CN103209954B - 作为mGluR2/3拮抗剂的4-取代的-3-苄氧基-双环[3.1.0]己烷化合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了式（通式）的mGlu2/3受体拮抗剂、其用途、及其制备方法。

Description

作为mGluR2/3拮抗剂的4-取代的-3-苄氧基-双环[3.1.0]己烷化合物
谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质，参与不少于11种特有药理学的不同受体所介导的多种生理过程。促代谢性谷氨酸受体亚型2和3(称为mGlu2和mGlu3)通常基于它们的序列同源性、类似的第二信使偶联、和类似的药理学特性被一起归类为第II组mGlu受体。mGlu2/3受体拮抗剂在抑郁障碍(depressive disorder)和过度嗜睡障碍(disorders of excessive sleepiness)的动物模型中已表现出显著的药理学效应。因此，mGlu2/3拮抗剂被视为有益于治疗抑郁障碍诸如重性抑郁障碍(MDD)、单相抑郁症(unipolar depression)、心境恶劣、和/或循环型情感症(cyclothymia)，和/或有益于治疗过度嗜睡障碍诸如日间过度嗜睡(excessive daytime sleepiness，EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍(jet lag disorder)、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病(idiopathic hypersomnolance)和/或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡。
US 5,916,920描述了某些3-单取代的-双环[3.1.0]己烷化合物，作为有益于治疗多种障碍的促代谢性谷氨酸受体调节剂，包括作为抗抑郁剂。US 7,157,594描述了多种3-单取代的-双环[3.1.0]己烷化合物，作为第II组mGlu受体拮抗剂，用于治疗多种障碍，包括抑郁性症状。US 2007/0021394 Al描述了作为第II组mGlu受体拮抗剂的多种3-单取代的-双环[3.1.0]己烷化合物及其药物前体，用于治疗多种障碍，包括抑郁症。
本发明提供一族4-取代的-3-苯基硫烷基甲基-双环[3.1.0]己烷化合物，其对mGlu2和mGlu3受体具有高拮抗的效力。本发明的化合物对mGlu2和mGlu3受体也为选择性的，特别是相对其他mGlu受体。一些化合物通过动物模型也已证实本发明的化合物可以有益于治疗抑郁障碍(其可以包括重性抑郁障碍(MDD)、单相抑郁症、心境恶劣、和/或循环型情感症)和过度嗜睡障碍(其可以包括日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病和/或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡)。这一机制的抗抑郁样和促醒效应也预知对抑郁障碍的症状如疲劳的影响，这是现有抗抑郁药别的方式难以治疗的。
本发明提供式I化合物：
其中R1和R2各自独立为氢、C1-C3烷氧基羰基氧基甲基、C1-C3烷基羰基氧基甲基、或C3-C6环烷基羰基氧基甲基；
R3在每次出现时独立为甲基、氟或氯；
R4为羟基、甲基羰基氨基、羟基甲基羰基氨基、甲氧基羰基氨基、咪唑-2-基硫烷基、噻唑-2-基硫烷基、l,2,4-***-3-基硫烷基、1-甲基-l,2,4-***-3-基硫烷基、或1-甲基-l,2,4-***-5-基硫烷基；和
n为是1或2；
或其药学上可接受的盐。
本发明的特征在于，其中R1和R2均为氢的式I化合物(二酸化合物)是体内治疗活性化合物，而其中R1或R2或两者不为氢的化合物是其治疗活性二酸类似物的药物前体。其中R1或R2或两者不为氢的化合物在体内水解，以提供治疗活性的二酸类似物。在口服施用时，药物前体化合物特别是二酯药物前体，与二酸化合物(R1和R2均为氢)口服施用相比，提供二酸代谢物的改善生物利用度，但二酸化合物在静脉内、肌内或皮下施用时提供更好的活性。
在本发明的另一个方面，提供药物组合物，其包括与至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂相结合的式I化合物或其药学上可接受的盐。此外，本发明的这一方面提供药物组合物，其适用于治疗抑郁障碍，例如重性抑郁障碍(major depressive disorder)、单相抑郁症、心境恶劣、和/或循环型情感症，所述组合物包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、或稀释剂相结合的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明这一方面的再一实施方案提供药物组合物，其包括与至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂相结合的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐，和任选的其它治疗成分。本发明这一方面的又一实施方案中，药物组合物进一步包括第二种治疗剂，所述第二种治疗剂为有益于治疗抑郁障碍的药物，例如5-羟色胺再摄取抑制剂，例如氟西汀和/或西酞普兰。
在本发明这一方面的又一实施方案中，提供药物组合物，其适用于治疗过度嗜睡障碍，例如日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病和/或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡，所述组合物包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体、或稀释剂相结合的式I化合物或其药学上可接受的盐。
本发明也提供在哺乳动物中治疗抑郁障碍例如重性抑郁障碍(MDD)、单相抑郁症、心境恶劣、和/或循环型情感症的方法，其包括给需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在本发明这一方面的另一实施方案中，该方法进一步包括同时、分开或顺序组合地施用第二种治疗剂，所述第二种治疗剂为有益于治疗抑郁障碍的药物，例如5-羟色胺再摄取抑制剂，例如氟西汀和/或西酞普兰。
本发明的其它实施方案提供治疗过度嗜睡障碍的方法，其包括给需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的式I化合物或其药学上可接受的盐。在本发明这一方面的其它实施方案中，过度嗜睡是归咎于以下任何一种或多种：日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡。
在这些治疗方法的一个具体实施方案中，哺乳动物是人。
本发明也提供式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗。在此方面，本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗抑郁障碍。在进一步的实施方案中，抑郁障碍为任何一种的重性抑郁障碍(MDD)、单相抑郁症、心境恶劣、和/或循环型情感症。在本发明这一方面的另一实施方案中，本发明提供根据式I的化合物或其药学上可接受的盐，用于与5-羟色胺再摄取抑制剂例如氟西汀和/或西酞普兰同时、分开或顺序组合地治疗抑郁障碍。
另外，本发明的这个方面包括式I化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗过度嗜睡障碍。在本发明这一方面的具体实施方案中，过度嗜睡归咎于以下任何一种或多种：日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡。
本发明这一方面的一具体实施方案中，所述应用是在哺乳动物，尤其是人类。
本发明另一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗抑郁障碍的药物中的用途，所述抑郁障碍例如重性抑郁障碍(MDD)、单相抑郁症、心境恶劣、和/或循环型情感症。本发明这一方面的另一实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐和有益于治疗抑郁障碍的第二种治疗剂例如5-羟色胺再摄取抑制剂，例如氟西汀和/或西酞普兰在制备用于治疗抑郁障碍的药物中的用途。本发明的另一实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗过度嗜睡障碍的药物中的用途。在本发明这一方面的具体实施方案中，所述药物治疗以下任何一种或多种：日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病或与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡。
本发明化合物具有碱性和酸性部分，并因此与许多有机和无机的酸和碱反应以形成药学上可接受的盐。本发明各化合物的药学上可接受的盐旨在本申请的范围内。本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何盐，其对活生物体基本上是无毒的。这样的盐包括列在本领域技术人员已知的Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19 (1977)中的那些盐。
本发明优选种类的化合物为以下化合物，其中：
1) R1和R2均为氢；
2) R1或R2或两者不为氢；
3) R1和R2均不为氢；
4) R1和R2相同且不为氢；
5) R1和R2各自为异丙氧羰基氧基甲基；
6) n为2；
7) n为2，两个R3基团为氯，且氯基团在苯基的3-和4-位；
8) R4为羟基。
应当理解，进一步优选的化合物为将指定取代基上述的优选与其它取代基的优选进行组合的那些化合物。这样组合的实例包括但不限于以下优选种类的化合物：
9) 段落1-5(优选的R1和R2)任意一项的优选化合物，其中n为2，两个R3基团为氯，且氯基团在苯基的3-和4-位(段落7)；
10) 段落1-5(优选的R1和R2)任意一项的优选化合物，其中R4为羟基(段落8)；
11) 段落1-5(优选的R1和R2)任意一项的优选化合物，其中n为2，两个R3基团为氯，且氯基团在苯基的3-和4-位(段落7)，和其中R4为羟基(段落8)。
本发明特别优选的化合物为实施例中描述的那些化合物，包括它们的游离碱及其药学上可接受的盐。
一些优选的化合物是：
(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸或其药学上可接受的盐，和
(lR,2S,3S,4R,5S,6R)-4-氨基-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-2-羟基-双环[3.1.0]己烷-4,6-二甲酸二(异丙氧羰基氧基甲基)酯或其药学上可接受的盐(即实施例1、10和15的化合物及其替代选择的药学上可接受的盐)。
