TWI564300B

TWI564300B - 經取代之［（５Ｈ－吡咯［２，１－ｃ］［１，４］苯二氮呯－１１－基）哌嗪－１－基］－２，２－二甲基丙酸化合物作為雙重活性Ｈ１反向促進劑／５－ＨＴ2Ａ拮抗劑

Info

Publication number: TWI564300B
Application number: TW101102371A
Authority: TW
Inventors: 安瑪莉肯普; 彼得泰德加拉格; 亞當珍恩珊德森; 安德魯詹姆斯雷爵德; 大衛安德魯寇特
Original assignee: 美國禮來大藥廠
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-01-20
Publication date: 2017-01-01
Also published as: DK2683719T3; EA022708B1; EP2683719B1; AU2012214788A1; US20120202797A1; SI2683719T1; CY1116206T1; BR112013019996A2; CN103391940A; KR20130103617A; AR084867A1; PL2683719T3; MX2013008786A; ES2539502T3; CN103391940B; HRP20150469T1; US8314092B2; JP5805215B2; KR101549315B1; CA2826757C

Description

經取代之[(5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸化合物作為雙重活性H1反向促進劑/5-HT 2A 拮抗劑

組織胺在多種生理過程中經由其與至少四種不同G蛋白偶合受體H1-H4受體之相互作用而起重要作用。在CNS中，H1受體在睡眠調節循環中起重要作用且已知H1拮抗劑/反向促進劑會誘發嗜眠。

同樣，血清素在多種生理過程中經由其與至少十四種不同G蛋白偶合受體之相互作用而起重要作用。CNS中5-HT_2A受體之調整在睡眠調節循環中起重要作用且5-HT_2A拮抗劑已顯示改良具有失眠症之患者的慢波睡眠及睡眠維持。

具有H1或5-HT_2A反向促進劑或拮抗劑活性之化合物已用於治療失眠症(分別例如多慮平(doxepin)及曲唑酮(trazodone))且已在動物睡眠研究中顯示出顯著藥理學作用。然而，當前不能購得任何選擇性雙重活性H1/5-HT_2A反向促進劑/拮抗劑。

US 4,192,803描述某些經取代之4-(5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪基化合物用作抗精神病藥及精神安定藥。

本發明提供對於H1受體具有高反向促進劑效能及對於5-HT_2A受體具有高拮抗劑效能的經取代之(5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸化合物之家族。特定言之與其他組織胺受體、血清素受體及其他生理學相關受體相對照，特定言之與5-HT_2C受體、GABA_A受體、蕈毒鹼受體、多巴胺激導性受體、腎上腺素激導性受體及hERG通道相對照，某些本發明化合物亦對H1及5-HT_2A受體具選擇性。某些化合物亦已經由動物模型展示其可適用於治療以不良睡眠維持為特徵之睡眠障礙。因而，咸信本發明化合物適用於治療以不良睡眠潛伏期或不良睡眠維持或兩者為特徵之睡眠障礙，諸如治療失眠症，諸如慢性或暫時性原發性失眠症、或慢性或暫時性繼發性失眠症、或兩者。繼發性失眠症之實例包括(但不限於)與抑鬱症(例如重度抑鬱症、心境惡劣及/或循環性情感症)相關之失眠症、與焦慮症(例如廣泛性焦慮症及/或社交恐懼症)相關之失眠症、與疼痛(例如肌肉纖維疼痛、慢性骨或關節疼痛(諸如與發炎性關節炎或骨關節炎相關)或糖尿病性神經痛)相關之失眠症、與過敏性反應(例如過敏性氣喘、搔癢、鼻炎、充血等)相關之失眠症、肺或氣管病症(例如與阻塞性睡眠呼吸暫停、反應性氣管疾病等)相關之失眠症、與精神病症、癡呆及/或神經退化性疾病相關之失眠症、及/或與晝夜節律睡眠障礙(例如輪班工作睡眠障礙、時差障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及非24小時睡眠-覺醒症候群等)相關之失眠症。

