CN109837320A - 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素b12的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法。本发明的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，通过经大量实验优化的母瓶培养基、摇瓶培养基和补料培养基，在最优发酵条件下培养维生素B12的生产菌株；发酵过程前期的0‑39h内控制温度在一个相对较低的水平，即26‑30℃，从而控制菌种处于合适的生长速率和保持良好的菌形；在发酵过程中后期提高并维持发酵体系温度在一个的相对较高的水平，即30‑34℃，以促进菌体生长、维生素B12合成的启动和积累，进而使发酵结束后，维生素B12发酵单位高达198mg/L，不仅提高了维生素B12的产量和生产效率，而且节约能耗、降低成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法。
背景技术
维生素B12（Vitamin B12）又称钴胺素，是一类含有钴的咕啉类化合物总称，最早作为“抗恶性贫血因子”于1926年被发现。维生素B12是一种重要的生物活性物质，同时也是许多微生物和动物的生长因子，广泛应用于医药、食品和畜牧业。由于维生素B12的分子结构极为复杂，其全化学合成需要多达70余个的反应步骤，且成本昂贵，故目前几乎都是通过微生物发酵的方式来生产维生素B12。自然界中，维生素B12的生物合成存在两种不同的途径，即好氧途径和厌氧途径，但是VB12的生物合成严格局限于一些微生物中，目前成功应用于工业化发酵的生产菌株主要有费氏丙酸杆菌（Propiomibacterium freudenreichii）、谢氏丙酸杆菌（Propiomibacterium shermanii）和脱氮假单胞杆菌（Pseudomonasdenitrificans）。其中，因脱氮假单胞杆菌好氧合成维生素B12的途径清晰明了且维生素B12产率高，因而，目前工业生产几乎都是使用脱氮假单胞杆菌来作为生产维生素B12的工业菌株。
脱氮假单胞杆菌好氧发酵生产维生素B12的过程控制条件比较严格，一旦控制不好就会导致菌体发虚早衰进而影响维生素B12的产量。因此，发酵过程中维持脱氮假单胞杆菌的菌体形态至关重要。除了发酵培养基、pH和转速等能够影响菌体形态之外，温度也是影响菌种菌形的关键因素。对同一微生物来说，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，菌体生长量最高时的培养温度不等于发酵速率最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度。因此，对微生物发酵过程中调整温度以达到发酵前期利于菌体生长，中后期利于次级代谢产物积累的目的，进而促进维生素B12产量。
由于维生素B12应用领域越来越广，目前，维生素B12需求量较大，因此本领域迫切需要开发高效的生产维生素B12的方法，不仅要提高维生素B12的产量，而且尽可能的节约能耗、降低成本，提高生产效率，以满足市场的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，提高维生素B12的产量，节约能耗、降低成本，提高生产效率。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、母瓶培养过程控制：将活化的脱氮假单胞杆菌二代斜面刮取适量菌体接种于母瓶培养基中，温度控制在27 - 29℃，湿度控制在30 - 60%，培养时间为18 - 24h小时；
S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-39h）摇床温度控制在26-30℃；发酵中后期（39-170h）摇床温度控制在30-34℃，湿度控制在30 - 60%；培养时间为170h；
S3、补料控制：步骤S2的发酵过程中，分别于第3d、4d、5d时检测总糖含量，当总糖含量低于5%进行补料，维持发酵液总糖含量控制在5-7%，至发酵结束，从发酵液中分离纯化出维生素B12。
优选的，所述步骤S1中母瓶培养基的配制步骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）110g、磷酸氢二钾0.60g，硫酸铵0.81g、硫酸镁1.65g、硫酸锰0.15g、硫酸锌0.02g、氯化钴0.02g、前体0.012g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调节pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装60mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成母瓶培养基。
优选的，所述步骤S2中摇瓶培养基的配制步骤骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）170g、蔗糖15g、氯化胆碱10.30g、硫酸铵2.60g、硫酸镁1.65g、硫酸锌0.08g、氯化钴0.14g、前体0.01g、甘油1.55g、甘油磷酸7g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装37mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成摇瓶培养基。
优选的，所述步骤S3中补料培养基的配制步骤包括：分别称取蔗糖 300g，DMBI0.20g，CoCl2·6H2O 0.23g，溶解并定容至1000mL，调节pH至6.80-7.40，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成补料培养基。
优选的，所述步骤S2中符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基的特征为：无杂菌，OD 值为0.207-0.220。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，通过经大量实验优化的母瓶培养基、摇瓶培养基和补料培养基，在最优发酵条件下培养维生素B12的生产菌株；发酵过程前期的0-39h内控制温度在一个相对较低的水平，即26-30℃，从而控制菌种处于合适的生长速率和保持良好的菌形；在发酵过程中后期提高并维持发酵体系温度在一个的相对较高的水平，即30-34℃，以促进菌体生长、维生素B12合成的启动和积累，进而使发酵结束后，维生素B12发酵单位高达198mg/L，不仅提高了维生素B12的产量和生产效率，而且节约能耗、降低成本。
具体实施方式
实施例1 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法
一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法包括如下步骤：
