CN116836245B - 一种基于特征算法控制合成的重组蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于特征算法控制合成的重组蛋白及其应用，属于蛋白质技术领域。所述的重组蛋白的编码基因的序列如SEQ ID NO：1所示；所述的重组蛋白是将金黄色葡萄球菌蛋白A一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸替换成为耐碱性氨基酸的突变体。所述重组蛋白应用于亲和层析介质的制备，其方法如下：以含琼脂糖凝胶4B单体的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联重组蛋白配基并封尾后得到。基于本发明提供的重组金黄色葡萄球菌蛋白A，具有较好的化学稳定性、耐碱性以及更为优异的IgG结合能力，因此本发明提供的重组金黄色葡萄球菌蛋白A作为亲和配基制备亲和层析填料，应用于抗体的分离纯化。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质技术领域，具体地说，涉及一种基于特征算法控制合成的重组蛋白及其应用。
背景技术
近年来，生物制药领域蓬勃发展，全球生物药市场日益扩大。抗体药物作为最大的治疗用生物制剂类别，在癌症治疗中具有比传统疗法更为明显的疗效以及更低的毒性。抗体药物包括单克隆抗体(裸单克隆抗体)、双特异性抗体及抗体药物偶联物(偶联的单克隆抗体)，抗体药物特定治疗市场的高度商业化需求和由此带来的价值使得各大制药公司将重点放在将其各自的抗体药物生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本，所以在抗体药物的制备过程中，纯化工艺至关重要。
目前现有的纯化工艺主要有由金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)为基础的用于抗体纯化的短链多肽类层析填料。亲和层析是利用生物大分子与某些相对应的专一分子特意识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的层析方法。Protein A能够和免疫球蛋白(抗体)相结合，可在亲和层析介质中用作配基。含有Protein A配基的层析介质具有较为优异的纯化效率，已经广泛应用于纯化抗体药物过程。但目前常用的Protein A层析介质存在处理能力有限、成本高、寿命短等缺陷，例如：纯化过程中结合载量较低，导致纯化成本高；洗脱过程中，抗体发生部分变性，导致抗体回收率较低；配基自身不稳定，导致脱落率高。另外，为了使Protein A层析介质能够重复使用，须对其进行在位清洗(CIP)流程，以除去层析介质上残留的抗体、内毒素等杂质。CIP步骤最常用及有效的清洁剂是NaOH，在CIP过程中适用的NaOH浓度为0.5～1.0M。虽然在此条件下能够有效去除杂质，但由于天然Pr otein A耐碱性较差，在清洗过程中会破坏层析介质，降低了层析介质的使用寿命。因此需要制备一种耐碱Protein A，使得以耐碱Protein A为配基的层析介质能够在CIP过程中不被强碱破坏，以此达到Protein A层析介质可重复利用的目的。
此外，国内抗体生产大都采用进口蛋白A亲和层析介质。如GE的MabSelect SuRe，其基质为高交联的琼脂糖微球，优点是亲水性极佳，生物相容性好，非常适合抗体类生物大分子的分离纯化；但缺点是其结构偏软，粒径分布较宽，在实际使用过程中存在装柱重复性差，机械强度低等问题。Millipore公司的Prosep Ultra Plus也是一种使用较为广泛的蛋白A亲和层析介质，基质为孔道可控的玻璃珠结构，亲水性好，载量很高。但是，玻璃珠结构有一致命缺陷为其不可耐高浓度NaOH清洗这一金标准，因而限制其在大规模生物样品中应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于一种提供基于特征算法控制合成的重组蛋白及其应用，基于本发明提供的重组Protein A蛋白，具有较好的化学稳定性、耐碱性以及更为优异的IgG结合能力，因此本发明提供的重组Protein A蛋白作为亲和配基制备亲和层析填料，应用于抗体的分离纯化。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于特征算法控制合成的重组蛋白，