此外，當與選擇性血清素再吸收抑制劑共投與時，某些本發明化合物展示其對於非快速動眼睡眠(NREM sleep)及睡眠維持之作用有增強。

本發明提供式I化合物：其中R¹為氯基或甲基；R²為甲基、乙基、異丙基、氯基、溴基、三氟甲基或甲硫基；且R³為氫或甲氧基；或其醫藥學上可接受之鹽。

在本發明之另一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。此外，本發明之此態樣提供一種適用於治療失眠症(諸如以睡眠潛伏期延長或不良睡眠維持或兩者為特徵之失眠症，諸如原發性失眠症、時差、輪班工作睡眠障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及/或非24小時睡眠-覺醒障礙)之醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑之組合。

本發明之此態樣之另一實施例提供一種醫藥組合物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與至少一種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑及視情況選用之其他治療成分的組合。在本發明之此態樣之又一實施例中，醫藥組合物進一步包含第二治療劑，其為血清素再吸收抑制劑，諸如西酞普蘭(citalopram)、帕羅西汀(paroxetine)、氟西汀(fluoxetine)及/或氟戊肟胺(fluvoxetine)。

本發明亦提供一種治療哺乳動物之失眠症(諸如以睡眠潛伏期延長或不良睡眠維持或兩者為特徵之失眠症，諸如原發性失眠症、時差、輪班工作睡眠障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及/或非24小時睡眠-覺醒障礙)之方法，其包含投與需要該治療之哺乳動物有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在本發明之此態樣之另一實施例中，該方法進一步包含以同時、單獨或連續組合形式投與第二治療劑，該第二治療劑為血清素再吸收抑制劑，諸如西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀及/或氟戊肟胺。在此等治療方法之一個特定實施例中，哺乳動物為人類。

本發明亦提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於治療。在此態樣內，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療失眠症。在其他實施例中，失眠症特徵在於睡眠潛伏期延長或不良睡眠維持或兩者，諸如原發性失眠症、時差、輪班工作睡眠障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及/或非24小時睡眠-覺醒障礙。在此態樣之另一實施例中，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其與血清素再吸收抑制劑(諸如西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀及/或氟戊肟胺)同時、單獨或連續組合用於治療失眠症。本發明之此態樣之一個特定實施例，在哺乳動物、尤其人類中使用。

本發明之另一態樣提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用以治療失眠症(諸如以睡眠潛伏期延長或不良睡眠維持或兩者為特徵之原發性失眠症，諸如原發性失眠症、時差、輪班工作睡眠障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及/或非24小時睡眠-覺醒障礙)之藥劑。本發明之此態樣之另一實施例提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽及第二治療劑之用途，其用於製造用以治療失眠症(諸如以睡眠潛伏期延長或不良睡眠維持為特徵之失眠症，諸如原發性失眠症、時差、輪班工作睡眠障礙、睡眠相位後移障礙、睡眠相位前移障礙及/或非24小時睡眠-覺醒障礙)之藥劑，該第二治療劑為血清素再吸收抑制劑，諸如西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀及/或氟戊肟胺。

為了清楚起見，將在本申請案通篇中使用以下三環結構編號：

本發明化合物具有鹼性及酸性部分，且因此可與大量有機及無機酸及鹼反應形成醫藥學上可接受之鹽。本發明之各化合物的醫藥學上可接受之鹽涵蓋於本申請案之範疇內。如本文中所用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指對活的生物體實質上無毒的本發明化合物之任何鹽。該等鹽包括在Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)中列出之鹽，該等鹽為熟習此項技術者已知。

本發明化合物之較佳類別為如下化合物，其中：1)R³為氫；2)R³為甲氧基；3)R¹為氯基；4)R¹為甲基；5)R¹為氯基且R³為氫；6)R¹為甲基且R³為氫；7)R²為甲基、乙基或異丙基；8)R²為甲基；9)R²為氯基或溴基；10)R²為氯基；11)R²為三氟甲基；且12)R²為甲硫基。

