CN103235116B - 一种抗体标记信号或核酸探针标记信号放大的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体标记信号或核酸探针标记信号放大的方法，本发明主要方案是将革兰氏阴性细菌的脂多糖与抗体交联，或是将真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖与抗体或核酸探针交联，然后采用鲎试剂与抗体交联的革兰氏阴性细菌脂多糖或真菌细胞壁（1,3）-β-D-葡聚糖发生特异性反应，提高抗体或核酸探针检测的灵敏度。本发明的信号放大***，可检测到低于pg级含量的目标底物。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体标记信号或核酸探针标记信号放大的方法，即将与鲎试剂发生特异性反应的革兰氏阴性细菌的脂多糖（LPS）或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖标记抗体或核酸，用于免疫分析过程的信号放大，属于免疫分析技术领域。
背景技术
抗体放大***是将具有高灵敏度、可检测的能发生特异性反应的物质标记到抗体或抗原分子上，通过标记物的反应，显示检测物质的含量，同时通过信号的增强，放大检测的信号，提高待检测物质的检测灵敏度。
目前的标记物包括荧光素、酶（发色性底物显色或化学发光等）和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。除此之外，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。目前采用放射性核素标记的检测灵敏度最高，可达pg级，其他方法灵敏度比放射性核素标记低1到3个数量级。本发明采用一种新型的标记物，可与鲎试剂特异性反应的分子，将检测灵敏度提高到放射性核素标记的水平。鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素（以下简称LPS）和（1,3）-β-D-葡聚糖（以下简称葡聚糖）。目前主要的检测细菌内毒素和（1,3）-β-D-葡聚糖的方法有凝胶法、浊度法和比色法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测灵敏度达到放射性核素标记水平的免疫检测方法，本发明提供一种革兰氏阴性细菌的脂多糖或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖标记抗体信号放大方法或核酸探针信号放大方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
1、本发明首先提供了一种抗体标记信号放大的方法，其中用于标记抗体的标记物为能与鲎试剂发生特异性反应的革兰氏阴性细菌的脂多糖或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖。
所述信号放大的检测是采用细菌细胞壁脂多糖通过化学键与抗体进行联接来作为抗体检测过程的检测放大信号。
所述信号放大的检测方法是采用真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖通过化学键与抗体进行联接来作为抗体检测过程的检测放大信号。
所述检测放大信号，是指细菌细胞壁脂多糖与鲎试剂发生的特异性凝固反应或特异性颜色反应。
所述检测放大信号，是指真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖与鲎试剂发生的特异性凝固反应或特异性颜色反应。
2、本发明另外还提供了一种核酸探针标记信号放大的方法，其中用于核酸标记的标记物为能与鲎试剂发生特异性反应的革兰氏阴性细菌的脂多糖或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖。
所述信号放大的检测方法是采用细菌细胞壁脂多糖通过化学键与寡核苷酸进行联接来作为核酸互补杂交检测过程的检测放大信号。
所述信号放大的检测方法是采用真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖通过化学键与寡核苷酸进行联接，作为核酸互补杂交检测过程的检测放大信号。
所述检测放大信号是指细菌细胞壁脂多糖与鲎试剂发生的特异性凝固反应或特异性颜色反应。
所述检测放大信号是指真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖与鲎试剂发生的特异性凝固反应或特异性颜色反应。
本发明中各溶液具体的配置方法如下：
LPS溶液的制备：称取脂多糖（LPS）0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应60-120分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，12000rpm/min离心10分钟，弃上清液，沉淀用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，后加入1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液溶解，制备LPS溶液。
葡聚糖溶液的制备：称取葡聚糖 0.01g，加入1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液，充分后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应60-120分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，12000rpm/min离心10分钟，弃上清液，沉淀用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，后加入1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液，充分溶解，即可制得葡聚糖溶液。