本文所用的缩写定义如下：
“BSA”是指牛血清白蛋白。
“DCG IV”是指(2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-二羧基环丙基)甘氨酸。
“DMEM”是指达尔贝科改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Minimum Eagle's Medium)。
“DMSO”是指二甲基亚砜。
“DPBS”是指杜伯科(Dulbecco)磷酸缓冲盐溶液。
“EDTA”是指乙二胺四乙酸。
“GTP”是指三磷酸鸟苷。
“HBSS”是指汉克(Hank)缓冲盐溶液。
“HEPES”是指4-(2-羟基乙基)-l-哌嗪乙磺酸。
“HPLC”是指高压液相色谱法。
“IBMX”是指3-异丁基-l-甲基黄嘌呤
“IC50”是指达到50％的最大抑制时的浓度。
“i.v.”是指静脉内的或由静脉内。
“i.p.”是指腹膜内的。
“L-AP-4”是指L-(+)-2-氨基-4-膦酰基丁酸。
“LC/MS”是指液相色谱法，随后质谱法。
“mFSTS”是指小鼠强迫游泳试验；抗抑郁活性的动物模型。
“MS”是指质谱法。
“MS (ES+)”是指使用电喷射离子化的质谱法。
“NMR”是指核磁共振。
“p.o.”是指口服。
“tBu”是指叔丁基部分。
一般化学
本发明化合物可以按照以下的合成方案由本领域中众所周知和理解的方法制得。这些方案步骤中合适的反应条件是本领域众所周知的，且溶剂和共-试剂(co-reagents)的适当替换是在本领域技能范围内的。同样，本领域技术人员应理解，合成的中间体在需要或想要时可以通过多种众所周知的技术进行分离和/或纯化，并可能经常会在随后的合成步骤中直接使用多种中间体，而很少或没有纯化。此外，技术人员应理解，在一些情况下，其中引入部分的顺序不是关键的。生产式I化合物所需步骤的特定顺序取决于所要合成的特定化合物、起始化合物、和取代基部分的相对倾向(liability)，这是熟练化学家很好理解的。除非另有说明，所有的取代基如先前所定义，和所有的试剂是本领域中众所周知和理解的。
药物前体化合物1可以如方案I中所示制得，其中R1、R2、R3、R4和n如先前所定义。化合物1中R1和R2不均为氢。
方案I
化合物1可以由方案I中所示的化学制得。化合物4与氨基保护试剂诸如二碳酸二叔丁酯在技术人员众所周知的条件下进行反应，以提供化合物3。当化合物2中的基团R1和R2相同时，化合物3与足量适当的碳酸氯-或碘甲基烷基酯和适当的试剂诸如碘化钠和碳酸铯在合适的溶剂诸如二甲基甲酰胺中进行反应，以得到所需的其中R1和R2相同的二酯化合物2。当化合物2中的基团R1和R2不同时，通过控制第一种碳酸氯甲基烷基酯的量至约1当量，可以首先将五元环上的羧酸转换为R2的单酯。R2的单酯化合物可以进一步与1当量的不同碳酸氯甲基烷基酯进行反应。然后可以将三元环上的游离羧酸基团转换为R1的酯，以提供所需的R1和R2不同的二酯。为了制备化合物2的五元环上的R2单酯，化合物3与约1当量的合适碳酸氯甲基烷基酯和适当的试剂诸如碘化钠和碳酸铯在适当的溶剂诸如二甲基甲酰胺中进行反应，以得到其中R1为氢的所需R2单酯化合物2。为了制备三元环上的R1单酯，五元环上的羧酸基团应首先被保护，因为它是更具反应性。更具体地，化合物3中五元环上的羧酸基团可以与α-氯-4-甲氧基甲苯、碘化钠和碳酸氢钠在适当的溶剂诸如二甲基甲酰胺中进行反应，以提供4-甲氧基苄基单酯。受保护的4-甲氧基苄基单酯化合物中三元环上的游离羧酸基团然后与合适的碳酸氯甲基烷基酯进行反应，以提供三元环上所需的R1酯。二酯与合适的酸诸如三氟乙酸进行反应，脱去4-甲氧基苄基和N-叔丁氧羰基两基团保护，以提供所需的R1单酯化合物1。化合物2，包括R2单酯和相同或不同R1和R2的二酯，然后用合适的酸如盐酸二噁烷溶液脱保护，得到所需的化合物1或其药学上可接受的盐。
方案II
活性母化合物4可以如方案II所示制得。
化合物9与甲磺酰氯和合适的碱诸如三乙胺在适当的溶剂诸如四氢呋喃中进行反应，得到甲磺酸酯化合物6。化合物6可以与硫醇杂环诸如lH-l,2,4-***-3-硫醇和适当的碱诸如碳酸钾在溶剂诸如二甲基甲酰胺中进行反应，以得到所需的化合物5，其中R4为所需的硫(thio)连接的杂环。化合物6也可以与叠氮化钠进行反应，以得到叠氮化物中间体，然后将其用三甲基膦在四氢呋喃和水进行还原，以提供胺。所得的胺可以用技术人员众所周知的方法进一步形成所需的酰胺或氨基甲酸酯，得到化合物5，其中R4为所需的酰胺或氨基甲酸酯基团。化合物5然后用合适的酸诸如盐酸或乙酸脱保护，得到化合物4。当化合物4中R4为羟基基团时，所需的活性母体化合物4可以直接由化合物7通过用合适的酸诸如HC1在适当的溶剂诸如二噁烷除去所有的保护基团制得。
方案III
两个关键中间体7和9可以如方案III中所示制备。
化合物14(合成细节参见WO03/104217/A2)用合适的还原试剂诸如三(仲丁基)硼氢化锂在合适的溶剂诸如四氢呋喃还原为化合物13。化合物13与甲磺酰氯和碱诸如三乙胺在合适的溶剂诸如四氢呋喃中进行反应，得到甲磺酸酯化合物12，将其进一步与四丁基氟化铵或叔丁醇钾在四氢呋喃中进行反应，得到化合物11。化合物11与OsO4、N-甲基吗啉-N-氧化物在丙酮和水中进行反应，得到二醇化合物10。化合物10然后与适当取代的苄基卤化物诸如3,4-二氯苄基溴化物在适当的溶剂诸如二甲基甲酰胺中使用四正丁基碘化铵和氧化银进行反应，以提供化合物9。在Mitsunobu反应条件下，化合物9与4-硝基苯甲酸、三苯基膦、和偶氮二甲酸二异丙酯在合适的溶剂诸如四氢呋喃中进行反应，以产生化合物8。化合物8然后与碳酸钾在适当的溶剂诸如甲醇中进行反应，以提供化合物7。
制备例1：(1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃向于四氢呋喃(43 1.35 mL)中的(lS,2S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(7.10 g，17.25 mmol，合成细节参见WO03/104217/A2)中，滴加1M 三(仲丁基)硼氢化锂的四氢呋喃溶液(42.27 mL，42.27 mmol)并搅拌。在90分钟后，在0℃下小心地加入1M碳酸氢钠水溶液(60.07 mL，62.11 mmol)，随后加入过氧化氢(30% wt，2.64 mL，86.27 mmol)。使反应升温至室温。40分钟后，将反应用乙酸乙酯萃取，用10％柠檬酸水溶液随后用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用5-50％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到标题化合物(6.70 g，16.20 mmol，94%)。
制备例2：(lS,2S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃下向于四氢呋喃(4.84 mL)中的(1S,2S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(400 mg，967 μmol)和三乙胺(472 μL，3.39 mmol)中，加入甲磺酰氯(224.61 μL，2.90 mmol)并搅拌。移去冷却浴，使反应升温至室温并搅拌过夜。用水和饱和碳酸氢钠水溶液稀释，然后用乙酸乙酯萃取。将合并后的有机物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到标题化合物(600 mg，1.22 mmol，100%)。
制备例3 ：(lS,2S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己-3-烯-2,6-二甲酸二叔丁基酯
向于四氢呋喃(2.03 mL)中的(lS,2S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(600.00 mg，1.22 mmol)中，加入1M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(3.84 mL，3.84 mmol)，并回流加热3小时。然后将反应冷却至室温，用水稀释，并用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用5-75％乙酸乙酯/己烷洗脱，，得到标题化合物(0.23 g，0.58 mmol，48%)。
制备例4：(1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3,4-二羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
向N-甲基吗啉-N-氧化物(2.43 g，17.97 mmol)、(lS,2S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己-3-烯-2,6-二甲酸二叔丁基酯(3.23 g，8.17 mmol)、丙酮(80.66 g，102.09 mL，1.39 mol)、和水(40.83 mL；40.83 g，2.27 mol)中，加入OsO4 (2.5%)的2-甲基-2-丙醇溶液(5.48 g，0.54 mmol)。在室温下搅拌。5小时后，将饱和的硫代硫酸钠水溶液(10 mL)加入到反应中。在减压下浓缩至一半体积。用水稀释浓缩物，用乙酸乙酯(3x50mL)萃取。将合并后的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用5-50％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到标题化合物(2.7g，6.3 mmol；77%)。
制备例5：(1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在室温下向于二甲基甲酰胺(17mL)中的(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3,4-二羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(1.22 g，2.84 mmol)、四正丁基碘化铵(1.07 g，2.84 mmol)、和氧化银(987.35 mg，4.26 mmol)中，加入3,4-二氯苄基溴(1.02 mL，1.02 g，4.26 mmol)。搅拌过夜。用二***和己烷(1：1)稀释，通过硅藻土过滤，然后用***和己烷(1：1)洗涤。滤液用水、盐水洗涤，经硫酸镁干燥，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用0-30％乙酸乙酯：己烷洗脱，得到标题化合物(1.7 g，2.84 mmol，78%)： MS (m/z)：610/612(M+Na)。