所述重组蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述所述重组蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白A一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸替换成为耐碱性氨基酸的突变体。
一种上述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，所述重组蛋白应用于亲和层析介质的制备，其方法如下：以含琼脂糖凝胶4B单体的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联重组蛋白配基并封尾后得到亲和层析介质；
其中所述封尾反应的控制算法如下：
对偶联重组蛋白配基后的微球试剂进行n等分，对等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，检测微球表面的活性功能团的活性，在偶联重组蛋白配基后的微球试剂中加入封尾试剂，在封尾策略的控制下进行封尾操作。
进一步地，所述亲和层析介质为多孔微球介质。
进一步地，所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子，所述亲水性树枝状大分子为聚酰胺-胺。
进一步地，所述活化为在所述微球表面接上功能团，所述功能团为氨基。
进一步地，所述偶联重组蛋白配基为将所述重组蛋白配基偶联到所述微球活化后的表面功能团上。
进一步地，所述封尾为利用含有氨基类的小分子与所述偶联重组蛋白配基后的所述微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的所述活性功能团。
进一步地，作为基质的所述含琼脂糖凝胶4B单体的微球是粒径均一、有孔的单分散多孔微球。
进一步地，所述封尾策略包括以下具体步骤：
S1、将进行n等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，提取检测的微球表面的活性功能团的活性，分别设为(x1,x2,x3,...,xn)，其中xi为第i份微球表面的活性功能团的活性，计算各份微球表面的活性功能团的总活性值，第i份微球表面的活性功能团的总活性值的计算公式为：其中，r为培养皿半径，k为单位面积内微球表面的活性功能团的数量；
S2、根据计算得到的若干份微球表面的活性功能团的总活性值查表提取各份微球封尾需要的封尾试剂的剂量序列(s1,s2,s3,...,sn)，从中提取各份微球需要的封尾试剂的剂量的最小值smin，向微球试剂中滴加nsmin的封尾试剂，搅拌后静置10min；
S3、重复进行S1-S2操作，直至提取到的检测的微球表面的活性功能团的活性均处于封尾需要的活性合格值之内时完成封尾操作。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明制备的亲和层析介质由重组耐碱ProteinA共价键偶联到多糖微球上构成的复合微球，优化的介质孔径有利于提高抗体的结合载量，该介质适合从大批量菌体培养液中捕获单克隆抗体或者具有Fc融合蛋白，也适合于从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体；ProteinA为重组的耐碱蛋白A片段，在上游构建的时候采用了耐碱的氨基酸替换了不耐碱的氨基酸，使得该配基具有良好的耐碱稳定性。该介质可以用0.1～0.5MNaOH进行在位CIP清洗。该介质具有如下特点：高刚性、低背压，快流速；高载量，高柱效；耐碱清洗安全供货程序，琼脂糖基质和蛋白A配基以及中间关键原材料均有两个不同的供应商供货。
2.本发明通过准确计算微球试剂的活性值，然后通过活性值查表提取各份微球封尾需要的封尾试剂的剂量，有利于准确添加封尾试剂，具有较好的封尾效果，提高了制备得到的亲和层析介质的质量。
附图说明
图1为本发明中华诺生物60-65μm镜检图；
图2为本发明中华诺生物45μm镜检图；
图3为本发明中漂莱特45μm镜检图(GE)；
图4为本发明中漂莱特60-65μm镜检图(GE)；
图5为本发明中嘉兴千纯PrePackProteinAColumns 90μm镜检图；
图6为本发明中压力/流速曲线图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明提供一种基于特征算法控制合成的重组蛋白，所述重组蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述所述重组蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白A一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸替换成为耐碱性氨基酸的突变体。