抗体溶液的制备：取待标记抗体0.01g，用0.5 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液充分溶解，即可制得抗体溶液。
寡聚核酸溶液的制备：取待标记寡聚核酸1 OD，用0.1mL 0.1mol/L的NaCO3溶液溶解，即 得寡聚核酸溶液。
LPS-抗体交联物的制备：将LPS溶液与抗体溶液按1比1体积比例混合，在37℃摇床上，100-200rpm/min下避光反应30-60分钟，制备LPS-抗体交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应15-30分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
LPS-寡聚核酸交联物的制备：将LPS溶液与寡聚核酸溶液1比0.2体积比例混合，在37℃摇床上，100-200rpm/min下避光反应30-60分钟，制备LPS-寡聚核酸交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应15-30分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
葡聚糖-抗体交联物的制备：将葡聚糖溶液与抗体溶液按1比1体积比例混合，在37℃摇床上，100-200rpm/min下避光反应30-60分钟，制备葡聚糖-抗体交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应15-30分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
葡聚糖-寡聚核酸交联物的制备：将葡聚糖溶液与寡聚核酸溶液按1比0.2体积比例混合，在37°C摇床上，100-200rpm/min下避光反应30-60分钟，制备葡聚糖-寡聚核酸交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应15-30分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
本发明的显著优点：
该发明可实现检测目标产物的超微量分析技术，具有灵敏度高和特异性强的突出优点。可达到pg级别的物质分析，达到了现在最灵敏的放射性标记的检测水平。但与放射性标记技术相比，该技术生成的标记物稳定性好、无放射性污染等优点，具有其他标记方法无法比拟的优势。
本发明涉及的交联方法是将抗体和多糖共价结合在一起的方法，通过NaIO4将糖分子上的羟基氧化成醛基，然后利用醛基与抗体或核酸的羟基的氨基在碱性条件下发生交联反应。交联物上的LPS或葡聚糖，通过与鲎试剂发生反应，起到信号放大的作用。该方法在制备物稀释100倍的条件下，可检测到pg级别的目标产物。本发明的抗体与多糖的交联并不仅仅限制在上述所述的交联方法，其他采用小分子介导的抗体链接多糖或其他的连接方法，都能制备出相当效果的产品。
附图说明
图1为实施1和实施例2中的样品分布图，其中A1、A2、A3孔为0.01pg/mL阳性标准样品， A4、A5、A6孔为0.1pg/mL阳性标准样品，A7、A8、A9孔为1pg/mL阳性标准样品，A10、A11、A12孔为5pg/mL阳性标准样品；B1、B2、B3、B4、B5、B6孔为1μg/mL 的牛血清白蛋白阴性样品；C1、C2、C3孔为待测样品1； C4、C5、C6孔为待测样品2；C7、C8、C9孔为待测样品3；C10、C11、C12孔为待测样品4；D1、D2、D3孔为待测样品5； D4、D5、D6孔为待测样品6；D7、D8、D9孔为待测样品7；D10、D11、D12孔为待测样品8；E1、E2、E3孔为待测样品9； E4、E5、E6孔为待测样品10。
具体实施方式
下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是并不能以此限制本发明的范围。下述实施例1和实施例2的加样分布图见图1。
实施例1
人血清中癌胚抗原的测定（取某医院体检中心的10人份血样品）
LPS溶液的制备： 称取LPS 0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应120分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，12000rpm/min离心10分钟，弃上清液后沉淀用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，然后用1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备LPS溶液。
抗体溶液的制备：取待标记兔抗鼠抗体0.01g，用0.5 mL0.1mol/L的NaCO3溶液溶解，制备抗体溶液。
LPS-抗体交联物的制备：将LPS溶液与抗体溶液按1比1体积比例混合，在37℃摇床上，100rpm/min下避光反应60分钟，制备LPS-抗体交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应30分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，无菌水定容至10 mL，4℃冰箱保存待用（下面所用的LPS标记抗体均为此处制备的交联物稀释物）。
样品检测方法：
1）包被：
阳性样品包被：用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）溶解甲胎蛋白粉末，分别配置0.01pg/mL、0.1pg/mL、1pg/mL、5pg/mL的癌胚抗原蛋白溶液。将配置好的溶液，每孔加入100微升，每种浓度重复三孔（分别置于3个孔，最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（pH7.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液）洗涤3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