制备例6：(1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-{[(4-硝基苯基)羰基]氧基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在室温下向(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(14.20 g，24.13 mmol)和四氢呋喃 (241.28 mL，2.97 mol)中，加入三苯基膦(12.66 g，48.26 mmol)和4-硝基苯甲酸(8.19 g，48.26 mmol)。在冰浴中冷却该混合物。加入于四氢呋喃 (20mL)中的偶氮二甲酸二异丙酯(9.57 mL，9.76 g，48.26 mmol)，让反应混合物逐渐升温至室温过夜。用二***稀释，然后用碳酸钠水溶液洗涤。用二***再次萃取水层。合并所有的醚提取液，用水、盐水洗涤，经硫酸镁干燥，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用10-100%乙酸乙酯/己烷洗脱，得到标题化合物(9 g，12.2 mmol，51%)：MS (m/z)：759 (M+l)。
制备例7：(1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-{[(4-硝基苯基)羰基]氧基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(9.00 g，12.20 mmol)和甲醇(122.01 mL，3.01 mol)的溶液中，加入碳酸钾(5.11 g，36.60 mmol)，然后在室温下搅拌。1小时后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水(75mL)、盐水(75mL)洗涤，经硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱法纯化，用10-60%乙酸乙酯：己烷洗脱，得到标题化合物(5.3 g，9.01 mmol，74%). MS (m/z)：610/612(M+1)。
制备例8：(1S,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[((叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃向(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(2.00 g，3.40 mmol)、三乙胺(1.66 mL，1.20 g，11.89 mmol)、和四氢呋喃(33.98 mL，30.11 g，417.61 mmol)中，加入甲磺酰氯(0.841 mL，1.25 g，10.87 mmol)并搅拌。使反应逐渐升温至室温并搅拌过夜。用饱和碳酸氢钠水溶液稀释反应，然后用乙酸乙酯(3xl00mL)萃取。合并后的有机萃取液用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，然后在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物经快速色谱法纯化，用5-60％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物(1.40 g，2.10 mmol，62%)。
制备例9：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-(1H-1,2,4-***-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在室温向lH-l,2,4-***-3-硫醇(424.79 mg，4.20 mmol)和二甲基甲酰胺(10.50 mL，9.93 g，135.80 mmol)中，加入碳酸钾(1.45 g，10.50 mmol)并搅拌。5分钟后，向反应中加入(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(1.40 g，2.10 mmol)并在85℃搅拌。2天后，将反应冷却至室温，用饱和碳酸氢钠稀释，然后用乙酸乙酯(3X)萃取。将合并后的有机物用水、盐水洗涤，过滤，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物经快速色谱法纯化，用5-75％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物(978.0mg，1.46 mmol，69%)。MS (m/z)：671/669 (M-l)。
制备例10：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-(l,3-噻唑-2-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
该化合物基本上如制备例9中所述通过使用2-巯基噻唑制得。剩余物通过正相色谱法纯化，得到产率29％的标题化合物MS (m/z)：465 (M+l)。
制备例11：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(1-甲基-1,2,4-***-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在火焰干燥的烧瓶中将(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-( 1 H-1,2,4-***-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(0.60 g，0.893 mmol)溶于无水四氢呋喃(3.6 mL)，并冷却至-78℃。加入叔丁醇钾(0.80 g，0.893 mmol)，并搅拌15分钟。加入碘甲烷(0.127 g，0.893 mmol，通过碱性氧化铝过滤预处理)，并允许在-78℃下搅拌15分钟。使混合物升温至室温，然后在室温下搅拌30分钟。把粗反应混合物倒入水中，用1N HCl水溶液调节pH值至6，用乙酸乙酯萃取。经硫酸镁干燥有机层，过滤并在减压下并浓缩。通过反相快速色谱法(lOOg C18柱，洗脱用45-95％乙腈/水(两者均含0.1％三氟乙酸)，化合物在89％乙腈时洗脱)纯化。合并所需的级分，并用碳酸氢钠水溶液中和。用乙酸乙酯萃取，经硫酸镁干燥有机层，过滤并在减压下并浓缩，得到白色泡沫状的标题化合物(0.16 g，0.23 mmol，26%)： MS (m/z)：473/475/477 (M+l)。
制备例12：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-叠氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在85℃下，向于二甲基甲酰胺(254.90 mL，240.96 g，3.30 mol)中的(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(16.99 g，25.49 mmol)和15-冠-5(508.57 μL,，561.46 mg，2.55 mmol)中，加入叠氮化钠(8.29 g，127.45 mmol)并搅拌。7天后，将反应冷却至室温，然后用水稀释，并用乙酸乙酯(3X)萃取。合并后的有机物用水、盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到剩余物。剩余物通过快速色谱纯化，用2-60%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到标题化合物(11.2g，18.3mmol，72%). MS (m/z)：635/637 (M+l)。
制备例13：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-氨基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在室温下向于四氢呋喃(43.46 mL)和水(130.39 mL)中的(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-叠氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(8.00 g，13.04 mmol)中，加入1M三甲基膦的四氢呋喃溶液(19.56 mL，19.56 mmol)并搅拌过夜。向反应中加入饱和碳酸氢钠水溶液，然后用乙酸乙酯(3X)萃取。将合并后的有机物用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到标题化合物(7.42 g，12.63 mmol，97%)。MS (m/z)：609/611 (M+Na)。
制备例14：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃下向(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-氨基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(2.30 g，3.91 mmol)和三乙胺(709.32 μL，514.97 mg，5.09 mmol)于二氯甲烷(19.57 mL)的搅拌的冷却溶液中，加入乙酰氯(334.31 μL，368.75 mg，4.70 mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液，然后搅拌。90分钟后，用水稀释，用二氯甲烷(3X25mL)萃取。合并后的有机萃取液经硫酸镁干燥，过滤，并在减压下浓缩，得到标题化合物(2.40 g，3.81 mmol，97%)： MS (m/z)：653 (M+l)。
制备例15：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
该化合物基本上如制备例14中所述通过使用氯甲酸甲酯制备，得到产率88％的标题化合物。
制备例16：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(2-甲基-l,2,4-***-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
向(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(0.80 g，0.84 mmol)的二甲基甲酰胺(1.68 mL)的溶液中，加入2-甲基-lH-l,2,4-***-3-硫酮(0.126 g，1.09 mmol)和碳酸钾(0.35 g，2.52 mmol)。在80℃加热后2天，将溶液倒入盐水中，并用乙酸乙酯提取三次，合并后的有机相用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，经快速色谱法纯化，用10％乙酸乙酯/CH2Cl2洗脱，得到油状标题化合物(0.576 g，0.84 mmol，100%)。MS (m/z)：685/687/689 (M+l)。
