX-01利用再生剂进行再生；

其中，所述的超高交联树脂SX-01具有如下结构单元：

该树脂的骨架为聚苯乙烯，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m²/g，平均孔容为0.54～0.82cm³/g。该结构单元是通过图1的红外分析光谱分析得出：3100-3200cm^-1处为N-H的伸缩振动吸收峰，2900-3000cm^-1处为C-H的伸缩振动吸收峰；1500-1670cm^-1处为苯环的骨架振动峰；1395cm^-1处为C-N的伸缩振动吸收峰。

所述的超高交联树脂SX-01的制备方法为：将氯甲基化聚苯乙烯树脂在3～8倍重量的邻硝基乙苯中充分溶胀，溶胀后搅拌加入2～5倍氯球重量的胺化试剂，再加入10～30%氯球重量的三氯化铁作傅氏催化剂，在100～150℃进行Friedel-Crafts后交联反应，当树脂残余氯含量为1～3%时停止反应，反应结束后冷却滤出树脂球体，用乙醇、蒸馏水洗涤，真空干燥后制得超高交联树脂SX-01。

其中，所述的核苷酸酶解液是用核酸酶p1酶解RNA粉末得到。制备过程如下：

(1)配制pH=5.5的6%RNA溶液600ml：先用1mol/l的NaOH溶液将600ml去离子水pH调至13左右，然后加入RNA粉末（36g）进行溶解，再用1mol/l的NaOH调pH至5.5，置于70℃水浴锅中预热至70℃。

(2)向RNA溶液中加入70℃条件下预热半小时的酶液50mL，摇匀，在70℃条件下酶解3h50min。

(3)再加入0.2%（1.2g）活性炭，继续酶解50min。

(4)冷却至45℃，在4000rpm条件下离心10min，抽滤，即得到RNA酶解液。

其中，色素吸附方式为固定床吸附，树脂柱高径比为8～12，吸附流速为1～3BV/h，柱温控制为30～50℃。

其中，所述的再生剂为1mol/L NaOH与无水乙醇。

其中，再生过程为先用3BV1mol/L NaOH进行再生，然后用无水乙醇进行再生直至流出液接近无色时用去离子水洗去树脂中的乙醇，NaOH和乙醇的流速均为1BV/h。

本发明中使用分光光度计在420nm处对酶解液中色素进行检测，酶解液的OD₄₂₀与酶解液中色素的浓度成正比关系，酶解液的脱色率用以下公式来计算：

脱色率(%)=(A_前-A_后)/A_前*100%

其中A_前、A_后分别为脱色前、后酶解液在420nm处的吸光度。

本发明中使用HPLC采用外标法对酶解液中核苷酸浓度进行定量检测，色谱条件为：

1．色谱柱：汉邦Lichrospher C18（250mm×4.6mm i.d.，5μm）；

2．流动相：A：超纯水；B：甲醇；C：(NH₄)H₂PO₄和甲醇的水溶液（20mmol/L(NH₄)H₂PO₄+35ml/L乙醇）。梯度洗脱程序：0～2min，C相体积分数（下同）100%；2～8min，B相由0%线性增加至11%，C相由100%线性降低至89%；9～10min，B相由11%线性降低至0%，C相增加至100%；10～15min，C相为100%；

3．流速：1.0ml/min；

4．检测波长：254nm；

5．柱温：室温；

6．进样体积：20μL。

检测方法以及步骤：

1.柱子的平衡：配制好的水以及缓冲液用孔径0.22μm的混合微孔滤膜过滤，甲醇用孔径0.45μm的尼龙微孔滤膜过滤，过滤后进行超声处理30min。将处理后的流动相置于高效液相色谱上，打开高效液相色谱，用100%的甲醇，流速为1ml/min，冲洗柱子约20min；待压力稳定后，换成甲醇3%，水97%，流速为1ml/min，进行平衡，约20min，压力稳定后，再换成甲醇3%，缓冲液97%进行平衡，同时开灯，开始采集基线，待基线趋于直线的时候，平衡结束。

