CN105175554B - 一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方法和在传染性法氏囊病病毒浓缩与纯化中的应用。所述类弹性蛋白多肽(ELP)与热应激蛋白90α(Hsp90α)融合蛋白由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒(IBDV)结合片段M167a组成。其制备方法包括融合表达载体的构建、融合蛋白的表达与纯化、IBDV结合片段的确定以及IBDV的浓缩与洗脱。与其他方法相比，用本发明的融合蛋白浓缩和纯化传染性法氏囊病病毒具有简单、快速和经济等优点，制备的传染性法氏囊病病毒可用于实验研究和疫苗制备。

Description

一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白及其制备方 法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白的制备方法及其在传染性法氏囊病病毒浓缩和纯化中的应用。

背景技术

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的鸡的一种高度接触传染性传染病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。病毒浓缩与纯化是病毒分子生物学研究和疫苗制备的重要环节。现有的IBDV浓缩方法主要有氯仿抽提和聚乙二醇沉淀等，纯化方法主要有差速离心、密度梯度离心和亲和层析等，这些方法均存在费时、费力、回收率低和费用高等缺点。另外，目前缺少快速、敏感、经济的IBDV环境监测方法。

病毒受体结合捕捉技术是近几年出现的病毒浓缩与纯化新技术，其基本原理是根据病毒与受体结合的特异性，利用病毒受体蛋白偶联的磁珠等固相载体从病毒感染组织、动物食品和环境样品中捕获病毒，与PCR等技术相结合，还可用于病毒的环境监测。该技术具有快速、高效等优点，但所用磁珠的价格昂贵、需要专门仪器设备，其实际应用受到限制。

热应激蛋白90α(Hsp90α)是IBDV的受体复合物成分，能与病毒颗粒及其VP2蛋白结合，因此可以作为捕捉IBDV的诱饵蛋白。Hsp90α分为N端结构域、中间结构域和C端结构域，但其IBDV结合区尚不清楚。

类弹性蛋白多肽(ELP)是根据弹性蛋白相关序列合成的五肽(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸)聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈溶解状态，高于相变温度溶液中呈凝聚状态。本课题组用ELP与腺病毒受体融合蛋白建立了简单、经济的重组腺病毒浓缩与纯化方法，但ELP与Hsp90α或其片段融合后能否保持可逆相变特性，并用于IBDV浓缩与纯化还有待研究。

本发明将重组大肠杆菌表达的ELP-Hsp90α融合蛋白用于IBDV的浓缩与纯化，尽管这种策略在理论上是可行的，但在具体设计时却面临以下技术问题：Hsp90α或其片段能否在大肠杆菌中高效和可溶性表达、表达的ELP融合能否与IBDV结合、IBDV结合区位于哪个片段、最佳的结合条件是什么、如何洗脱与融合蛋白结合的病毒且不被灭活、结合融合蛋白的IBDV能否感染易感细胞。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种类弹性蛋白多肽(ELP)与热应激蛋白90α(Hsp90α)融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白，由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒(IBDV)结合区组成。经病毒浓缩和纯化试验证明，利用该融合蛋白能从感染细胞培养上清、裂解细胞以及病毒污染模拟水样中浓缩和纯化IBDV。

为了确定IBDV结合区，本发明分别将ELP与全长Hsp90α或其片段进行融合表达；在不同条件下将融合蛋白与IBDV进行共孵育，以便确定融合蛋白结合IBDV的最佳条件；通过对洗脱条件的***优化，使IBDV能从融合蛋白有效洗脱并不被灭活。最终，本发明选择含IBDV结合区的最短融合蛋白ELP-M167a进行IBDV浓缩与纯化，以便在大肠杆菌中高效表达和减少IBDV结合的非特异性。

本发明所采用的技术方案是：一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α融合蛋白，是ELP-M167a，由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒结合片段M167a组成，所述M167a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明所述融合蛋白ELP-M167a用下列方法制备:

(1)用PCR克隆Hsp90α中间结构域167个氨基酸M167a的编码序列如SEQ ID No.2所示。

(2)将上述编码序列***ELP融合表达载体，获得重组载体pELP-M167a；

(3)将重组载体转化大肠杆菌，在20℃诱导融合蛋白表达；

(4)用2mol/L氯化钠在26℃沉淀融合蛋白。

本发明还公开了所述的ELP-M167a融合蛋白在IBDV浓缩与纯化中的应用，其具体方法如下:

(1)将320μg/ml ELP-M167a融合蛋白分别与等量IBDV感染细胞培养上清、裂解细胞以及模拟水样混合；

(2)用2mol/L氯化钠在26℃沉淀病毒；

(3)用pH9.0缓冲液洗脱病毒；

(4)用2mol/L氯化钠和26℃离心去除ELP-M167a融合蛋白。

进一步地，公开了上述融合蛋白在浓缩和纯化IBDV中的应用。本发明采用以下方法对融合蛋白进行验证:

(1)按照常规方法用IBDV感染细胞，获得细胞培养上清和裂解细胞；

(2)将不同剂量IBDV接种自来水和PBS，获得IBDV污染模拟水样；

(3)将320μg/ml ELP-M167a融合蛋白分别与等量IBDV感染细胞培养上清、裂解细胞以及模拟水样混合；

(4)用2mol/L氯化钠和26℃沉淀病毒；

(5)用pH9.0缓冲液洗脱病毒；

(6)用2mol/L氯化钠和26℃离心去除ELP-M167a融合蛋白。

与现有的其他方法相比，用本发明的融合蛋白不仅能从感染细胞中浓缩和纯化IBDV，而且能从病毒污染水样中浓缩IBDV，纯化的病毒不仅可用于动物实验研究，而且可用于疫苗制备。

附图说明

图1Hsp90a结构及其表达策略。数字表示氨基酸数，箭头表示Hsp90a结构域或用于克隆表达的片段。

图2ELP-Hsp90a融合蛋白的表达与纯化及电泳分析。M是蛋白质分子量标准，1是IPTG诱导的重组菌裂解物，2是第一轮相变循环后的融合蛋白，3是第二轮相变循化后的融合蛋白。

图3融合蛋白结合IBDV的RT-PCR检测。M是DNA分子量标准，1是病毒阳性对照，2是ELP-Hsp90a融合蛋白沉淀的病毒，3是ELP-N284融合蛋白沉淀的病毒，4是ELP-C444融合蛋白沉淀的病毒，5是ELP-M167a融合蛋白沉淀的病毒，6是ELP-M167b融合蛋白沉淀的病毒，7是ELP-C132融合蛋白沉淀的病毒，8是ELP沉淀的病毒。

图4融合蛋白沉淀传染性法氏囊病病毒的条件与效率。

图5洗脱传染性法氏囊病病毒的条件与效率。

具体实施方式

生物材料来源：

1.pET-30a载体：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。

2.pET/EI-GFP载体：从美国普林斯顿大学引进，本实验室保存。文献：Fong BA,Wood DW.Expression and purification of ELP-intein-tagged target proteins inhigh cell density E.coli fermentation.Microbial Cell Factories,2010,9:77.

3.DH5a大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech公司引进，本实验室保存。

4.BLR(DE3)大肠杆菌：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。

5.鸡胚成纤维细胞DF-1系：从美国ATCC引进，本实验室保存；

6.Lukert株传染性法氏囊病病毒：由本实验室保存(文献：Lukert PD,Leonard J，Davis RB.Infectious bursal disease virus:antigen production and immunity.Am JVet Res，1975，36(4Pt 2)：539-540)。

具体操作步骤如下：

1.融合表达载体构建

(1)用限制酶NdeI和SacI消化pET/EI-GFP，电泳分离后按照DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)说明书回收ELP基因片段，与相同酶线性化的pET-30a载体连接，获得ELP融合表达载体pET-ELP。