制备例17：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-(lH-咪唑-2-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
该化合物基本上如制备例20中所述通过使用(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲磺酰)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯制得。通过快速色谱法纯化，用30-50％乙酸乙酯：己烷洗脱，得到产率为38％的标题化合物。MS (m/z)：671/673/675 (M+l)。
制备例18：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-[(2-乙酰氧基乙酰基)氨基]-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯
在室温下向(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯(0.47 g，0.89 mmol)和二异丙基乙胺 (0.32 mL，1.83 mmol)的二氯甲烷(9 mL)溶液中，加入乙酰氧基乙酰氯(0.116 mL，1.08 mmol)。2.5小时后，溶液用饱和NaHCO3溶液(2x)、盐水(lx)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并在减压下浓缩。通过快速色谱法纯化，用0至100％乙酸乙酯的己烷溶液的梯度在30分钟内洗脱，得到白色固体的标题化合物(0.43 g，0.68 mmol，76%)。MS (m/z)：531 (M+H-BOC)。
制备例19：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(2-羟基乙酰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
在室温下向(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-[(2-乙酰氧基乙酰基)氨基]-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二乙酯(0.42 g，0.67 mmol)的四氢呋喃(7.0 mL)溶液中，加入1M氢氧化锂水溶液(4.0 mL，4.0 mmol)并搅拌过夜。用5N HCl水溶液酸化反应至pH约为1。用乙酸乙酯(3 x 25 mL)萃取。将合并的有机层干燥，过滤，和在减压下浓缩。粗反应混合物的HPLC分析显示存在起始原料。向粗反应混合物的四氢呋喃(7.0 mL)溶液中，加入1M的氢氧化锂水溶液(4.0 mL，4.0 mmol)并在50℃下加热。17小时后，用5N HCl水溶液酸化反应至pH约为1。用乙酸乙酯(3 x 25 mL)萃取。将合并的萃取物干燥，过滤，和在减压下浓缩。在40分钟内使用95%水(含0.03％的HCl)/5%乙腈至5%水(含0.03％的HCl)/95%乙腈的梯度，经制备反相高效液相色谱法纯化，提供白色固体的(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(2-羟基乙酰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(0.181 g，0.34 mmol，51%)。MS (m/z)：531 (M-H)。
制备例20：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
将(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(2g，5.32 mmol)溶于二噁烷(10. 63 mL)，然后用饱和碳酸氢钠水溶液(10.63 mL，6.90 mmol)和二碳酸二叔丁酯(5.80 g，26.58 mmol)处理。在室温下搅拌该两相混合物18天，然后浓缩以除去溶剂。将所得剩余物溶于乙腈(添加1N HCl)中，并提取两次，以除去二碳酸二叔丁酯。浓缩乙腈层。将所得剩余物溶于乙酸乙酯中，然后用1N HC1洗涤两次，用盐水洗涤一次，经硫酸钠干燥，并浓缩至干，得到标题化合物(2.1 g，4.41 mmol，83%)。MS (m/z)：474 (M-l)。
制备例21：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
该化合物基本上如制备例20中所述通过使用(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸制备，得到产率为74％的标题化合物。MS (m/z)：515/517 (M-l)。
制备例22：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯
向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(1.89 g，3.96 mmol)的二甲基甲酰胺(23.3 mL)的溶液中，加入碳酸氯甲基异丙基酯(1.27 g，8.33 mmol)、碘化钠(59.4 mg，0.396 mmol)和碳酸铯(2.84 g，8.72 mmol)。在氮气氛下室温搅拌混合物过夜。用乙酸乙酯和水稀释反应混合物。分离各层。用乙酸乙酯萃取水层两次。用盐水萃取合并的有机层，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。经快速色谱法纯化剩余物，用0到75％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱，得到泡沫状的标题化合物(940 mg，1.33 mmol，33%)。MS (m/z)：732 (M+Na)。
制备例23-26的化合物可以基本上如制备例22中所述制得： 
制备例编号 化学名称 结构 产率(％) 物理数据MS(m/z)
23 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(乙氧基羰基)氧基]甲基}酯 58 702(M+Na)
24 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(环丙基羰基)氧基]甲基}酯 55 694/696(M+Na)
25 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(2-甲基丙酰基)氧基]甲基}酯 49 698/700(M+Na)
26 (lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二[(乙酰基氧基)甲基]酯    
实施例1：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2 6-二甲酸
向水(30.02 mL)和乙酸(30.02 mL)中加入(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(5.30 g，9.01 mmol)。在回流下加热反应，直到起始原料完全消耗。冷却并用旋转蒸发器浓缩。用二***磨碎浓缩物，收集沉淀物，然后在真空烘箱中干燥，得到标题化合物(3.30 g，8.77 mmol，97%)。MS (m/z)：376/378 (M+1)。
实施例2-3的化合物可以基本上如实施例1中所述制得： 
实施例编号 化学名称 结构 产率(％) 物理数据MS(m/z)
2 (lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-(1H-1,2,4-***-3-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸 81 MS(m/z)：459/461(M+l)
3 (lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-(l,3-噻唑-2-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸 73 MS(m/z)：475/477(M+l)
实施例4：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
将(1S,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(2.40 g，3.81 mmol)加至乙酸(7.99 g，7.62 mL，133.05 mmol,)和水(3.81 mL，3.81 g，211.60 mmol)中，并在微波炉中加热至140℃。15分钟后，冷却至室温，加水稀释，过滤收集固体。用水(2x50mL)和二***(2x50mL)连续洗涤固体，然后在真空烘箱中干燥，得到标题化合物(1.23 g，2.95 mmol，77%)： MS (m/z)：417/419 (M+l)。
实施例5：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
该化合物基本上如实施例4中所述通过应用(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(甲氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸制得。产率81%。MS (m/z)：433/435 (M+l)。
实施例6：(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(l-甲基-lH-l,2,4-***-5-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐
在微波容器中向(lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(2-甲基-l,2,4-***-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(0.305 g，0.445 mmol)中加入乙酸(2.0 mL)和水(2.0 mL)，密封并加热混合物至140℃下进行25分钟。冷却并浓缩混合物至干，然后加入5N盐酸(2mL)、乙腈(2 mL)，并转移到小瓶中。冻干过夜，得到白色固体的标题化合物(0.227 g，0.445 mmol；95%)：MS (m/z)：473/475/477 (M+l)。
实施例7-8可以基本上如实施例6中所述制得： 
实施例编号 化学名称 结构 产率(％) 物理数据MS(m/z)
7 (lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(l-甲基-l,2,4-***-3-基)硫烷基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐 91 473/475/477 (M+l).