2.样品的检测：按照色谱条件编写淋洗程序以及进样序列，将过膜处理后的标准品以及样品按照进样序列放置在自动进样器的相应位置上，开始进样并收集图谱信息。

使用以下公式计算脱色后酶解液中核苷酸的损失率：

损失率(%)=(C_前-C_后)/C_前*100%

其中C_前、C_后分别为酶解液中四种核苷酸在脱色前和脱色后的浓度。

本发明中所述的BV/h为每小时流过树脂柱床层体积(Bed Volume)的溶液量，BV为树脂柱内的床层体积。

本发明的有益效果：

1.将超高交联度树脂SX-01应用于核苷酸酶解液脱色，该树脂价格低廉，对酶解液中的色素吸附量大，脱色率较高（达到80%以上），酶解液处理量较大（达到11BV），可大大改善酶解液的外观色泽，脱色过程中不会引入新的杂质，而且四种单核苷酸的损失率较低（低于2%），大大降低核苷酸后分离、结晶的难度；

2.吸附色素后的树脂SX-01洗脱再生较容易，再生较完全，再生剂消耗量较小（再生剂消耗量为5BV），树脂使用周期较长。

3.本发明中的所使用的超高交联树脂SX-01不仅可以用于核苷酸酶解液的脱色过程，还可以应用于各种有机酸发酵液、氨基酸发酵液等的脱色过程。

附图说明

图1为本发明超高交联树脂SX-01的红外光谱图；

图2为本发明超高交联树脂SX-01的扫描电镜图（SEM图）；

图3为本发明超高交联树脂SX-01的BET图；

图4为本发明超高交联树脂SX-01的孔径分布图；

图5为本发明实施5中树脂柱再生时不同洗脱剂的消耗量。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：核苷酸酶解液的制备。

RNA的酶解工艺，采用核酸酶p1作用于RNA溶液得到4种5’-单核苷酸，即为5’-腺苷酸(AMP)、5’-胞苷酸(CMP)、5’-鸟苷酸(GMP)和5’-尿苷酸(UMP)。具体步骤如下：

(1)配制pH=5.5的6%RNA溶液600ml：先用1mol/L的NaOH溶液将pH调至13左右，然后加入RNA粉末（36g）进行溶解，再用1mol/L的NaOH溶液调pH至5.5，置于70℃水浴锅中预热至70℃。

(2)向RNA溶液中加入70℃预热半小时的酶液50ml，摇匀，在70℃条件下酶解3h50min。

(3)再加入0.2%（1.2g）活性炭，继续酶解50min。

(4)冷却至45℃，在4000rpm条件下离心10min，抽滤，即得到RNA酶解液，酶解后酶解液的pH降为4.5。

实施例2:超高交联树脂SX-01的获得。

在洁净、干燥的2000mL三口烧瓶中，加入200g干燥的氯甲基化聚苯乙烯树脂（氯球），加入1200g邻硝基乙苯，搅拌混匀，室温下充分溶胀2h以上，溶胀后搅拌加入4倍氯球重量的甲胺，再加入催化剂无水三氯化铁20g，在搅拌下程序升温至135～150℃，再此温度下进行Friedel-Crafts后交联反应一定时间，控制残余氯含量在1～3%，停止反应，冷却后吸出母液，用工业酒精反复抽提树脂至提取流出液无色清亮为止，在依次用4%盐酸和蒸馏水洗涤树脂至中性，烘干备用。

所得产物为棕色圆颗粒形状，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m²/g，平均孔容为0.54～0.82cm³/g。通过图1的红外光谱图推导出树脂的化学结构式，通过图2和图3计算树脂比表面积，通过图4得到树脂的孔径及最可几孔径。

实施例3：超高交联树脂SX-01的预处理。

用2BV的乙醇以2BV/h的流速冲洗树脂→用去离子水冲去乙醇→2BV0.1mol/L的HCl溶液以1BV/h的流速冲洗树脂→水洗至中性→用2BV0.1mol/L的NaOH溶液以1BV/h的流速冲洗树脂→水洗至中性→用2BV0.1mol/L的HCl溶液以1BV/h的流速冲洗树脂→水洗至中性。