样品孔包被：用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）稀释血样，将取样血液稀释至总蛋白质含量为10μg/ml。将稀释好的血样，每孔加入100微升，每人份重复三孔（分别置于3个孔，最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤。
阴性孔包被：用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）溶解牛血清白蛋白粉末，配置浓度为1μg/mL 的牛血清白蛋白溶液，将配置好的溶液，每孔加入100微升，重复6孔（最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤。
2）加第一抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的鼠源的抗癌胚抗原的第一抗体（稀释100倍）0.1ml（福州迈新生物技术开发有限公司购买，抗CEA浓缩型抗体）。37℃孵育1小时，洗涤。 3） 加LPS标记抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的上述制备的稀释100倍LPS标记抗体0.1ml。37℃孵育1小时，洗涤。 4）结果判定方法1：将鲎试剂（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司）0.1mL加入各反应孔中，反应60分钟。将聚苯乙烯板翻转180度，若有液体流下为阴性，若呈冻状为阳性。结果表明，0.1 pg/mL和1pg/mL阳性样品孔呈现阳性反应，表明该检测方法可以精确到0.1pg/mL。10份血液样品中，2份样品孔中成冻状，这表明这两孔中的癌胚抗原浓度呈阳性反应，最低浓度为0.1pg/mL。
结果判定方法2：将鲎试剂0.1mL和显色试剂（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司）加入孔中，反应60分钟。采用动态显色法检测（分光光度计检测）。检测以阳性孔的浓度为参照制备的标准曲线为标准（y=0.1103×吸光值-0.0266，式中y值为样品浓度值，单位为pg/mL），血液检测阳性结果（大于0.01pg/mL）有4孔，癌胚抗原的含量分别为0.07 pg/mL、0.92 pg/mL和10.3 pg/mL。
实施例2
人血清中癌胚抗原的测定（取某医院体检中心的10人份血样品）
（1,3）-β-D-葡聚糖（本实施例简写为；葡聚糖）溶液的制备：称取葡聚糖 0.01g，于1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应60分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，再用12000rcf离心10分钟，弃上清液后沉淀用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，然后用1 mL0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备葡聚糖溶液。
抗体溶液的制备：取待标记兔抗鼠抗抗体0.01g，用0.5 mL0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备抗体溶液。
葡聚糖-抗体交联物的制备：将葡聚糖溶液与抗体溶液按1比1体积比例混合，在37℃摇床上， 200rpm/min下避光反应30分钟，制备葡聚糖-抗体交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应15分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，无菌水定容至10 mL，4℃冰箱保存待用（下面所用的葡聚糖标记抗体均为此处制备的交联物稀释物）。
样品检测方法为：
阳性样品包被：用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）溶解甲胎蛋白粉末，分别配置0.01pg/mL、0.1pg/mL、1pg/mL、5pg/mL的癌胚抗原蛋白溶液。将配置好的溶液，每孔加入100微升，每种浓度重复三孔（分别置于3个孔，最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液（pH7.0的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液）洗涤3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
样品孔包被：用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）稀释血样，将取样血液稀释至总蛋白质含量为10μg/ml。将稀释好的血样，每孔加入100微升，每人份重复三孔（分别置于3个孔，最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤。
阴性孔包被：用用0.05mol/L pH9.0碳酸钠包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠溶液，用盐酸和氢氧化钠调节pH至9.0）溶解牛血清白蛋白粉末，配置浓度为1μg/mL 的牛血清白蛋白溶液，将配置好的溶液，每孔加入100微升，重复6孔（最后取平均值），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤。