8 (lR,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-(lH-咪唑-2-基硫烷基)双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐 88 458/460/462 (M+l)
实施例9：(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-[(羟基乙酰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐
向(lS,2R,3R,4S,5R,6S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3-[(3,4-二氯苯基)甲氧基]-4-[(2-羟基乙酰基)氨基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸(0.032 g，0.06 mmol) 于水(0.3 mL)中的混合物中，加入4N 氯化氢(3.0 mL，12.0 mmol)的1,4-二噁烷溶液。在烧结漏斗上用乙腈和二***洗涤固体。用乙腈和二***依次洗涤固体，然后在真空烘箱中50℃进一步干燥过夜，提供白色固体的标题化合物(0.018 g，0.04 mmol，65%)。MS (m/z)：433 (M+H)。
实施例10：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯盐酸盐
在4.0M氯化氢的二噁烷溶液(14.47 mL，57.87 mmol)中，加入(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯，并搅拌45分钟。加入乙酸乙酯，浓缩反应混合物至成泡沫。用乙酸乙酯磨碎泡沫，以产生固体。浓缩并在真空下40℃干燥过夜，提供灰白色固体的标题化合物(1.77 g，2.75 mmol，95%)：MS (m/z)：608 (M+H)。
实施例11-14可以基本上如实施例10中所述制得： 
实施例编号 化学名称 结构 产率(％) 物理数据MS(m/z)
11 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(乙氧基羰基)氧基]甲基}酯盐酸盐 97 608 (M+H)
12 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(2-甲基丙酰基)氧基]甲基}酯盐酸盐 73 575/577(M+H)
13 (lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二{[(环丙基羰基)氧基]甲基}酯盐酸盐 97 572/574(M+H)
14 (lS,2R,3R,4S,5R,6S)-4-(乙酰基氨基)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二[(乙酰基氧基)甲基]酯盐酸盐 82 561/563(M+H)
实施例15：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯盐酸盐
步骤1：(lS,2S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-羟基-双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃氮气下向(lS,2S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(lOOOg，2.43mol)的无水四氢呋喃(lOL)的溶液中，滴加1M 三(仲丁基)硼氢化锂的四氢呋喃溶液(2.67L，2.67mol)。在0℃2小时后，在0℃2小时内加入2M Na2CO3水溶液(850g，8.02mol)，随后加入35%过氧化氢(740mL，8.99mol)水(3.3L)溶液。40分钟后，使混合物升温环境温度，随后分离有机相。有机相用甲基叔丁基醚(3.5L)稀释，再次分离各层。将水相用甲基叔丁基醚(3.5L)萃取。所有合并的有机相接连用1M的Na2SO3水溶液(2.67L)、水(2.67L)、和盐水(2.67L)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩至体积为3L。过滤析出的固体，用庚烷(1.3L)洗涤，得到标题化合物(864.76g)。将母液浓缩至干，剩余物用庚烷(500mL)研磨并过滤，得到另外的标题化合物(130.64g，总995.4g，产率99%)。 MS (m/z)：436 (M+23)。
步骤2：(lS,2S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己-3-烯-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在0℃N2下向(2S,4S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(995.4g，2.41mol)的无水四氢呋喃(8.4 L)溶液中，经40分钟逐滴加入三乙胺(735 mL，5.30 mol)。在0℃50分钟内加入甲磺酰氯(373mL，4.82mol)。使反应升温到23℃。3小时后，将反应如果过滤以除去三乙胺盐酸盐。用无水四氢呋喃(2x2L)洗涤滤饼。将滤液(13 L)分成两个相等的部分。在15℃下向一半的滤液，以前步骤中得到的溶液(粗制的V=6.5 L，1.2 mol)中，经2小时15分钟滴加入1M叔丁醇钾的四氢呋喃溶液(3.6 L，3.6 mol)，然后允许升温至23℃。2小时30分钟后，通过倒入10％乙酸水溶液(950mL)，将反应淬灭。分离各层，用乙酸乙酯(1.7 L)萃取水层。合并有机层，真空浓缩得到固体，将其溶于丙酮(1.45 L)中，加入水(7.3 L)。在23℃下搅拌所得的悬浮液过夜。滤出沉淀物，用水2x1 L)洗涤，在真空烘箱中40℃下干燥，得到标题化合物(450.67g，产率95%)。MS (m/z)：418 (M+23)。
步骤3：(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3,4-二羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在23℃下向N-甲基吗啉-N-氧化物的水合物(101.62 mL；114.83 g，424.78 mmol)、N-甲基吗啉-N-氧化物的水合物(116.88 g，864.74 mmol)、4-甲基吗啉-4-氧化物(198.88 mL；195.50 g，1.67 mol)、和(lS,2S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己-3-烯-2,6-二甲酸二叔丁基酯(600.00 g，1.52 mol)于丙酮(12.00 L)和水(1.80 L)的溶液中，加入四氧化锇(4% wt/wt水溶液，231.78 mL，241.05 g，37.93 mmol,)。在23℃下搅拌该混合物过夜。薄层色谱法(己烷/乙酸乙酯3:2；染色：PMA)分析反应混合物表明(lS,2S,5R,6S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]双环[3.1.0]己-3-烯-2,6-二甲酸二叔丁基酯被完全消耗掉。反应用Na2S2O3饱和水溶液(1 L)淬灭，并用甲基叔丁基醚(15 L)萃取。将有机相用由37％盐酸水溶液(300 mL)和盐水(1.2 L)制备的水溶液(1.5 L)洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。剩余物在庚烷(1.5 L)中浆化，过滤，用庚烷(2 x 500 mL)洗涤，得到固体。该固体在真空下干燥，得到标题化合物(450g，69%产率)。
步骤4：(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在室温下向(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3,4-二羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(450 g，1.05 mol)于二氯甲烷(4.50 L)的溶液中，依次加入3,4-二氯苄基溴(144.73 mL，238.80 g，995.32 mmol)、四正丁基氯化铵(58.24 g，209.54 mmol)、和50％ wt/wt氢氧化钠的水溶液(829.80 mL，15.72 mol)。7小时后，用水(1 L)稀释反应，分离各相。用盐水(500 mL)提取有机相，经无水MgSO4干燥，过滤，浓缩。剩余物经色谱法(2.5 kg SiO2；洗脱剂：己烷/乙酸乙酯12:1～0:1)纯化，得到标题化合物(539 g，72%产率)。
步骤5：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-{[(4-硝基苯基)羰基]氧基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
向(lS,2R,3S,4R,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(539.00 g，751.00 mmol)于四氢呋喃 (6.76 L)的溶液，加入三苯基膦(393.96 g，1.50 mol)和4-硝基苯甲酸(251.02 g，1.50 mol)。将混合物冷却至10℃，随后在15分钟内逐滴加入偶氮二甲酸二异丙酯(40% v/v甲苯溶液，744.41 mL，759.30 g，1.50 mol)，允许升温至23℃。在l8小时后，将混合物用甲基叔丁基醚(2 L)稀释，依次用NaHCO3饱和水溶液(2 x 2 L)和盐水(1 L)洗涤，并在真空下浓缩。在40℃下将剩余物在庚烷(5 L)中浆化30分钟，然后冷却至23℃。将得到的固体滤出，依次用庚烷(2 x 500 mL)、庚烷/甲基叔丁基醚(3 x 1 L)洗涤。将合并的滤液在真空浓缩，剩余物经色谱法(2.5 kg Si02；洗脱剂：己烷/乙酸乙酯95:5～75:25)纯化，随后在庚烷(10 L/kg)中重结晶，得到白色固体的标题化合物(273g，49%产率)。