实施例4：固定床树脂柱脱色。

将酶解液流经树脂柱进行色素吸附，树脂柱的高径比为10，酶解液的pH为4.5，酶解液流速为1BV/h，树脂柱柱温分别控制为30℃、40℃、50℃，当柱出口处的OD₄₂₀接近原料液的OD₄₂₀时结束上柱，计算上柱脱色率、四种单核苷酸损失率和酶解液处理量，各温度条件下的脱色率、核苷酸损失率和酶解液处理量如表1，温度对脱色率、核苷酸损失率以及酶解液处理量影响不大，但是30℃时，酶解液成胶状，在上柱脱色的过程中会出现赌柱子的现象，而50℃时消耗能量多，因此选择40℃作为最佳上柱脱色温度。

表1

实施例5：固定床树脂柱脱色。

将酶解液流经树脂柱进行色素吸附，树脂柱的高径比为10，酶解液的pH为4.5，树脂柱柱温控制为40℃，酶解液流速分别为1BV/h、2BV/h、3BV/h，当柱出口处的OD₄₂₀接近原料液的OD₄₂₀时结束上柱，计算上柱脱色率、四种单核苷酸损失率和酶解液处理量，不同流速条件下酶解液的处理量如表2。从表中可以看出三种流速下核苷酸损失率都很低，当流速为1BV/h时，脱色率较高且处理量最大，分别为84.8%和11.6倍床层体积。

表2

实施例6：固定床树脂柱再生。

将再生剂流经吸附色素后的树脂柱进行树脂的再生，再生剂流速为1BV/h，所用的再生剂种类分别为以下一种：

1 1mol/L NaOH溶液；

2 10wt%NaCl+0.7wt%NaOH的水溶液；

3 20wt%NaCl+0.7wt%NaOH的水溶液；

4 10wt%NaCl+0.5mol/LNaOH的水溶液；

5 10(v/v)%乙醇+1mol/LNaOH的水溶液；

6 25(v/v)%乙醇+1mol/LNaOH的水溶液；

7 50(v/v)%乙醇+1mol/LNaOH的水溶液；

8 先用3BV1mol/LNaOH溶液进行洗脱，然后再用无水乙醇进行洗脱。

直到柱出口液滴接近无色时结束洗脱，计算洗脱剂消耗量，各种洗脱剂的消耗量如图5。其中第8种洗脱剂，即先用3BV1mol/LNaOH溶液进行洗脱，然后再用无水乙醇进行洗脱洗脱剂消耗量较低，大约为5BV。

Claims

1.一种对核苷酸酶解液进行脱色的方法，其特征在于，将核苷酸酶解液通过超高交联树脂SX-01进行色素吸附，吸附饱和后，超高交联树脂SX-01利用再生剂进行树脂再生；

其中，所述的超高交联树脂SX-01具有如下结构单元：

该树脂的骨架为聚苯乙烯，平均粒径为0.3～1mm，含水量为32%～49%，孔径为1.5～4nm，最可几孔径为1.8nm，平均比表面积为950～1800m²/g，平均孔容为0.54～0.82cm³/g。

2.根据权利要求1所述的对核苷酸酶解液进行脱色的方法，其特征在于，所述的核苷酸酶解液是用核酸酶p1酶解RNA粉末得到。

3.根据权利要求1所述的对核苷酸酶解液进行脱色的方法，其特征在于，色素吸附方式为固定床吸附，树脂柱高径比为8～12，酶解液的pH为4.5，吸附流速为1～3BV/h，柱温控制为30～50℃。

4.根据权利要求1所述的对核苷酸酶解液进行脱色的方法，其特征在于，所述的再生剂为1mol/L NaOH与无水乙醇。

5.根据权利要求1或4所述的对核苷酸酶解液进行脱色的方法，其特征在于，再生过程为先用3BV1mol/L NaOH进行再生，然后用无水乙醇进行再生直至流出液接近无色时用去离子水洗去树脂中的乙醇，NaOH和乙醇的流速均为1BV/h。