CN103060474A

CN103060474A - 猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN103060474A
Application number: CN2013100125591A
Authority: CN
Inventors: 李彬; 何孔旺; 杜露平; 郭容利; 倪艳秀; 温立斌; 俞正玉; 张雪寒; 茅爱华; 吕立新; 胡屹屹; 周俊明; 王小敏; 祝昊丹; 于洋
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明提供了猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒，属于生物技术领域。所述正向引物PEDV-VF（SEQ ID NO.1）5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’和反向引物PEDV-VR（SEQ ID NO.2）：5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。本发明还进一步提供了检测猪流行性腹泻病毒变异株的检测试剂盒。其检测方法以总RNA为模板，利用上述引物进行反转录PCR（RT-PCR）扩增，反应结束后根据扩增片段的位置判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，为猪流行性腹泻病毒变异株的检测提供了保证。

Description

猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒。属于生物检测技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性的传染病，常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感。本病于1971年首先发现于英国，此后，欧洲和亚洲各国也报道了该病的暴发。我国在1973年分离到PEDV（经典毒株）。

2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的元凶（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408）。猪流行性腹泻病毒变异株（Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain. J. Virol, 2012, 86: 13862）与原来毒株PEDV（经典毒株）（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Chinese Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain. J. Virol, 2012, 86: 3408）的基因组同源性在97%左右，变异最大的为S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸发生缺失和***的序列特征（Wentao Li等New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg. Infect. Dis, 2011, 85: 11538）。

此前，我国尚无PEDV变异株（命名为PEDV-V）的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PEDV（经典毒株）和PEDV-V（PEDV变异株），因此不能特异地检测PEDV变异株。现如今，对猪流行性腹泻病毒变异株的检测只能通过基因测序来确定该病毒的感染，操作繁杂、耗时长、成本较高。

因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因发生核苷酸缺失和***的特征，设计并合成了一对检测猪流行性腹泻病毒变异株的引物，采用RT-PCR方法扩增S基因，通过扩增片段的分子量大小，判断是否存在猪流行性腹泻病毒变异株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪流行性腹泻病毒变异株。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对猪流行性腹泻病毒变异株的诊断和监测起到重要作用。

发明内容

技术问题

本发明目的在于提供用于PEDV变异株RT-PCR检测的引物序列及其检测试剂盒。

技术方案

本发明通过分析PEDV变异株的S基因序列，在S基因发生核苷酸***和缺失的序列处设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。

具体地，本发明提供了一种PEDV变异株检测用引物，该引物的正向引物（PEDV-VF）序列SEQ ID NO.1和反向引物（PEDV-VR）序列SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’

SEQ ID NO.2：5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出327 bp DNA片段。

本发明还提供了一种用于检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有上述引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

具体的，该试剂盒包括：

（1）阴性对照： 取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存；

（2）RT反应液：

无菌DEPC水 4.75μL

10μmol/L dNTP 1μL

20μmol/L PEDV-VR 1μL

5×反转录缓冲液 4μL

40 U/μL RNA酶抑制剂 1μL

0.1 mmol/L DTT 2μL

200U/μL反转录酶 0.25μL

混匀后-20℃保存；

（3）PCR反应液：

无菌DEPC水 32.5μL

20μmol/LPCR引物混合液 2μL

10×PCR缓冲液 5μL

2.5 mmol/L dNTP 8μL

5U/μL DNA聚合酶 0.5μL

混匀后-20℃保存。

所述的试剂盒，还包括阳性对照为猪流行性腹泻病毒变异株JS-HZ2012发生腹泻的粪便样品。

有益效果

本发明是根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因序列设计的引物，本发明的引物是经过大量PEDV的S基因序列比对和筛选得到的，而且应用该引物及本发明中的检测试剂盒能够快速地判断样品中是否含有猪流行性腹泻病毒变异株，为猪的腹泻病提供检测工具。

同时，进过大量的临床检测和测序分析比对，都证实本发明的检测引物和检测试剂盒能够准确无误的检测目前我国流行的猪流行性腹泻病毒变异株，且不能检测出猪流行性腹泻病毒经典毒株，能够达到区分变异株和经典株的目的，而以往检测方法无法区分变异株和经典株。本发明的引物和检测试剂盒能够为临床上检测猪腹泻病提供有效的工具。