應瞭解，其他較佳化合物為組合上述對於既定取代基之較佳選擇與其他取代基之較佳選擇的化合物。該等組合之實例包括(但不限於)以下較佳類別之化合物：13)較佳類別7至12(其為對於R²之較佳選擇)中任一者之較佳化合物，其中R³為氫(較佳類別1)；14)較佳類別7至12(其為對於R²之較佳選擇)中任一者之較佳化合物，其中R¹為氯基且R³為氫(較佳類別5)；及15)較佳類別8之較佳化合物，其中R³為甲氧基(較佳類別2)。

特定較佳化合物為實例中所述之化合物，包括其游離鹼及其醫藥學上可接受之鹽。

一種特定較佳化合物為：3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸或其醫藥學上可接受之鹽(亦即實例1之化合物及其醫藥學上可接受之鹽)。

本文中所用之縮寫係如下定義：

「BSA」意謂牛血清白蛋白。

「DCG IV」意謂(2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-二羧基環丙基)甘胺酸。

「DCM」意謂二氯甲烷。

「DMEM」意謂達爾伯克氏最低伊格爾氏培養基(Dulbecco's Minimum Eagle's Medium)。

「DMSO」意謂二甲亞碸。

「DPBS」意謂達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)。

「DSC」意謂差示掃描熱量測定。

「EtOAc」意謂乙酸乙酯。

「GC」意謂氣相層析。

「HBSS」意謂漢克氏緩衝鹽溶液(Hank's Buffered Salt Solution)。

「HEPES」意謂4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸。

「HPLC」意謂高壓液相層析。

「hr.」或「h」意謂小時。

「IBMX」意謂3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。

「IC₅₀」意謂達成最大抑制作用之50%時的濃度。

「i.v.」意謂靜脈內或經靜脈內。

「i.p.」意謂腹膜內。

「LC-MS」意謂HPLC-質譜分析。

「MeOH」意謂甲醇。

「mFST」意謂小鼠強迫游泳測試；用於抗抑鬱活性之動物模型。

「min.」或「m」意謂分鐘。

「mp」意謂熔點。

「MS」意謂質譜分析。

「MS(ES+)」意謂使用電噴霧電離之質譜分析。

「MTBE」意謂甲基第三丁基醚。

「NMR」意謂核磁共振。

「p.o.」意謂口服，經口。

「SCX-2」意謂Biotage Isolute Flash SCX-2®強陽離子交換管柱。

「THF」意謂四氫呋喃。

通用化學

可藉由此項技術中熟知且瞭解之通用方法根據以下合成流程製備本發明化合物。適用於此等流程之步驟的反應條件為此項技術中所熟知且溶劑及輔試劑之適當替代在此項技術之技能範圍內。同樣，熟習此項技術者應瞭解，合成中間物可視需要或必要時藉由各種熟知技術來分離及/或純化，且常常可能在後續合成步驟中幾乎不純化而直接使用各種中間物。此外，熟習此項技術者應瞭解，在一些情況下，引入各部分之順序並不關鍵。如熟練化學工作者所充分瞭解，製備本發明化合物所需之步驟之特定順序取決於所合成之特定化合物、起始化合物及經取代部分之相對可靠性。除非另外指明，否則所有取代基係如先前所定義，且所有試劑為此項技術中所熟知及瞭解。

一般而言，式I化合物可由Pg為適合羧基保護基之式II化合物製備(流程1)。更特定言之，Pg為C₁-C₃烷基之式II化合物在有機共溶劑(諸如異丙醇)中與適合去保護劑(諸如氫氧化鈉水溶液)反應，在用酸中和之後，提供式I化合物。

一般而言，式II化合物可由式III化合物或式IV化合物製備(流程2)。更特定言之，式III化合物在適合溶劑(諸如甲氧基苯或二氯甲烷)中與磷醯氯反應以提供氯化亞胺中間物。氯化亞胺可經分離或在適合鹼(諸如碳酸鉀)存在下直接與丙酸Pg-2,2-二甲基-3-哌嗪-1-基酯反應以提供式II化合物。反應係在適合溶劑(諸如乙腈)中進行。或者，氯化亞胺可在適合鹼(諸如碳酸銫)存在下與哌嗪反應以提供式IV化合物。反應係在適合溶劑(諸如乙腈)中進行。式IV化合物在適合還原劑(諸如三乙醯氧基硼氫化鈉)存在下用Pg-2,2-二甲基-3-側氧基丙酸酯烷基化而提供式II化合物。反應通常係在溶劑(諸如二氯甲烷)中進行。