本发明还提供一种上述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，所述重组蛋白应用于亲和层析介质的制备，其方法如下：以含琼脂糖凝胶4B单体的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联重组蛋白配基并封尾后得到亲和层析介质。
其中，所述亲和层析介质为多孔微球介质。
所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子，所述亲水性树枝状大分子为聚酰胺-胺。
所述活化为在所述微球表面接上功能团，所述功能团为氨基。
所述偶联重组蛋白配基为将所述重组蛋白配基偶联到所述微球活化后的表面功能团上。
所述封尾为利用含有氨基类的小分子与所述偶联重组蛋白配基后的所述微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的所述活性功能团。
作为基质的所述含琼脂糖凝胶4B单体的微球是粒径均一、有孔的单分散多孔微球。
其中，所述封尾反应的控制算法如下：
对偶联重组蛋白配基后的微球试剂进行n等分，对等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，检测微球表面的活性功能团的活性，在偶联重组蛋白配基后的微球试剂中加入封尾试剂，在封尾策略的控制下进行封尾操作。
进一步地，所述封尾策略包括以下具体步骤：
S1、将进行n等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，提取检测的微球表面的活性功能团的活性，分别设为(x1,x2,x3,...,xn)，其中xi为第i份微球表面的活性功能团的活性，计算各份微球表面的活性功能团的总活性值，第i份微球表面的活性功能团的总活性值的计算公式为：其中，r为培养皿半径，k为单位面积内微球表面的活性功能团的数量；
S2、根据计算得到的若干份微球表面的活性功能团的总活性值查表提取各份微球封尾需要的封尾试剂的剂量序列(s1,s2,s3,...,sn)，从中提取各份微球需要的封尾试剂的剂量的最小值smin，向微球试剂中滴加nsmin的封尾试剂，搅拌后静置10min；
S3、重复进行S1-S2操作，直至提取到的检测的微球表面的活性功能团的活性均处于封尾需要的活性合格值之内时完成封尾操作。
下面对不同产品的性能进行测试。
具体测试如下：
表1产品参数表
注：以上参数均以1mL预装柱为基准检测
参考说明书
1、GE填料说明书(HITrapTM MabSelectTM Prism A Prepacked columns)；
2、Bestchrom填料说明书(AT Protein A Diamond Plus Prepacked columns)。
仪器设备及试剂如下表所示：
表2分析测试设备汇总表
表3分析测试试剂汇总表
待测样品如下表所示：
表4待测样品汇总表
| 公司名称 | 型号 | 预装柱体积 |
| GE | HiTrapTM1mlMabSelectTMPrismA | 1ml |
| Bestchrom | ATProteinADiamondPlusPrepackedcolumns | 1ml |
| 武汉汇研 | ProteinAFocurose4FFPrepackedcolumns | 1ml |
| 西安蓝晓 | R-ProteinAseplife4FF | 1ml |
| 天地人和 | AbCapA4FF | 1ml |
| 华诺生物 | ProteinA-HNmicroPrepackedcolumns | 1ml |
| 嘉兴千纯 | PrePackProteinAColumns | 1ml |
注：排名无先后顺序
测试目的：
测试不同厂家微球粒径范围；
测试不同厂家1ml Protein A预装柱的动态结合载量；
测试不同厂家1ml Protein A预装柱的耐碱性；
测试不同厂家1ml Protein A预装柱耐压效果。
测试项目：
微球粒径；
动态载量；
耐碱性测试；
耐压测试。
测试方法：
100X显微镜观察微球是否有破碎情况；
动态载量测试方法：
平衡液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
样品：2mg/ml Human IgG；
洗杂液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