(2)将生长状态良好的鸡成纤维DF-1细胞在42℃培养3小时，按照RNAiso^TM Plus试剂盒(TaKaRa公司)说明书提取细胞总RNA，按照RevertAid^TM Reverse Transcriptase(Fermentas公司)说明进行反转录。

(3)根据鸡Hsp90αmRNA序列(GenBank Accession No:X07265)设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入Xho I酶切位点：

正向引物：5'-TTGTCGACCCGGAAGCTGTGCAAACACAGG-3'(SEQ ID No.3)；

反向引物：5'-AACTCGAGTTAATCCACCTCCTCCATACGT-3'(SEQ ID No.4)。

以上述反转录产物为模板，按照LA Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)说明书，用PCR扩增全长Hsp90αcDNA(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-Hsp90α。

(4)根据鸡Hsp90αmRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入Xho I酶切位点：

正向引物：5'-TTGTCGACCCGGAAGCTGTGCAAACACAGG-3'(SEQ ID No.5)；

反向引物：5'-TTCTCGAGTTCCTCATCAATGTACTTCTCC-3'(SEQ ID No.6)。以pELP-Hsp90α为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增N284cDNA片段(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-N284。

(5)根据鸡Hsp90αmRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入XhoⅠ酶切位点：

正向引物：5'-TAGTCGACGAGCTCAACAAGACCAAGCC-3'(SEQ ID No.7)；

反向引物：5'-AACTCGAGTTAATCCACCTCCTCCATACGT-3'(SEQ ID No.8)。

以pELP-Hsp90α为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增MC444cDNA片段(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-MC444。

(6)根据鸡Hsp90αmRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入XhoⅠ酶切位点：

正向引物：5'-CTGTCGACGAGGAAGAGCTCAACAAGAC-3'(SEQ ID No.9)；

反向引物：5'-CGCTCGAGTTAGGAGTCTTCATGTATTCCAA-3'(SEQ ID No.10)。

以pELP-Hsp90α为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增M167a cDNA片段(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-M167a。

(7)根据鸡Hsp90αmRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入XhoⅠ酶切位点：

正向引物：5'-ATGTCGACAACATCAAGCTTGGAATACAT-3'(SEQ ID No.11)；

反向引物：5'-GTCTCGAGTTACATATTGGCAGTCCAGCC-3'(SEQ ID No.12)。

以pELP-Hsp90α为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增M167b cDNA片段(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-M167b。

(8)根据鸡Hsp90αmRNA序列设计下列1对引物，正向引物引入Sal I酶切为点，反向引物引入XhoⅠ酶切位点：

正向引物：5'-ATGTCGACACAAGTACATATGGCTGGAC-3'(SEQ ID No.13)；

反向引物：5'-CTCTCGAGTTAATCCACCTCCTCCATAC-3'(SEQ ID No.14)。

以pELP-Hsp90α为模板，按照LA Taq DNA聚合酶说明书，用PCR扩增C132cDNA片段(图1)，用限制酶Sal I和Xho I消化PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-C132。

2.融合蛋白表达与纯化

(1)分别将上述重组载体pELP-Hsp90α、pELP-N284、pELP-MC444、pELP-M167a、pELP-M167b和pELP-C132转化BLR(DE3)大肠杆菌，在卡那霉素(50μg/mL)LB平板上培养过夜；挑取单菌落接种5mL卡那霉素LB，37℃摇床培养过夜，4℃、8000g离心10min；沉淀菌体以等体积LB重悬，以1:100比例接种500mL卡那霉素2×YT培养液(Tryptone 16g，YeastExtract 10g，Nacl 5g，1L)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀＝0.8；加入终浓度为1mmol/L IPTG，20℃诱导表达20h；4℃、4000g离心10min，沉淀菌体用50mL PBS重悬，按照细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)说明书2次裂解重组菌(4℃，1300bar)；13000rpm、4℃离心20min，分别收集上清与沉淀进行电泳分析，结果显示：重组菌能表达预期大小的ELP-Hsp90a、ELP-N284、ELP-MC444、ELP-M167a、ELP-M167b和ELP-C132融合蛋白(图2)。