2）加第一抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的鼠源的抗癌胚抗原的第一抗体（稀释100倍）0.1ml（福州迈新生物技术开发有限公司购买，抗CEA浓缩型抗体）。37℃孵育0.5小时，洗涤。 3） 加葡聚糖标记抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的上述制备的稀释100倍葡聚糖标记抗体0.1ml。37℃孵育0.5小时，洗涤。 4）结果判定方法1：将鲎试剂（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司）0.1mL加入孔中，反应30分钟。将聚苯乙烯板翻转180度，若有液体流下为阴性，若呈冻状为阳性。结果表明，0.1 pg/mL和1pg/mL阳性样品孔呈现阳性反应，表明该检测方法可以精确到0.1pg/mL。10份血液样品中，2份样品孔中成冻状，这表明这两孔中的癌胚抗原浓度呈阳性反应，最低浓度为0.1pg/mL。
结果判定方法2：将鲎试剂0.1mL和显色试剂（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司）加入孔中，反应30分钟。采用动态显色法检测（分光光度计检测）。检测以阳性孔的浓度为参照制备的标准曲线为标准（y=0.2111×吸光值-0.2023，式中y值为样品浓度值，单位为pg/mL），血液检测0.1 pg/mL以上浓度呈现阳性结果，与实施例1同样的样品中，（大于0.1pg/mL）有两孔，癌胚抗原的含量分别为1.12pg/mL和11.2 pg/mL。
实施例3
母体外周血中胎儿DNA的检测（取某医院健康孕妇血样，共3人份）：
微孔板为丹麦Nunc 公司产品，探针由美国ABI 公司合成，探针序列：5′A TTC TT C GGC AGC ATC TCT GC 3′(3′羟基化) 。
LPS溶液 的制备：称取LPS 0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应60分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，再用12000rpm/min离心10分钟，弃上清液后沉淀用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，然后用1 mL0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备LPS溶液。
探针溶液的制备：取待标记探针DNA一管（1 OD），用0.1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备探针溶液。
LPS-探针交联物的制备：将LPS溶液与探针溶液按1比0.2体积比例混合，在37℃摇床上，150rpm/min下避光反应45分钟，制备LPS-探针交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应20分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mM pH7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存待用。
母体外周血血浆DNA 制备按提取试剂盒说明书进行（天根生化科技（北京）有限公司，血液基因组提取试剂盒(DP332)）。
探针板包被：将探针95℃变性10 min，并配包板液（Thermo Scientific 公司，Pierce DNA包被溶液）；将LPS 探针与包板液混合后加入微孔板（100微升），50℃孵育5h；洗板3 次, 静置5 min 后再洗3 次；自然干燥3 h，备用。
探针微孔板杂交程序：（下述阳性孔分别为10copy、30copy、60copy、90copy、120copy、2000copy，每个样品3孔，共18孔，阴性孔6孔。）
1×SSCT（0.015mol/L的柠檬酸三钠溶液加终浓度为0.1%Tween-20）洗板3 次，阳性孔分别每孔加入与探针特异性反应的DNA（1×SSCT溶解）（浓度为1μg/ml，总量100微升）；阴性孔为万分之一的小牛胸腺DNA（1×SSCT溶解）（浓度为1μg/ml，总量100微升）；样品待测孔每孔加1× SSCT 90 微升和待测总DNA浓度为1μg/ml提取物10微升， 48℃孵育1 h（每份样品分别置于3个孔，最后取平均值）；洗板3 次，加鲎试剂和显色液100微升（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司），显色60分钟，用酶标仪在450 nm 波长处测定结果。检测OD值大于阴性孔10倍以上为阳性孔。经过与阳性孔（以阳性孔的浓度为参照制备的标准曲线y=1.137×吸光值-8.166，式中y值为样品浓度值，单位为copy/mL））对比，所取的三人份孕妇血中的胎儿DNA分别为每mL 含92copy、132copy和87copy的胎儿DNA。
实施例4
母体外周血中胎儿DNA的检测（取某医院健康孕妇血样，共3人份）：
微孔板为丹麦Nunc 公司产品。探针由美国ABI 公司合成。探针序列：5′A TTC TT C GGC AGC ATC TCT GC 3′(3′羟基化) 。
（1,3）-β-D-葡聚糖（本实施例简写为；葡聚糖）溶液的制备：称取葡聚糖 0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L的NaIO4溶液，55℃水浴反应60-120分钟后，加入40微升异丙醇，放入4℃冰箱30分钟，再用12000rpm/min离心10分钟，取出上清液后用1 mL纯净水洗涤2次，每次5秒钟，然后用1 mL0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备葡聚糖溶液。