洗脱液：0.1M Glycine pH 3.0；
流速：0.2ml/min；
驻留时间：5min；
0.2mL/min平衡液至基线平稳，2mg/mL Human IgG蛋白0.2mL/min动态吸附载量，直至DSC 10％，换洗杂液0.2mL/min直至基线平稳(或A280<DSC10％值)，换洗脱液0.5mg/mL至蛋白完全洗脱完基线平稳，收集洗脱液测定蛋白含量，换平衡液0.5mg/mL冲洗10个柱体积，换20％乙醇溶液冲洗5个柱体积，即完成载量测试。
耐碱性测试方法：
0.2M NaOH流穿5个柱体积后，4℃原位保存48h后，测试Human IgG 0.2mL/min动态吸附载量；
0.5M NaOH流穿5个柱体积后，4℃原位保存24h后，测试Human IgG 0.2mL/min动态吸附载量。
实验准备：
预装柱准备：
将保存在2-8℃的冰箱里的Protein A预装柱取出按测试顺序依次安装在蛋白分析仪上。
20％乙醇配置：
取一个合适的量筒，量取200ml无水乙醇，倒入1000ml容量瓶中，加超纯水定容至1000ml，盖好盖子摇匀，最后贴好标签备用。
1M Tris-HCl pH 9.0配置：
精确称量121.14g Tris固体，加入800mL超纯水至固体完全溶解，滴加浓HCl调节pH至9.0，将其倒入1000ml的容量瓶内，加水定容至1000ml，盖好盖子摇匀，即为1M Tris-HCl pH 9.0，并贴好标签备用。
0.2M NaH2PO4配置：
精确称量24g无水磷酸二氢钠固体，加入800mL超纯水至固体完全溶解，倒入1000ml容量瓶中，补超纯水至1000ml，盖好盖子摇匀，最后用0.45um滤膜过滤，即为0.2MNaH2PO4，并贴好标签备用。
0.2M Na2HPO4配置：
精确称量28.39g无水磷酸氢二钠固体，加入800mL超纯水至固体完全溶解，倒入1000ml容量瓶中，加超纯水至1000ml，盖好盖子摇匀，最后用0.45um滤膜过滤，即为0.2MNa2HPO4，并贴好标签备用。
20mM PB 150mM NaCl pH 7.5配置：
用量筒分别量取28ml 0.2M NaH2PO4和72ml 0.2M Na2HPO4倒入500ml烧杯内；精确称量8.77g NaCl固体，倒入同一烧杯内，将烧杯置于磁力搅拌器上并放入搅拌子，加纯化水定容至1000ml，即为20mM PB 150mM NaCl pH 7.5，并贴好标签备用。
0.1M Glycine pH 3.0配置：
精确称量3.75g Glycine固体，将其倒入500ml的烧杯内，将烧杯置于磁力搅拌器上并放入搅拌子，用量筒精确量取400ml纯化水，打开搅拌器使其充分搅匀，倒入500ml容量瓶中，加超纯水至500mL，最后用0.45um滤膜过滤，即为0.1M Glycine，并贴好标签备用。
2mg/ml Human IgG配置：
取一瓶规格100mg装的Human IgG干粉，将其倒入100ml的烧杯内，称取49.9g 20mMPB 150mM NaCl pH 7.2溶液倒入上述烧杯内，将烧杯置于磁力搅拌器上并放入搅拌子，打开搅拌器缓慢搅拌使其充分搅匀，最后用0.45um滤膜过滤，即为2mg/ml Human IgG，并贴好标签。
0.5M NaOH配置：
取20g NaOH溶解于1L容量瓶的超纯水中，超声溶解，降至室温。
0.2M NaOH配置：
取8g NaOH溶解于1L容量瓶的超纯水中，超声溶解，降至室温。
开启仪器：
将仪器电源连接，开启电脑，打开仪器开关，点击软件图标，登录并连接仪器。
实验过程：
如图1-图5所示，其为测试不同厂家微球粒径范围。需要注意的是，注：博格隆和汇研等提供的是1mL标准柱，未做镜检。
装柱：
柱管用纯化水及20％乙醇清洗干净，先将下筛板放入管内，用一次吸头压到柱管底部压实，提前计算好填料用量，用移液枪精确吸取加入柱管内，放入上筛板，切勿让填料流出，此时把密封塞装上，带动上筛板至柱管标记处，运行1ml/min的流速，查看***压力，观察柱管情况，无异常情况将密封盖装上，拧上peek头即装柱完成。
载量测试：
平衡液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
样品：2mg/ml Human IgG；
洗杂液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
洗脱液：0.1M Glycine pH 3.0；
流速：0.2ml/min；
洗脱后的蛋白用1M Tris-HCl pH 9.0中和至pH 7.0。