S1、母瓶培养过程控制：将活化的脱氮假单胞杆菌二代斜面刮取适量菌体接种于母瓶培养基中，温度控制在27℃，湿度控制在30-35%，培养时间为18h小时；此时母瓶培养基OD ：0.220；pH：7.34；
S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基（无杂菌，OD 值为0.220）在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-35h）摇床温度控制在27±0.5℃；发酵中后期（35-167h）摇床温度控制在33±0.5℃，湿度控制在30-35%；培养时间为167h；
S3、补料控制：步骤S2的发酵过程中，分别于第3d、4d、5d时检测总糖含量，当总糖含量低于5%进行补料，维持发酵液总糖含量控制在5-7%，至发酵结束，从发酵液中分离纯化出维生素B12。
本实施例中，所述步骤S1中母瓶培养基的配制步骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）110g、磷酸氢二钾0.60g，硫酸铵0.81g、硫酸镁1.65g、硫酸锰0.15g、硫酸锌0.02g、氯化钴0.02g、前体0.012g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调节pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装60mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成母瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S2中摇瓶培养基的配制步骤骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）170g、蔗糖15g、氯化胆碱10.30g、硫酸铵2.60g、硫酸镁1.65g、硫酸锌0.08g、氯化钴0.14g、前体0.01g、甘油1.55g、甘油磷酸7g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装37mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成摇瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S3中补料培养基的配制步骤包括：分别称取蔗糖 300g，DMBI 0.20g，CoCl2·6H2O 0.23g，溶解并定容至1000mL，调节pH至6.80-7.40，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成补料培养基。
经检测，发酵结束，维生素B12发酵单位为189mg/L。
实施例2 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法
一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法包括如下步骤：
S1、母瓶培养过程控制：将活化的脱氮假单胞杆菌二代斜面刮取适量菌体接种于母瓶培养基中，温度控制在29℃，湿度控制在50-60%，培养时间为24h小时；此时母瓶培养基OD ：0.212；pH：7.42；
S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基（无杂菌，OD 值为0.212）在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-38h）摇床温度控制在29±0.5℃；发酵中后期（38-169h）摇床温度控制在32±0.5℃，湿度控制在50-60%；培养时间为169h；
S3、补料控制：步骤S2的发酵过程中，分别于第3d、4d、5d时检测总糖含量，当总糖含量低于5%进行补料，维持发酵液总糖含量控制在5-7%，至发酵结束，从发酵液中分离纯化出维生素B12。
本实施例中，所述步骤S1中母瓶培养基的配制步骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）110g、磷酸氢二钾0.60g，硫酸铵0.81g、硫酸镁1.65g、硫酸锰0.15g、硫酸锌0.02g、氯化钴0.02g、前体0.012g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调节pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装60mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成母瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S2中摇瓶培养基的配制步骤骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）170g、蔗糖15g、氯化胆碱10.30g、硫酸铵2.60g、硫酸镁1.65g、硫酸锌0.08g、氯化钴0.14g、前体0.01g、甘油1.55g、甘油磷酸7g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装37mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成摇瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S3中补料培养基的配制步骤包括：分别称取蔗糖 300g，DMBI 0.20g，CoCl2·6H2O 0.23g，溶解并定容至1000mL，调节pH至6.80-7.40，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成补料培养基。
经检测，发酵结束，维生素B12发酵单位为195 mg/L。
实施例3 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法
一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法包括如下步骤：
S1、母瓶培养过程控制：将活化的脱氮假单胞杆菌二代斜面刮取适量菌体接种于母瓶培养基中，温度控制在28℃，湿度控制在10-50%，培养时间为22h小时；此时母瓶培养基OD ：0.207；pH：7.39；
S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基（无杂菌，OD 值为0.207）在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-39h）摇床温度控制在28±0.5℃；发酵中后期（39-170h）摇床温度控制在32±0.5℃，湿度控制在40-50%；培养时间为170h；