探针溶液的制备：取待标记探针DNA一管（1 OD），用0.1 mL0.1mol/L的NaCO3溶液中溶解，制备探针溶液。
葡聚糖-探针交联物的制备：将葡聚糖溶液与探针溶液按1比0.2体积比例混合，在37℃摇床上，150rpm/min下避光反应45分钟，制备葡聚糖-探针交联物。反应完成后，加入0.1 g甘氨酸，封闭反应25分钟。将所有溶液装入截留分子量为1万的透析袋中，用1 L 1 mM pH7.0的磷酸盐缓冲液避光透析过夜。取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存待用。
母体外周血血浆DNA 制备按提取试剂盒说明书进行。
探针板包被：将探针95℃变性10 min，并配包板液（Thermo Scientific 公司，Pierce DNA包被溶液。）；将葡聚糖探针与包板液混合后加入微孔板（100微升），50℃孵育5h；洗板3 次, 静置5 min 后再洗3 次；自然干燥3 h，备用。
探针微孔板杂交程序：（下述阳性孔分别为10copy、30copy、60copy、90copy、120copy、2000copy，每个样品3孔，共18孔，阴性孔6孔。）
1×SSCT（0.015mol/L的柠檬酸三钠溶液加终浓度为0.1%Tween-20）洗板3 次，阳性孔分别每孔加相应的与探针特异性反应的DNA（1×SSCT溶解）（浓度为1μg/ml，总量100微升）；阴性孔为万分之一的小牛胸腺DNA（1×SSCT溶解）（浓度为1μg/ml，总量100微升）；样品待测孔每孔加1× SSCT 90 微升和待测DNA提取物100 微升 48℃孵育1 h；洗板3 次，加鲎试剂和显色液100微升（试剂盒，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司），显色20分钟，用酶标仪在450 nm 波长处测定结果。检测OD值大于阴性孔10倍以上为阳性孔。经过与阳性孔（以阳性孔的浓度为参照制备的标准曲线y=3.156×吸光值-13.778，式中y值为样品浓度值，单位为copy/mL））对比，所取的三人份孕妇血中的胎儿DNA分别为每mL 含97copy、128copy和82copy的胎儿DNA。
Claims (2)
1.一种抗体标记信号放大的方法，其特征在于：所述的抗体标记信号放大方法是采用能与鲎试剂发生特异性反应的革兰氏阴性细菌的脂多糖或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖通过化学键与抗体进行联接，作为抗体检测过程的检测放大信号，具体步骤如下：
（1）脂多糖或（1,3）-β-D-葡聚糖溶液的制备：称取脂多糖或葡聚糖 0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L 的NaIO4 溶液，55℃水浴反应60-120 分钟后，加入40 微升异丙醇，放入4℃冰箱30 分钟，12000rpm/min 离心10 分钟，弃上清液，沉淀用1 mL 纯净水洗涤2 次，每次5 秒钟，后加入1 mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液溶解，制备脂多糖或葡聚糖溶液；
（2）抗体溶液的制备：取待标记抗体0.01g，用0.5 mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液充分溶解，即可制得抗体溶液；
（3）脂多糖或（1,3）-β-D-葡聚糖-抗体交联物的制备：将脂多糖或葡聚糖溶液与抗体溶液按1 比1 体积比例混合，在37℃摇床上，100-200rpm/min 下避光反应30-60 分钟，制备脂多糖或葡聚糖- 抗体交联物；反应完成后，加入0.1 g 甘氨酸，封闭反应15-30 分钟；将所有溶液装入截留分子量为1 万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲液避光透析过夜；取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
2.一种核酸探针标记信号放大的方法，其特征在于：所述的核酸探针标记信号放大的检测方法是采用能与鲎试剂发生特异性反应的革兰氏阴性细菌的脂多糖或真菌细胞壁的真菌（1,3）-β-D-葡聚糖通过化学键与寡核苷酸进行联接，作为核酸互补杂交检测过程的检测放大信号，具体步骤如下：
（1）脂多糖或（1,3）-β-D-葡聚糖溶液的制备：称取脂多糖或葡聚糖 0.01g，溶于1 mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液中溶解，然后加入1 mL 新配置的0.1mol/L 的NaIO4 溶液，55℃水浴反应60-120 分钟后，加入40 微升异丙醇，放入4℃冰箱30 分钟，12000rpm/min 离心10 分钟，弃上清液，沉淀用1 mL 纯净水洗涤2 次，每次5 秒钟，后加入1 mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液溶解，制备脂多糖或葡聚糖溶液；
（2）寡聚核酸溶液的制备：取待标记寡聚核酸1 OD，用0.1mL 0.1mol/L 的Na2CO3 溶液溶解，即得寡聚核酸溶液；
（3）脂多糖或（1,3）-β-D-葡聚糖-寡聚核酸交联物的制备：将脂多糖或葡聚糖溶液与寡聚核酸溶液1 比0.2 体积比例混合，在37℃摇床上，100-200rpm/min 下避光反应30-60 分钟，制备脂多糖或葡聚糖- 寡聚核酸交联物；反应完成后，加入0.1 g 甘氨酸，封闭反应15-30 分钟；将所有溶液装入截留分子量为1 万的透析袋中，用1 L 1 mmol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲液避光透析过夜，取出透析袋中溶液，放入试剂瓶中，4℃冰箱保存。
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