附图说明

图1是猪流行性腹泻病毒变异株（PEDV-V）的RT-PCR检测结果，其中M：DL2000 DNA ladder；1、猪流行性腹泻病毒变异株；2、猪流行性腹泻病毒经典毒株（PEDV）；3、猪传染性胃肠炎病毒（TGVE）；4、猪轮状病毒（PRV）；5、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）；6、阴性对照。

图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果。其中M：DL2000 DNA ladder；1-11表示反转录反应体系中加入的连续10倍稀释的RNA模板；12、阴性对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1、引物的设计和合成

根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列：

正向引物（PEDV-VF）的序列为SEQ ID NO.1，反向引物（PEDV-VR）序列为SEQ ID NO.2，具体序列的组成如下：

SEQ ID NO.1：5’- TTGGTGAAAACCAGGGTGTC -3’

SEQ ID NO.2：5’- CAACACTATGTTCACTCA-3’。

根据上述核苷酸序列信息合成正向引物PEDV-VF和反向引物 PEDV-VR。将上述引物PEDV-VF和PEDV-VR分别配置成浓度为20μmol/L的溶液，备用。

2、一种检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，按下表组装：

表1 试剂盒组成

成分（10份/盒）	含量
		阴性对照	1管
阳性对照	1管
		无菌DEPC水	1管
RT反应液	1管
		PCR反应液	1管
检测引物（正向引物、反向引物）	各1管
		使用说明书	1份

3、阴性对照样品的制备

取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存。

4、阳性对照样品的制备

将本实验室从临床上收集的发生腹泻的粪便样品（来自于江苏省洪泽猪场）用本发明的引物进行RT-PCR检测，出现特异的扩增带（327 bp），并通过基因克隆、核酸序列测定与分析，确定其变异区域S基因与猪流行性腹泻病毒变异株（CH/FJND-3/2011、ZJCZ4等PEDV变异毒株）（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408；Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain. J. Virol, 2012, 86: 13862）S基因的同源性为100%，证实该样品为猪流行性腹泻病毒变异株阳性，命名为JS-HZ2012（GenBank登录号：KC210-147）。置-20℃冰箱保存。

5、RT反应液的制备

按下列配方制备RT反应液

无菌DEPC水 4.75μL

10μmol/L dNTP 1μL

20μmol/L PEDV-VR 1μL

5×反转录缓冲液 4μL

40 U/μL RNA酶抑制剂 1μL

0.1 mmol/L DTT 2μL

200U/μL反转录酶 0.25μL

混匀后-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。

6、PCR反应液的制备

按下列配方制备PCR反应液

无菌DEPC水 32.5μL

20μmol/LPCR引物混合液 2μL

10×PCR缓冲液 5μL

2.5 mmol/L dNTP 8μL

5U/μL DNA聚合酶 0.5μL

混匀后-20℃保存，检验合格后分装，用于成品试剂盒。

7、检测猪流行性腹泻病毒变异株的方法，包括：

1）样品处理：组织样品：采集华东地区46头疑似猪流行性腹泻发病猪的肠道和粪便样品，称取待检组织0.5g置研磨器中剪碎并研磨，加入1.5mL PBS继续研磨。取已研磨好的待检组织液，置1.5mL灭菌离心管中，8000g 离心5 min，取上清100μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。

阳性对照样品：取阳性对照样品100μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。

阴性对照样品：取阴性对照样品100μL，置1.5mL灭菌离心管中待用。

2）病毒提取RNA：取已处理的待检样品、阳性对照样品、阴性对照样品然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，剧烈震荡15 s，然后在室温下保持15 min后，4℃,12000 g离心15 min；将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15 min；4℃,12000 g离心10 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min（如沉淀悬浮起来，则用12000 g），弃去乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μLdH₂O（DEPC处理）中，-20℃保存备用。