步骤6：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯
在环境温度下向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-{[(4-硝基苯基)羰基]氧基}双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(273.00 g，370.11 mmol)于甲醇(3.28 L)的悬浮液中，加入碳酸钾(153.45 g，1.11 mol)。16小时后，将反应在真空浓缩。将剩余物溶于甲基叔丁基醚(2 L)，用水(0.8 L)、随后用盐水(0.8 L)洗涤，经MgSO4干燥，并在真空中浓缩，得到白色固体的标题化合物(215g，98%产率)。
步骤7：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐
向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二叔丁基酯(215 g，365.3 mmol)于1,4-二噁烷(73.1 mL)的悬浮液中，加入水(430 mL)和37％HCl水溶液(299.9 mL，3.65 mol)的混合物。将所得浆料在100℃下搅拌4.5小时，冷却到25℃，并在真空中浓缩，得到白色固体。依次用甲基叔丁基醚(2 L)和己烷(2 L)研磨，然后过滤收集固体。真空下干燥16小时。固体再用甲基叔丁基醚(2 x 1 L)和己烷(1 L)洗涤，然后在真空下50℃干燥过夜，得到白色固体的标题化合物(140.4 g，93%产率)。MS (m/z)：376/378 (M+l)。
步骤8：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸
在环境温度下向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸盐酸盐(140 g，339 mmol)于1,4-二噁烷(203.56 mL)和水(0.6 mL/mmol-纯-LR，203.56 mL)的悬浮液中，依次加入三乙胺(212.80 mL，154.49 g，1.53 mol)和2-(叔丁氧基羰基氧亚氨基-2-苯乙腈(125.33 g，508.90 mmol)。4.5小时后，向反应中加入另外的2-(叔丁氧基羰基氧亚氨基-2-苯乙腈(25.07 g，101.78 mmol)和三乙胺(23.64 mL，17.17 g，169.63 mmol)，并在50℃搅拌过夜。冷却至23℃，用水(500 mL)稀释，并用甲基叔丁基醚(6 x 500 mL)洗涤。用10％HC1水溶液(300 mL；最终的pH = 2)稀释水相，用乙酸乙酯(2 x 500 mL)提取。乙酸乙酯萃取液经MgSO4干燥，真空浓缩，得到标题化合物(148.3g，92 %产率)。
步骤9：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯
在23℃下向(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯(148.30 g，311.35 mmol)于二甲基甲酰胺(2.49 L)的溶液中，依次加入碳酸钾(172.12 g，1.25 mol)、碳酸氯甲基异丙基酯(118.03 mL；135.73 g，871.79 mmol)和碘化钠(9.33 g，62.27 mmol)。搅拌18小时。用甲基叔丁基醚(2 L)和水(2 L)稀释。分离各层，依次用水(200 mL)和盐水(200 mL)洗涤有机相。经无水MgSO4干燥，过滤并在真空至浓缩。剩余物经色谱法(2.5 kg SiO2；洗脱剂：己烷/乙酸乙酯3:1～1:1)纯化，得到标题化合物(167g，76% 产率)：MS (m/z)：608/610 (M-100 (-C02tBu))。
步骤10：(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(l-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯
在23℃将(1S,2R,3S,4S,5R,6R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(1-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯(165.50 g，233.58 mmol)用4M HCl的1,4-二噁烷(1.16 L，4.63 mol)处理，并搅拌2小时。在真空下除去挥发物。得到的剩余物在甲基叔丁基醚(1200 mL)浆化过夜。将得到的固体滤出，用甲基叔丁基醚(2 x 100 mL)洗涤，在真空1 mbar/45℃下干燥6小时，得到白色固体的标题化合物(134g，89%产率)。MS (m/z)：608/610 (M+l)。
文献数据(Witkin，Jeffrey M.，和Eiler，William J. A. (2006)，Antagonism of Metabotropic Glutamate Group II Receptors in the Potential Treatment of Neurological and Neuropsychiatric Disorders. Drug Development Research vol 67，pg. 757-769；以及Yasuhara，Akito 和Chaki，Shigeyuki，(2010) Metabotropic Glutamate Receptors：Potential Drug Targets for Psychiatric Disorders，The Open Medicinal Chemistry Journal，vol. 4，pg. 20-36。)和在非临床动物研究中产生的数据支持mGlu2/3拮抗剂在治疗抑郁障碍和过度嗜睡障碍中的作用。具体来说，发现mGlu 2/3受体拮抗剂在抑郁障碍的啮齿类动物模型中是有效的，并促进用EEG监测啮齿类动物的觉醒而没有不相称的或临床相关的活动过度或压倒性的代偿性嗜睡症。增强的警觉性表现在提高的注意力、改善的认知性能、和可能降低的疲劳。如前所述障碍表示常见共病的临床情况，mGlu2/3受体拮抗剂可特别有效于特定患者种群，诸如重性抑郁障碍、难治性抑郁症(treatment refractory depression)、单相抑郁症、心境恶劣和/或循环型情感症、或任何过度嗜睡障碍的患者。过度嗜睡障碍可以包括但不限于日间过度嗜睡(EDS)、与阻塞性睡眠呼吸暂停或嗜眠发作有关的睡眠过度、昼夜节律睡眠障碍(包括但不限于倒班工作睡眠障碍、时差障碍、睡眠相位延迟障碍、睡眠时相提前障碍、和非24小时睡眠-觉醒综合症)、特发性嗜睡病和与非恢复性睡眠(NRS)有关的过度嗜睡。
为了进一步证实本发明化合物的特性，代表性的化合物可以在以下体外和体内测定中运行：
mGlu2和mGlu3受体cAMP拮抗测定
拮抗活性在稳定表达人mGlu2或mGlu3受体和大鼠谷氨酸转运蛋白EAAT 1(兴奋性氨基酸转运蛋白1)的重组AV12细胞中进行测定。细胞系通过在DMEM中培养进行维持，所述DMEM含有高葡萄糖和盐酸吡哆醇，并补充5％透析的胎牛血清(FBS)、1 mM丙酮酸钠、1 mM HEPES和1 mM L-谷氨酰胺；遗传霉素和潮霉素B被用作为选择的抗生素。融合培养是生长在37℃、含6.5％CO2的气氛中，且是双周传代的。细胞用0.25％胰蛋白酶收集，以107cells/ml悬浮于冷冻介质(含10％DMSO的FBS)，并等分保存于液氮中。在测定前二十四小时，将细胞以每孔8,000-10,000细胞的密度接种至组织培养处理过的、96-孔、半区黑色的板(Costar 3875)，并在50 μl DMEM中，其含有高葡萄糖和吡哆醇并补充有5％透析的胎牛血清、1 mM丙酮酸钠、1 mM HEPES、100 μg/ml氨苄青霉素、和250 μΜ (mGlu2)或125 μΜ (mGlu3)的L-谷氨酰胺。
使用均相时间分辨荧光技术(HTRF；Cisbio cat # 62AM4PEB)测量测试化合物对毛喉素(forskolin)刺激cAMP生产量的抑制逆转。除去培养基，并在37℃下将细胞用100 μl cAMP刺激的缓冲液(STIM)孵育30分钟。(STIM缓冲液包含500 ml HBSS、1000 ml DPBS、0.034 % BSA、1.67 mM HEPES和500 μΜ IBMX (Sigma 15879)。)使用3X系列稀释，随后进一步40倍稀释到STIM缓冲液中，以10-点的浓度响应曲线测试化合物。DCG IV(Tocris 0975)用作参考激动剂。最终的反应混合物含有1 μΜ(对于mGlu2)和3 μΜ(对于 mGlu3)的毛喉素(Sigma F6886)、其EC90的DCG IV、和高达25 μΜ测试化合物。细胞在37℃孵育20分钟。为了测量cAMP水平，在室温将cAMP-d2结合物和抗cAMP-穴状化合物结合物在裂解缓冲液中与处理过的细胞一起孵育1小时(mGlu2)或1.5小时(mGlu3)。HTRF信号应用EnVision读板仪(Perkin-Elmer)检测，以计算665～620 nM的荧光比率。使用各实验产生的cAMP标准曲线，将原始数据转化为cAMP的量(pmol/孔)。使用四-参数的对数曲线拟合程序(ActivityBase V5.3.1.22)，根据浓度响应曲线从顶端到底部的范围，计算相对的IC50值。
mGlu受体选择性的FLIPR和cAMP测定