进行相应的载量测试，载量结果(载量单位：mg/ml)如下：
表5载量结果汇总表
耐碱载量测试：
耐碱液1：0.5M NaOH流穿5个柱体积后，4℃原位保存24h后，测试Human IgG吸附量；
平衡液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
样品：2mg/ml Human IgG；
洗杂液：20mM PB 150mM NaCl pH 7.5；
洗脱液：0.1M Glycine pH 3.0；
流速：0.2ml/min；
耐碱后载量数据对比(载量单位：mg/mL)如下表所示：
表6耐碱载量结果汇总表
耐压效果测试如下表所示：
表7压力流速数据表
如图6所示，其展示了压力/流速曲线图。
总结：
数据对比如下表所示：
表8数据总结表
结果分析：
1)华诺Protein A-At-HNmicro平均粒径60um；
2)载量68mg/mL；
3)耐碱0.5M 48h载量保持83.9％以上；
4)0.3Mpa压力下三个厂家GE，上海博格隆，华诺生物均没有出现明显破裂现象。
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于特征算法控制合成的重组蛋白，其特征在于：
所述重组蛋白编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述重组蛋白是金黄色葡萄球菌蛋白A一个或多个结构域中的一个或多个氨基酸替换成为耐碱性氨基酸的突变体。
2.一种如权利要求1所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述重组蛋白应用于亲和层析介质的制备，其方法如下：以含琼脂糖凝胶4B单体的微球为基质，经亲水性树枝状大分子修饰、活化、偶联重组蛋白配基并封尾后得到亲和层析介质；
其中所述封尾反应的控制算法如下：
对偶联重组蛋白配基后的微球试剂进行n等分，对等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，检测微球表面的活性功能团的活性，在偶联重组蛋白配基后的微球试剂中加入封尾试剂，在封尾策略的控制下进行封尾操作。
3.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述亲和层析介质为多孔微球介质。
4.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述亲水性树枝状大分子修饰为在所述微球表面功能团上接枝亲水性树枝状大分子，所述亲水性树枝状大分子为聚酰胺-胺。
5.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述活化为在所述微球表面接上功能团，所述功能团为氨基。
6.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述偶联重组蛋白配基为将所述重组蛋白配基偶联到所述微球活化后的表面功能团上。
7.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述封尾为利用含有氨基类的小分子与所述偶联重组蛋白配基后的所述微球表面的活性功能团进行反应，消除未反应的所述活性功能团。
8.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
作为基质的所述含琼脂糖凝胶4B单体的微球是粒径均一、有孔的单分散多孔微球。
9.根据权利要求2所述的基于特征算法控制合成的重组蛋白的应用，其特征在于：
所述封尾策略包括以下具体步骤：
S1、将进行n等分后的微球表面的活性功能团分别进行红外光谱检测，提取检测的微球表面的活性功能团的活性，分别设为(x1,x2,x3,...,xn)，其中xi为第i份微球表面的活性功能团的活性，计算各份微球表面的活性功能团的总活性值，第i份微球表面的活性功能团的总活性值的计算公式为：其中，r为培养皿半径，k为单位面积内微球表面的活性功能团的数量；
S2、根据计算得到的若干份微球表面的活性功能团的总活性值查表提取各份微球封尾需要的封尾试剂的剂量序列(s1,s2,s3,...,sn)，从中提取各份微球需要的封尾试剂的剂量的最小值smin，向微球试剂中滴加nsmin的封尾试剂，搅拌后静置10min；
S3、重复进行S1-S2操作，直至提取到的检测的微球表面的活性功能团的活性均处于封尾需要的活性合格值之内时完成封尾操作。
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