3）RT反应：在20 μL反应体系中加入4.75μLDEPC处理水，6μL总RNA，1μL PEDV-VR（20μmol/L）,1μL dNTP（10μmol/L）,混匀后于65℃保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5 min；然后向反应管中加入2μL DTT（0.1 mmol/L）,4μL 5×反转录缓冲液，1μLRNA酶抑制剂（40 U/μL），0.25μL反转录酶（200U/μL），42℃反应50 min；72℃15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

4）PCR扩增

在50μL的反应体系中加入30.5μLDEPC处理水，2μL cDNA，2μL PEDV-VF（20μmol/L）, 2μL PEDV-VR（20μmol/L），10×PCR缓冲液5μL，8μL dNTP（2.5 mmol/L），0.5μL DNA聚合酶（5U/μL）。PCR的反应参数是：94℃,5min；94℃ 30s，52℃ 30s,72℃ 1min，共35个循环；72℃延伸5min。

5）、判定猪流行性腹泻病毒变异株的方法

被检样品电泳出现一条与阳性对照大小相同的扩增片段（327 bp），判定为猪流行性腹泻病毒变异株阳性；

被检样品电泳出现与阳性对照大小（327 bp）不同的扩增片段或不出现扩增片段，判定为猪流行性腹泻病毒变异株阴性。

6）结果

经检测，华东地区46头疑似猪流行性腹泻发病猪的肠道和粪便样品均为猪流行性腹泻病毒变异株阳性，其RT-PCR扩增产物与阳性对照的扩增片段大小一致，均为372 bp。

8、特异性实验

用猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测试剂盒检测其他可能引起猪腹泻的病毒（猪流行性腹泻病毒经典毒株、TGEV、PRV、PRRSV（Bin Li等Complete Genome Sequence of a Highly Prevalent Porcine Circovirus 2 Isolated from Piglet Stool Samples in China. J. Virol, 2012, 86: 4716）和健康猪样品。结果显示，用本发明猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测试剂盒检测的其他可能引起猪腹泻的病毒、健康猪样品均为阴性，结果见附图1。表明建立的猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测试剂盒具有良好的特异性，可准确判定样品中是否存在猪流行性腹泻病毒变异株。

9、灵敏度试验

在反转录反应体系中加入不同浓度的总RNA，进行灵敏度试验。具体地，在20μL反转录体系中，加1μL连续10倍稀释后的总RNA。按照本发明的方法，PCR反应体系中加入2μL的cDNA，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行扩增，结果如图2所示，利用本发明方法，猪流行性腹泻病毒变异株阳性样品可以检测出327 bpDNA片段，本发明方法用于检测猪流行性腹泻病毒变异株灵敏度高，最小检测量为82fg/μL样品RNA，效果非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒

<130> 0

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> PEDV-VF

<222> (1)..(20)

<223>

<400> 1

ttggtgaaaa ccagggtgtc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> PEDV-VR

<222> (1)..(18)

<223>

<400> 2

caacactatg ttcactca 18

Claims

1.猪流行性腹泻病毒变异株检测用的引物，包括

正向引物PEDV-VF（SEQ ID NO.1）：5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’

和反向引物PEDV-VR（SEQ ID NO.2）： 5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’；

该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出327 bp DNA片段。

2.一种用于检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1所述的引物。

3.、如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括：

（1）阴性对照： 取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存；

（2）RT反应液：

无菌DEPC水 4.75μL

10μmol/L dNTP 1μL

20μmol/L PEDV-VR 1μL

5×反转录缓冲液 4μL

40 U/μL RNA酶抑制剂 1μL

0.1 mmol/L DTT 2μL

200U/μL反转录酶 0.25μL

混匀后-20℃保存；

（3）PCR反应液：

无菌DEPC水 32.5μL

20μmol/LPCR引物混合液 2μL

10×PCR缓冲液 5μL

2.5 mmol/L dNTP 8μL

5U/μL DNA聚合酶 0.5μL

混匀后-20℃保存。

4.如权利要求2或3所述的试剂盒，还包括：阳性对照为猪流行性腹泻病毒变异株JS-HZ2012发生腹泻的粪便样品。