本发明化合物对其他的人mGlu受体的相对拮抗效力可以用cAMP测定或荧光钙反应(fluorometric calcium response)测定(参见例如Fell等，JPET (印刷中))进行评价。简而言之，这些研究使用个体AV12细胞系，其含有大鼠EAAT1谷氨酸转运蛋白和稳定表达的人mGlul、2、3、4、5、6、和8受体。mGlu1和5受体是Gq-偶联的，所以它们通过磷脂酶C自然地发信号，产生钙通量响应，这可使用荧光成像板阅读器(Fluorometric Imaging Plate Reader)(FLIPR，Molecular Devices)测量受体的激活作用。表达mGlu2、3、4、和8受体的细胞系意在表达Gαl5亚单位，以使这些Gi-偶联的受体产生类似mGlul和5受体表达细胞系的钙通量响应。mGlu6受体使用类似于上述mGlu2和mGlu3开发的方法在cAMP形式中进行测试。这些细胞系如前所述进行维持，除了L-谷氨酰胺的量和选择的试剂(遗传霉素、潮霉素B、博莱霉素(zeocin)、和杀稻瘟菌素)可依赖细胞系而变化。融合培养是双周传代的。
依赖于细胞系，在测试化合物和氟-3 AM(Invitrogen)或钙4(Molecular Devices)染料加入之前和之后，使用FLIPR监测细胞内钙水平。在测定前24小时，依赖于细胞系以多种浓度的谷氨酰胺和多种密度的每孔细胞，接种细胞。除去培养基，并在25℃将细胞用8μΜ染料(每孔50 μl)孵育90或120分钟(依赖于细胞系)。对于激动谷氨酸所产生11-点浓度响应曲线的单一添加的FLIPR测定，在各实验之前进行，以确认细胞的适当灵敏度。结果使用GraphPad Prism v4.03进行分析，以计算引起EC90(拮抗剂测定)和EC10(增强剂测定)响应所需谷氨酸的浓度。
在两种添加的FLIPR测定中，使用10-点的浓度响应测线，对于激动剂测定以终浓度25μΜ以及对于增强剂和拮抗剂测定以终浓度12.5 μΜ开始，在各个mGlu受体中对化合物进行测试。第一种添加检测任何激动剂活性，和第二种添加包括100 μl产生EC10或EC90谷氨酸响应所选谷氨酸在试验缓冲液中的浓度(依赖于细胞系)。激动剂效应按照相对最大谷氨酸响应由化合物单独诱导的刺激百分数进行定量化。拮抗剂效应通过计算由化合物引起的EC90谷氨酸响应的抑制百分数进行定量化。增强效应按照在谷氨酸中EC10响应存在下相对ECmax响应的增加百分数进行定量化。使用四-参数的对数曲线拟合程序(ActivityBase v5.3.1.22)，计算所有数据相对的IC50或EC50值。
以类似于上述mGlu2和mGlu3活性的方法，除了参考激动剂为L-AP4(Tocris)外，使用cAMP在mGlu6细胞中测量了拮抗剂活性。为了测量mGlu6的激动活性，计算化合物抑制毛喉素-刺激cAMP产生量的程度。使用四-参数的对数曲线拟合程序(ActivityBase v5.3.1.22)，根据浓度响应曲线从顶端到底部的范围，计算相对的IC50和EC50值。
示例的其中R1和R2均为氢的化合物基本上按上所述进行测试，并发现其对mGlu2和mGlu3受体具有高的拮抗效力。还发现，示例的其中R1和R2均为氢的化合物相对其他mGlu受体亚型是mGlu2和mGlu3受体的选择性拮抗剂，对mGlu2和mGlu3受体分别具有IC50小于70 nM和50 nM，而对其他测试的mGlu受体的IC50被发现是显著更大的。见表1。
另外，本发明的一些化合物显示出对其他生理学上重要的受体缺乏显著的活性，所述受体例如但不限于hERG通道、5-羟色胺受体(特别是5-HT2A和5-HT2B)、毒蕈碱受体(特别是M2)、和iGluR受体(特别是iGluR5)。实施例1的化合物使用已知测定方法进行了测试，并发现对这些受体没有可察觉到的活性。
因此，生理学上相关剂量的本发明化合物预期在体内提供mGlu2和mGlu3受体基本上的抑制，而与其他mGlu受体或其他生理上相关的受体基本上不发生相互作用，因此预期提供所需的药理学，同时避免与脱离靶标活性相关的不良效应。
小鼠中强迫游泳试验(mFST)
在体内抗抑郁活性测定中建立了mFST(Li等. J Pharmacol Exp Ther. 319(l)：254-9，2006.)。用已知的临床上有效的抗抑郁药(选择性5-羟色胺再摄取抑制剂和/或三环类抗抑郁药)处理的小鼠在被放在水槽中后，表现出减少的不动消耗时间(reduced time spent immobile)的行为(与绝望相关的行为)。mFST基本上如在以前发表的方法(参见例如Li等. J Pharmacol Exp Ther. 319(l)：254-9，2006.)所述，用于评估新颖的mGlu2/3拮抗剂的潜在抗抑郁样活性。简言之，使用体重25-30g的雄性NIH-瑞士小鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis，IΝ)。在测试前将群居动物从动物饲养所移到测试区域它们自己的笼子里，并允许适应新的环境至少1小时。将其中R1和R2均为氢的化合物与为溶解添加最小量的NaOH一起溶于水，且i.p给药。在使用当天将其中R1和/或R2不为氢的化合物在2.0-2.5% N-甲基-吡咯烷酮中制备，然后悬浮在1% HEC、0.25%吐温80、和0.05%道康宁(Dow)消泡剂中，且口服给药。将小鼠放在装有6cm的水(22-25℃)的圆筒(直径：10 cm；高：25 cm)中6分钟。对测试6分钟期间的最后4分钟中的不动持续时间进行评分。当漂浮不活动或只做保持其头在水面上必需的那些运动时，小鼠被记录为不动。
代表性的化合物基本上如上所述进行了测试，并发现在野生型小鼠中显著减少不动时间。见表2。因此，本发明化合物预期具有体内抗抑郁活性。
见表2. mFST 
实施例 ED60 (mg/kg) 最大减少(1-化合物/对照)*100%
1 1.0 (i.p.) 59%
2 2.08 (i.p.) 62%
3 8.2 (i.p.) 47%
4 9.5 (i.p.) 38%
5 7.45 (i.p.) 56%
6 7.3 (i.p.) 47%
7 >10 (i.p.) 18%
8 9.1 (i.p.) 41%
9 9.68 (i.p.) 41%
10/15 22.1 (p.o.) 50.5%
11 51.5 (p.o.) 32.9%
12 >28 (p.o.) 7%
13 11.3 (p.o.) 62.8%
在其他的实验中，对受体删除的小鼠(mGlu2敲除的小鼠)进行了研究；这些小鼠通过杂合子x杂合子繁殖进行繁殖，并用作同胞仔-/-和+/+小鼠对比(Taconic Farms)。发现实施例1的化合物(lOmg/kg，i.p.,30分钟之前)显著降低mGlu2+/+小鼠的不动时间，但没有显著降低mGlu2-/-的不动时间。同样地，发现实施例10/15的化合物(30 mg/kg，po，120分钟之前)降低mGlu2+/+小鼠的不动时间，但没有降低mGlu2-/-的不动时间。这些发现进一步证明，mGlu2受体促成本发明化合物的抗抑郁样作用。
也可以测试本发明的化合物在与用于治疗抑郁障碍的其它化合物例如SSRI的组合中提高超过任一化合物单独抗抑郁样作用的能力。实施例10的化合物(17 mg/kg p.o.)在小鼠强迫游泳试验中进行了单用和与氟西汀(10 mg/kg，i.p.)组合的测试，如下表3中所示，发现了显著增加的超过任一化合物单独的抗抑郁样作用。此外，实施例10化合物的活性二酸部分(即作为实施例1的游离碱的相同化合物)的脑和血浆水平的测试显示没有增加暴露水平，这支持增加抗抑郁样活性的发现不仅仅是由于增加化合物的中枢暴露。
表3. 对于SSRI的mFST 
化合物 不动时间(秒) 平均标准误差 最大减少(1-化合物/对照)*100%
溶媒 174 10  
实施例10 105 12 24.5%
氟西汀 161 8 7.6%
实施例10+氟西汀 66 19 62.1%
大鼠的觉醒和行为监测：本发明的代表性化合物在大鼠中测试了其增加觉醒状态中的时间数量而没有不良效应诸如抑制REM睡眠、觉醒运动损害(不相称的过多或过少的运动)、和/或反弹性睡眠过度的能力。试验动物通过脑电图(EEG)、肌电图(EMG)和运动进行连续监测，以测量累计的清醒时间、反弹性睡眠过度、和觉醒期间的自主活动(locomotor activity)强度。这样研究的方法是本领域中已知的(参见例如以下所述的方法：Edgar DM，Seidel WF. Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat. J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997；283：757-769；van Gelder RN，Edgar DM，Dement WC. Real-time automated sleep scoring：validation of a microcomputer-based system for mice. Sleep 1991，14：48-55；和Gross BA，Walsh CM，Turakhia AA，Booth V，Mashour GA，Poe GR. Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats. J Neurosci Methods. 2009；184(1)：10-8.)研究如下进行：
动物准备。对成年雄性Wistar大鼠(手术时约270-300 g)如下进行手术以适合EEG、EMG、体温、和运动的长期记录：对大鼠进行手术，以配置包括4个用于EEG记录的不锈钢螺丝(两个正面[前囟前面3.9 mm，和±2.0 mm中侧]和两个枕骨[前囟后面6.4 mm，±5.5 mm中侧])的颅植入物，和两个用于EMG记录的特氟隆涂层的不锈钢丝(置于颈背梯形肌肉下)。手术前将所有导线焊接到微型连接器(Microtech，Boothwyn，PA)。通过不锈钢EEG记录螺丝、植入连接器和头盖骨之间所用的氰基丙烯酸酯、和牙科丙烯酸的组合，将植入部件固定到头盖骨。体温和自主活动经由手术置入腹部的微型传感器(Minimitter PDT4000G，Philips Respironics，Bend，OR)进行监测。恢复允许至少3个星期。
