CN103225001A - 一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒。属于生物检测领域，是一种基于SMART测定体系方法的试剂盒，解决了猪圆环病毒2型（PCV2a、2b、2c、2d等）分型检测方法操作程序复杂、需要较高的实验技能、实验周期较长等的技术问题，可为猪圆环病毒2型分型提供一种快速和准确的分子诊断技术产品。本发明能用于猪圆环病毒2型快速分型的***诊断，指导该病预防和治疗，同时可实现该病毒各型序列突变的检测，将有助于猪圆环病毒的分子流行病学调查、肉类食品检疫以及猪场饲料、水质的病毒监测等。

Description

一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

猪圆环病毒（porcine circovirus type2,PCV-2）属于圆环病毒科,直径仅为17nm，无囊膜，二十面体对称，共价闭合环状单股DNA病毒。PCV-2是引起仔猪断奶后多***衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原，该病自1991年在加拿大猪群中首次爆发以后，在全球各国猪群中广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV-2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPs）、猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,App）和猪巴氏杆菌（swine pasteurellosis,Sp）等诸多病原并发或继发感染，增加了其防治难度。除了引起PMWS以外，PCV-2还会导致育肥猪皮炎与肾病综合征（porcine dermatis and nephropathy syndrome,PDNS）、猪呼吸道综合征（porcine respiratorydisease complex,PRDC）、增生性坏死性肺炎（proliferativenecrotising pneumonia,PNP）、新生仔猪的腹泻病等综合征以及猪体内免疫抑制，因而很难进行有效的药物治疗，再加上与之同源性很高且无致病力的PCV-1的存在，无疑为PCV-2感染的准确诊断及有效防控增加了难度。在2000年初，PCV-2已经成世界性流行，给世界各养猪生产大国(North and South America,Europe,and Asia)造成了巨大的经济损失。诸多数据表明，尽管PCV-2在我国各地区猪群中的感染阳性率不尽相同，但其在我国猪群中广泛存在已是不争的事实，已经给猪群的健康构成重大威胁。目前我国猪群中PCV-2呈现多基因型混合感染，不同基因型毒株共存，已报道的包括PCV2A、PCV2B、PCV2D、PCV2C。4株不同基因型毒株，它们的核心区序列未发生改变，突变存在于外表面（Cap蛋白氨基酸），因此不同基因型毒株的抗原性存在一定差异。

猪圆环病毒分为2个血清型，PCV1和PCV2。其中PCV1型不引起临床症状,广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞。PCV2对各种年龄的家猪和野猪均有致病性。与血清型分类相对应,猪圆环病毒基因组也分为2种基因型，即PCV1型基因组和PCV2型基因组。PCV2型基因组全长为1766bp、1767bp或l768bp，通常含有11个ORF，其中ORFl、ORF5、ORF7和ORF10在病毒链上，而ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11在互补链上，这些基因表现为重叠基因，从而充分利用了病毒有限的遗传物质。ORFl和ORF2是2个主要的开放阅读框，分别编码与病毒复制有关的Rep′蛋白和病毒的衣壳蛋白(Cap)。在ORF1和ORF2的中间区域是病毒DNA的复制起始区(Ori)茎环序列，在病毒的蛋白合成、DNA自身复制及子代病毒产生中发挥重要作用。对PCV2的基因组分析发现，所有PCV2分离株的基因组同源性都在90%以上,但与PCVl的核苷酸同源性却只有68%～79%。PCV1和PCV2间与复制相关的DNA复制起始区和复制酶编码基因(rep)序列的同源性分别约为79.5%和82%；但其衣壳蛋白编码基因(cap)存在较大差异，同源性只有约62%。