(2)ELP融合蛋白纯化参考文献(Kang HJ,Kim JH,Chang WJ.Heterologousexpression and optimized one-step separation of levansucrase via elastin-likepolypeptides tagging system.Microbiology and Biotechnology,2007,17(11):1751-1757)进行。将裂解菌体在4℃、16000g离心20min，收集上清；用分光光度计测定蛋白浓度，用PBS调整蛋白浓度至10mg/mL；加入等体积4mol/L NaCl，26℃孵育10min；14000g离心5min，收集离心沉淀；在相同条件下重复1次相变循环，离心沉淀用PBS溶解；取部分纯化产物进行12％SDS-PAGE分析，结果显示：经过两轮相变循环纯化的融合蛋白基本为单一条带(图2)。

3.融合蛋白结合IBDV的测定

用PBS将不同融合蛋白稀释至50μg/mL，各取200μL与30μL IBDV(Lukert株)混合，4℃孵育1h；加入等体积4mol/L NaCl，26℃孵育10min，14000g离心5min；沉淀用100μL PBS重悬，按照RNAiso^TM Plus(TaKaRa公司)说明书提取RNA，按照RevertAid^TM ReverseTranscriptase(Fermentas公司)使用说明书进行反转录。

根据IBDV VP2基因序列(GenBank Accession No:KR028197)设计下列1对引物：

正向引物：5'-AGCTCGAAGTTGCTCACC-3'(SEQ ID No.15)；

反向引物：5'-CAACAGCCAACATCAACG-3'(SEQ ID No.16)。

以上述反转录产物为模板和引物进行PCR扩增，结果显示：在ELP-Hsp90a、ELP-MC444、ELP-M167a融合蛋白沉淀的病毒中可以扩增出预期的679bp IBDV VP2基因片段，在其他融合蛋白沉淀病毒中不能扩增出相应的基因片段(图3)。

4.融合蛋白沉淀IBDV的条件优化

(1)用PBS(pH7.0)将ELP-M167a融合蛋白稀释为10、20、40、80、160、320、640μg/mL，各取100μL与等量IBDV(10^-6.5/0.1mL TCID₅₀)混合，4℃孵育1h；分别加入200μL 4mol/L氯化钠，26℃孵育10min；室温14000g离心5min，沉淀用PBS离心洗涤2次，用30μL PBS溶解；参考文献(Wang Y,Sun H,Shen P,Zhang X,Xia X.Efficient inhibition of replication ofinfectious bursal disease virus by miRNAs delivered by vectors and targetingthe VP2gene.Journal of Virological Methods,2010,165:127-132)在DF-1细胞上进行IBDV滴定，设3孔重复，结果显示：ELP-M167a融合蛋白沉淀IBDV的最适浓度160μg/mL，病毒回收率达82％。

(2)用不同pH的PBS将ELP-M167a融合蛋白稀释为320μg/mL，各取100μL与等量IBDV混合，4℃孵育1h；如前进行病毒沉淀和滴定，结果显示：ELP-M167a融合蛋白沉淀IBDV的最适pH为7.0，病毒回收率达80％。

(3)用pH7.0的PBS将ELP-M167a融合蛋白稀释为320μg/mL，各取100μL与等量IBDV混合，在不同温度孵育1h；如前进行病毒沉淀和滴定，结果显示：ELP-M167a融合蛋白沉淀IBDV的最适温度为16℃，病毒回收率达82％。

(4)用pH7.0的PBS将ELP-M167a融合蛋白稀释为320μg/mL，各取100μL与同体积IBDV混合，在16℃孵育不同时间；如前进行病毒沉淀和滴定，结果显示：ELP-M167a融合蛋白沉淀IBDV的最适时间为1h，病毒回收率达81％(图4)。