记录环境。每只大鼠各自居住在小隔离(microisolator)笼中，该笼用***的聚碳酸酯过滤器-顶冒口(filter-top riser)进行改良，以允许更多的垂直高空。将最低程度限制移动的软电线一端连接到固定至笼顶部的转换器并将另一端连接到动物的颅植入物。每个笼位于不锈钢睡眠-觉醒记录室分开的通风间隔中。食物和水可随意食用，环境温度保持在约23±1℃。在整个研究过程中使用荧光灯保持24小时明暗周期(明暗12：12)。平均相对湿度约50％。在每次治疗前和后，至少30小时不干扰动物。
研究设计和给药。将其中R1和R2均为氢的化合物与为溶解添加最小量的NaOH一起溶于水，并以每kg体重1.0 mL的体积i.p给药。其中R1和/或R2不为氢的化合物在以下两种替代选择的溶媒之一中以每kg体重2 mL的体积p.o.给药：i) 在羟乙基纤维素中的2.5% N-甲基-2-吡咯烷酮；或ii)在水中的含0.05%道康宁(Dow Corning?)消泡剂10% ***胶。将溶媒或一种化合物的剂量水平伪随机地施用，使得大鼠没有接收相同的两次治疗，且在任一项研究中大鼠没有接收两次以上的8天治疗。每只大鼠从笼子里取出约一分钟，以称重和治疗。进行至少6天的“冲洗”期，随后进行每次治疗。
数据收集。睡眠与觉醒的辨别可以是自动的(如Van Gelder等.1991；Edgar等.1997，Winrow等，2010；Gross等，2009)。EEG被放大和滤过(X10,000，通带1-30 Hz)，EMG被放大和整合(通带10-100 Hz，RMS积分(integration))，和非特异性的自主活动(LMA)被同时监控。觉醒状态以10秒时期分类为非REM睡眠、REM睡眠、觉醒、或θ-为主的觉醒。自主活动(LMA)以每分钟计数记录，并通过市售的遥测接收器(ER4000，Minimitter，Bend，OR)进行检测。
统计分析。年龄和体重通过治疗组的平均值、最小值和最大值进行总结。具有至少一种结果的所有动物均包括在总结果中(例如，我们包括遥测数据是有用的但无EEG数据的动物治疗的适当数据)。治疗后观察期分成2个给药后的时间间隔(首先7个小时，和首先19个小时)，其中给药时间被定义为起始小时=0。结果在各时期内通过计算各时期的每小时平均或累计值进行总结。各时期的每种结果通过协方差分析进行分析，所述协方差分析应用治疗组和治疗日期作为因素以及相应治疗前的时间间隔(24小时前)作为协变量。对于每个治疗组，根据溶媒平均值调整的平均值和变化及其相应的标准误差进行总结。在各时期对于每种结果显示出调整的Dunnett多重比较P值。如表1中所示，并非所有时期内的所有结果都进行了分析，这从而影响实验上的I型错误率。因此，对于多重测试没有进行进一步的调整。
确定效能。阈值有效剂量按照最低剂量进行估计，所述最低剂量在治疗后首先7小时内相对溶媒对照其清醒累积时间超过50分钟。通过围绕有效剂量更加接近的间隔剂量进行后续研究，可以进行更精细的确定。
确定不良效应。评估尤其两种潜在的不良效应：反弹性嗜睡症和加强的自主活动(Edgar DM，Seidel WF，1997)。
(i) 反弹性嗜睡症可以在有效治疗剂量后8-19小时期间内测量到觉醒的降低水平。生物学上的显著降低被定义为大于50％的首先7小时内的累计增加。因此，如果在首先7小时内觉醒增加了100分钟，那么相对溶媒对照治疗后8-19小时期间内累计觉醒50分钟或以上的降低被视为生物学上的显著意义。组的平均变化，如表2所示，显示缺乏反弹嗜睡症。
(ii) 加强的自主活动被定义为相对溶媒对照在有效阈值剂量时EEG-定义的觉醒每分钟超过5次LMA计数的平均增加，且该结果剂量相关的。表2中组的平均增加都在觉醒每分钟5次计数以下，且不是剂量依赖性的。
示例化合物基本上如所述一样进行了测试，发现其促进觉醒而无显著反弹性嗜睡症或加强的自主活动。其中R1和R2均为氢的示例化合物(i.p.给药)基本上如所述一样进行了测试，发现其在剂量为10 mg/kg或更低时是有效的。实施例10的化合物基本上如所述一样进行了测试，发现其具有如表4中所示的累计时间的清醒特性和自主活动强度。
表4.
首先7小时内清醒的累积时间
剂量(mg/kg PO) N 平均值 SE P
60 9 64.7 13.9 <0.0001
30 8 48.8 14.4 0.0019
10 10 20.4 13.4 0.1387
8-19小时内清醒的累积时间
剂量(mg/kg PO) N 平均值 SE P
60 9 34.7 12.4 0.0087
30 8 25.6 13.6 0.0696
10 10 15.2 12.3 0.2257
自主活动强度(注释1)
剂量(mg/kg PO) N 平均值 SE P
60 6 4.2 2.0 0.0427
30 5 0.5 2.1 0.8199
10 6 2.7 2.0 0.1999
结果统计：平均值表示与溶媒对照的差异。SE=平均值的标准误差；P =根据效能变量多重对比调整的P值。未经调整的P值显示为'不良效应'的量度(8-19小时内清醒的累积时间、及自主活动强度)。清醒的累积时间以分钟给出。注释1.自主活动(LMA)强度=治疗后首先7小时内平均的EEG-定义觉醒的每分钟LMA计数。
虽然在本发明的方法中可直接而不以任何制剂地施用所用的化合物，但所述化合物通常以药物组合物的形式施用，所述药物组合物包括至少一种式I化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。这些组合物可通过多种途径包括口服、皮下、静脉内、和肌内给药。这样的药物组合物及其制备方法在本领域中是众所周知的。例如参见，Remington：The Science and Practice of Pharmacy (University of the Sciences in Philadelphia，ed.，第21版，Lippincott Williams & Wilkins Co.，2005)。其中R1和/或R2不为氢的式I化合物优选口服给药，以提高生物利用度，而其中R1和R2均为氢的式I化合物优选i.v.或i.p.给药。
组合物优选配制成单位剂量形式，各剂量包含约1至约600mg，更通常地约30至约300mg，例如约50～约250 mg的活性成分。术语“单位剂量形式”是指物理上分离的单位，适合作为人受试者和其它哺乳动物的单一剂量，各单位包含经计算能产生所需治疗效果的预定量的活性物质，以及至少一种适当的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
式I的化合物通常在很宽的剂量范围是有效的。例如，每天的剂量通常落在约0.01至约10 mg/kg，更通常落在约0.3至5.0 mg/kg,例如0.5～3.0 mg/kg体重的范围内。在一些情况下，剂量水平在上述范围的下限以下可能是相当足够的，而在另一些情况下，可以应用更大的剂量而不引起任何有害的副作用，因此，上述剂量范围并不旨在以任何方式限制本发明的范围。应当理解，化合物实际给药的量将由医生根据相关情况来确定，包括要治疗的状况、给药所选择的途径、实际给药的一种或多种化合物、个体患者的年龄、体重和反应、以及患者症状的严重程度。

Claims (13)

1.下式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1和R2各自独立为氢、C1-C3烷氧基羰基氧基甲基、C1-C3烷基羰基氧基甲基、或C3-C6环烷基羰基氧基甲基；
R3在每次出现时独立为甲基、氟或氯；
R4为羟基、甲基羰基氨基、羟基甲基羰基氨基、甲氧基羰基氨基、咪唑-2-基硫烷基、噻唑-2-基硫烷基、l,2,4-***基硫烷基、1-甲基-l,2,4-***-3-基硫烷基、或1-甲基-l,2,4-***-5-基硫烷基；和
n为1或2。
2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中n为2，两个R3基团为氯，且氯基团在苯基的3-和4-位。
3.根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自为氢。
4.根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2均不为氢。
5.根据权利要求1或2的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2相同且不为氢。
6.根据权利要求5的化合物，其中R1和R2各自为异丙氧羰基氧基甲基。
7.根据权利要求1的化合物，其为(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1的化合物，其为(lS,2R,3S,4S,5R,6R)-2-氨基-3-[(3,4-二氯苄基)氧基]-4-羟基双环[3.1.0]己烷-2,6-二甲酸二({[(1-甲基乙氧基)羰基]氧基}甲基)酯或其药学上可接受的盐。
9.药物组合物，其包括根据权利要求1～8任何一项的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。
10.药物组合物，其包括根据权利要求1～8任何一项的化合物或其药学上可接受的盐，和5-羟色胺再摄取抑制剂，以及至少一种药学上可接受载体或赋形剂。
11.权利要求10的药物组合物，其中5-羟色胺再摄取抑制剂是氟西汀。
12.根据权利要求1～8任何一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗抑郁障碍的药物中的用途。
13.根据权利要求1～8任何一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗过度嗜睡障碍的药物中的用途。
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