欧盟猪圆环病毒病委员会提出的将PCV2分为PCV2a、PCV2b、PCV2c三种基因亚型的分类方法被广泛接受，其分型的基本原则是全基因遗传距离大于0.02和ORF2基因遗传距离大于0.035，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型。基因型与致病力的关系目前也成为PCV2研究的热点，Grau-Roma等发现PMWS发生的猪群中分离到的PCV2多属于PCV2b(原文中命名为genotype1)，而从健康猪群和有轻微消瘦症状的猪分离到的PCV2多属于PCV2a(原文中命名为genotype2)，结果提示PCV2存在不同毒力的毒株.且基因分型可能对判断疾病流行状况有很大帮助。而且***进化分析显示，PCV2a型毒株在出现时间上早于PCV2b型的毒株，许多国家也发现随着PMWS的不断暴发，出现了由PCV2a向PCV2b基因型转换的现象。此外有人还发现在同一猪体内分离到多个PCV2分离株,目这些分离株分属不同的基因型，此现象提示基因重组可能在PCV2遗传进化中起到重要作用。按照欧盟猪圆环病毒病委员会的分类方法.我国目前的PCV2分离株多属于PCV2b亚型。

猪PCV-2的检测与诊断是疫病防治的前提，猪PCV-2的分型检测与诊断对后续疫苗的研究、正确使用及治疗等具有指导性意义。但由于PCV-2病原体的加速突变和在猪场中多基因型PCV-2混合感染的特点，传统的医学检测手段（普通PCR、ELISA等）已经无法检测到新型病原体的突变体和分型***检测与诊断，而分子生物学技术和荧光定量检测技术的飞速发展，为新型病原体及其突变体的定性和定量检测提供了可能。

目前实时定量PCR（real time PCR,qPCR)可以实现PCV2快速的测定,已有学术文章和专利报道，PCV2实时定量PCR反应体系常包含四个组分：（1）反应液（master mix),通常有缓冲液，镁离子，酶，和dNTP等;(2)被测的病毒核酸染色体（target DNA),(3)引物（primers),(4)探针（probe),最常用的探针是TaqMan探针。但PCV2实时定量PCR反应体系检测体系中，由于引物的特异性不够，所以需要探针来保证反应特异性。探针通常需荧光标记，即探针寡聚核苷酸（oligo nucleotide)需偶联一个荧光基团（fluorophore)，和一个淬灭基团（quencher)。从合成角度上看，荧光探针合成的难度比引物合成大，所以，探针在市场上的价格常高于引物十倍。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速的猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒。

一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒，包括以下三对引物：

在SMART测定体系中，由于引物的特异性极强，所以无需要探针可以达到反应的高度特异性的要求，SMART检测体系包含具有高荧光强度、高反应特异性EvaGreen和能增强反应特异性的CrystalTaq。我们SMART检测体系包含的PCV2a,PCV2b,PCV2c引物序列中反向引物是三种基因型都共有的，而正向引物可以区分PCV2a,PCV2b,PCV2c。如图1，图2，图3所示，SMART检测体系在三种基因型之间没有交叉反应，而用普通体系（SYBR GreenERSuper Mix,Life Technologies,Carlsbad,California,USA)会存在不同程度的交叉反应。所以，常规体系必须使用价格昂贵的探针来保证反应的特异性。也就是说，SMART***应用更为简单的***达到了复杂***（常规体系）的目的。而且应用探针的常规体系也会有另一个问题：其检测体系（实验试剂盒）需要包括阳性对照的样品，以检验试剂盒的反应液、引物和探针是否有效。在上述三种成分中，任何一种失效就会使反应失效。阳性对照样品通常是人造核酸来模拟实际检测目标。但是这种模拟实际检测目标一旦污染了反应***，就无法区分阳性对照样品和实际样品（由于荧光信号都一样）。如果一定要区分，就需要打开每个反应试剂，做进一步检验，但这一步骤会增加污染的机会。而在我们的SMART检测体系，人造模拟核酸和实际靶标DNA采用同样的引物进行扩增，但长度不一样，所以有同样的PCR放大曲线，但人造模拟核酸在熔解曲线上和实际的靶标DNA不一样。依据这一点，可以准确判定是污染还是真正的阳性信号（图4）。

附图说明

图1为PCV2a SMART PCR反应和SYBR GreenER普通PCR检测比较；

图2为PCV2b SMART PCR反应和SYBR GreenER普通PCR检测比较；

图3为PCV2c SMART PCR反应和SYBR GreenER普通PCR检测比较；

图4为人造模板和实际模板的Tm比较。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，在实时SMART荧光定量定性PCV。