S3、补料控制：步骤S2的发酵过程中，分别于第3d、4d、5d时检测总糖含量，当总糖含量低于5%进行补料，维持发酵液总糖含量控制在5-7%，至发酵结束，从发酵液中分离纯化出维生素B12。
本实施例中，所述步骤S1中母瓶培养基的配制步骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）110g、磷酸氢二钾0.60g，硫酸铵0.81g、硫酸镁1.65g、硫酸锰0.15g、硫酸锌0.02g、氯化钴0.02g、前体0.012g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调节pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装60mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成母瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S2中摇瓶培养基的配制步骤骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）170g、蔗糖15g、氯化胆碱10.30g、硫酸铵2.60g、硫酸镁1.65g、硫酸锌0.08g、氯化钴0.14g、前体0.01g、甘油1.55g、甘油磷酸7g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装37mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成摇瓶培养基。
本实施例中，所述步骤S3中补料培养基的配制步骤包括：分别称取蔗糖 300g，DMBI 0.20g，CoCl2·6H2O 0.23g，溶解并定容至1000mL，调节pH至6.80-7.40，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成补料培养基。
经检测，发酵结束，维生素B12发酵单位为199mg/L。
对比例1 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法
对比例1与实施例3基本相同，其区别在于：S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，摇床温度控制在32±0.5℃；湿度控制在40-50%；培养时间约为170h。
对比例1与实施例3相比，摇瓶培养过程温度在32±0.5℃，在发酵过程前期未控制温度在一个相对较低的水平，经检测，发酵结束，维生素B12发酵单位为162mg/L。
对比例2 一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法
对比例2与实施例3基本相同，其区别在于S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基（无杂菌，OD 值为0.207）在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-39h）摇床温度控制在25±0.5℃；发酵中后期（39-170h）摇床温度控制在32±0.5℃，湿度控制在40-50%；培养时间为170h。
对比例1与实施例3相比，发酵前期（0-39h）摇床温度控制在25±0.5℃，经检测，发酵结束，维生素B12发酵单位为153mg/L。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (5)
1.一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、母瓶培养过程控制：将活化的脱氮假单胞杆菌二代斜面刮取适量菌体接种于母瓶培养基中，温度控制在27 - 29℃，湿度控制在30 - 60%，培养时间为18 - 24h小时；
S2、摇瓶培养过程控制：将符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基在无菌条件下接入摇瓶培养基，接种量为10%，发酵前期（0-39h）摇床温度控制在26-30℃；发酵中后期（39-170h）摇床温度控制在30-34℃，湿度控制在30 - 60%；培养时间为170h；
S3、补料控制：步骤S2的发酵过程中，分别于第3d、4d、5d时检测总糖含量，当总糖含量低于5%进行补料，维持发酵液总糖含量控制在5-7%，至发酵结束，从发酵液中分离纯化出维生素B12。
2.如权利要求1所述的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：所述步骤S1中母瓶培养基的配制步骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）110g、磷酸氢二钾0.60g，硫酸铵0.81g、硫酸镁1.65g、硫酸锰0.15g、硫酸锌0.02g、氯化钴0.02g、前体0.012g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调节pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装60mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成母瓶培养基。
3.如权利要求1所述的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：所述步骤S2中摇瓶培养基的配制步骤骤包括：分别称取甜菜糖蜜（50％）170g、蔗糖15g、氯化胆碱10.30g、硫酸铵2.60g、硫酸镁1.65g、硫酸锌0.08g、氯化钴0.14g、前体0.01g、甘油1.55g、甘油磷酸7g，溶解并定容至1000mL，用20％ NaOH溶液调pH，消前6.80-7.40，每个300mL三角瓶分装37mL，包扎，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成摇瓶培养基。
4.如权利要求1所述的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：所述步骤S3中补料培养基的配制步骤包括：分别称取蔗糖 300g，DMBI 0.20g，CoCl2·6H2O0.23g，溶解并定容至1000mL，调节pH至6.80-7.40，经灭菌（0.11-0.12MPa，121℃，30min）后制成补料培养基。
5.如权利要求1所述的一种提高脱氮假单胞杆菌产维生素B12的方法，其特征在于：所述步骤S2中符合标准的脱氮假单胞杆菌母瓶培养基的特征为：无杂菌，OD 值为0.207-0.220。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190604 |
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