(5)用pH7.0的PBS将ELP-M167a融合蛋白稀释为320μg/mL，各取100μL与等量IBDV感染细胞培养上清或裂解细胞混合，16℃孵育1h；如前进行病毒沉淀和滴定，结果显示：用ELP-M167a融合蛋白从感染细胞培养上清和裂解细胞中沉淀IBDV的回收率分别75.4％和71.7％。

(6)分别用10mL自来水和PBS(pH7.0)将IBDV稀释为10⁴TCID₅₀，各取100μL与等量320μg/mL ELP-M167a融合蛋白混合，16℃孵育1h；如前进行病毒沉淀和滴定，结果显示：用ELP-M167a融合蛋白从两个IBDV污染模拟水样中沉淀病毒的回收率分别73％和68％。

5.传染性法氏囊病病毒洗脱条件的优化

(1)用不同pH的PBS溶解ELP-M167a融合蛋白沉淀的IBDV，在4℃洗脱30min，然后用ITC沉淀融合蛋白，收集离心上清进行病毒滴定，结果显示：pH4.5和9.0的PBS均能有效洗脱IBDV，病毒回收率分别为46％和47％。

(2)用pH9.0的PBS溶解ELP-M167a融合蛋白沉淀的IBDV，在不同温度洗脱30min，然后如前进行病毒滴定，结果显示：洗脱IBDV的最适温度为22℃，病毒回收率达46％。

(3)用pH9.0的PBS溶解ELP-M167a融合蛋白沉淀的IBDV，在22℃洗脱不同时间，然后如前进行病毒滴定，结果显示：洗脱IBDV的最适时间为30min，病毒回收率达47％(图5)。

(4)用pH9.0的PBS溶解ELP-M167a融合蛋白从感染细胞培养上清和裂解细胞沉淀的IBDV，在22℃洗脱30min，然后如前进行病毒滴定，结果显示：IBDV的回收率分别为39.3％和42.5％。

Claims (4)

1.一种类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α的传染性法氏囊病病毒结合片段融合蛋白ELP-M167a，其特征在于：由ELP和Hsp90α的传染性法氏囊病病毒结合片段M167a组成，所述M167a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述ELP为来源于pET/EI-GFP的ELP基因所编码。

2.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α的传染性法氏囊病病毒结合片段融合蛋白ELP-M167a，其制备方法如下：

(1)用PCR克隆Hsp90α中间结构域167个氨基酸M167a的编码序列SEQ ID No.2；

(2)将上述编码序列***ELP融合表达载体，获得重组载体pELP-M167a；具体操作是：

1)用限制酶NdeI和SacI消化pET/EI-GFP，电泳分离后按照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收ELP基因片段，与相同酶线性化的pET-30a载体连接，获得ELP融合表达载体pET-ELP；

2)将生长状态良好的鸡成纤维DF-1细胞在42℃培养3小时，按照RNAiso^TM Plus试剂盒说明书提取细胞总RNA，按照RevertAid^TM Reverse Transcriptase说明进行反转录；

3)用限制酶Sal I和Xho I消化步骤(1)的PCR产物，与相同酶切的pET-ELP载体连接，获得重组载体pELP-M167a；

(3)将重组载体转化大肠杆菌，在20℃诱导融合蛋白表达；

(4)用2mol/L氯化钠在26℃沉淀融合蛋白。

3.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽与热应激蛋白90α的传染性法氏囊病病毒结合片段融合蛋白ELP-M167a在传染性法氏囊病病毒浓缩与纯化中的应用。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于，具体方法如下:

(1)将160μg/ml如权利要求1所述的ELP-M167a融合蛋白分别与IBDV感染细胞培养上清、裂解细胞以及模拟水样混合；

(2)用2mol/L氯化钠在26℃沉淀病毒；

(3)用pH9.0缓冲液洗脱病毒；

(4)用2mol/L氯化钠在26℃离心去除ELP-M167a融合蛋白。