步骤1：在PCR实时反应管a中，加入10μl2X SMART Master Mix(其中包括EvaGreen荧光染料，SMART缓冲***，SMART Taq，dNTP,镁离子），500nM PCV2a正向引物和PCV2a反向引物，和1μl待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20μl。

步骤2：在PCR实时反应管b中，加入10μl2X SMART Master Mix，500nM PCV2b正向引物和PCV2b反向引物，和1μl待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20μl。

步骤3：在PCR实时反应管c中，加入10μl2X SMART Master Mix，500nM PCV2c正向引物和PCV2c反向引物，和1μl待测核酸样品，用纯水把总反应容积加到20μl。

步骤4：把以上三个管子放置在ABI7500（或是ABI7900，或是BioRad,Bioer,Roche,相似功能的仪器）里进行实时PCR放大。反应的温度条件为：

95℃2分钟热启动，

在95℃15s和65℃30s之间循环40次。

在65℃检测荧光。

实施例2，在实时荧光定量PCR法中SMART具有更高特异性

本发明比较了SMART PCR反应和以SYBR GreenER为代表的普通PCR的特异性。结果如图1所示。图1的上幅显示了10μLSMART PCR反应体系中含有250nM，用来检测PCV2a的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2c,或是NTC.图1的下幅显示了10μL的SYBR GreenER为代表的普通反应体系中含有250nM浓度用来检测PCV2a的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2c,或是NTC.

表1

图1明确显示，SMART PCR反应特异性，而且没有发现交叉反应，而SYBR GreenER为代表的普通反应体系和PCV2b模板有交叉反应。这一实例说明了利用SMART PCR反应检测PCV2a的优越性。

实施例3，在实时荧光定量PCR法中SMART具有更高的特异性

本发明人再次比较了SMART PCR反应和以SYBR GreenER为代表的普通PCR的特异性。结果如图2所示。图2的上幅显示了10μL的SMART PCR反应体系中含有250nM浓度，用来检测PCV2b的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2c,或是NTC。图2的下幅显示了10μLSYBR GreenER为代表的普通反应体系中含有250nM，用来检测PCV2b的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2c,或是NTC.

图2明确显示，SMART PCR反应和特异性，并且没有交叉反应，而SYBR GreenER为代表的普通反应体系和PCV2a模板,和PCV2c模板有交叉反应。这一实例再次说明了SMART PCR反应在测定PCV2b上的优越性。

实施例4，在实时荧光定量PCR法中SMART具有更高的特异性

本发明人再次比较了SMART PCR反应和以SYBR GreenER为代表的普通PCR的特异性。结果如图3所示。图3的上幅显示了10μL的SMART PCR反应体系中含有250nm浓度，用来检测PCV2c的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2d,或是NTC。图3的下幅显示了10μL的SYBR GreenER为代表的普通反应体系中含有250nM浓度，用来检测PCV2c的正负引物（表1所示），和分别为一百万个拷贝的PCV2a,或是PCV2b,或是PCV2c,或是NTC.

图3明确显示，SMART PCR反应和特异性，没有交叉反应，而SYBR GreenER为代表的普通反应体系和PCV2b模板,和PCV2c模板有交叉反应。这一实例再次说明了SMARTPCR反应在测定PCV2c上的优越性。

实施例5，在实时荧光定量SMART PCR法可区分实际样品和人造对照序列。

在本发明的SMART测定体系中，人造模拟核酸和实际靶标DNA采用同样的引物，但中间序列不一样（如表2所示，自然发现的序列在两个引物之间是TTGACA，人造模拟模板的中间序列是TGCGCGCA，两个放大产物由于序列不同，熔解的温度会有不同)。PCR放大曲线相同，但人造模拟核酸在熔解曲线上与实际的靶标DNA序列不一样，如表2所示。如图4熔解曲线所示，人造模板和实际模板的Tm不同。虽然本次检测结果显示，人造模板Tm高于实际模板Tm，但在实际应用中，人造模板Tm也可以低于实际模板的Tm。

表2：实际模板序列和人造模板序列

(引物对应的序列下面加杠）

Claims (1)

1.一种猪圆环病毒2型快速分型检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒是基于SMART测定体系方法的试剂盒，包括以下三对引物：

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