式III化合物可由R⁴為甲基或乙基之式V化合物製備(流程3)。更特定言之，式V化合物與適用於還原芳基硝基為相應苯胺之試劑反應。適合還原劑包括在過渡金屬催化劑 (諸如鉑)存在下之氫；於乙酸中之鐵；及於鹽酸中之二氯化錫。相應苯胺可首先被分離或在環化條件下直接反應以提供式III化合物。環化係在酸(諸如鹽酸)或鹼(諸如第三丁醇鉀)存在下進行。R⁴為甲基或乙基之式V化合物可如製備中所述或藉由製備結構上類似的化合物之化學技術中已知之程序來製備。

在以下說明性製備及實例中，試劑係自多種商業來源獲得。溶劑通常係在減壓下(蒸發)移除。在一些程序中，所指示之產率為藉由蒸發或過濾來分離且未經進一步純化即直接使用之產物的代表性粗產率。

製備1

合成2,2-二甲基-3-側氧基-丙酸甲酯

在0℃下添加3-羥基-2,2-二甲基丙酸甲酯(33 g，250 mmol)至懸浮於DCM(1000 mL)中之戴斯-馬丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)(106 g，250 mmol)中，且在室溫下攪拌18小時。經由矽藻土床過濾反應混合物且濃縮濾液。用戊烷洗滌濃縮濾液(2×200 mL)。分離戊烷層且在真空中濃縮，得到2,2-二甲基-3-側氧基-丙酸甲酯(31.93 g，定量)。 ¹H NMR(d₆-DMSO)δ 9.59(s,1H),3.67(s,3H),1.26(s,6H)。

製備2

合成4-(3-甲氧基-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯

在室溫下攪拌2,2-二甲基-3-側氧基-丙酸甲酯(30.88 g，237.31毫莫耳)及哌嗪-1-甲酸第三丁酯(34.00 g，182.55毫莫耳)於DCM(500 mL)中之溶液20分鐘。經0.5小時相繼添加乙酸(2當量；20.92 mL，365.09毫莫耳)及三乙醯氧基硼氫化鈉(1.4當量；54.17 g，255.56毫莫耳)，且在室溫攪拌所得混合物隔夜。以水(250 mL)小心地淬滅且轉移混合物至具有DCM(300 mL)之分液漏斗。用鹽水洗滌所得有機層。經MgSO₄乾燥，過濾且蒸發，得到4-(3-甲氧基-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯(58 g，100%)。MS(m/z)：301.2(M+1)。

製備3

合成2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二鹽酸鹽

經15分鐘向4-(3-甲氧基-2,2-二甲基-3-側氧基丙基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯(58.0 g，193.08毫莫耳)於異丙醇(150 mL)中之溶液添加4 M氯化氫之二噁烷溶液((4當量)；193.08 mL，772.31毫莫耳)，觀測到氣體逸出及細沈澱物。在55℃下加熱3小時，得到白色沈澱物。冷卻至10℃且藉由過濾收集白色固體，再用異丙醇(30 mL)、隨後EtOAc洗滌。在45℃下在真空烘箱中乾燥1小時，得到2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二鹽酸鹽(31 g，59%產率)。MS(m/z)：=201.1(M+1)。

製備4

合成2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯鹽酸鹽

溶解2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二鹽酸鹽(112.0 g，409.95毫莫耳)於水(250 mL)中。添加固體碳酸氫鈉以得到pH值為4之水層且萃取混合物至10% DCM於***中之溶液(300 mL)中以移除一些暗色固體物質及一些顏色。棄去有機層。用2 M氫氧化鈉水溶液鹼化水相至pH值8，隨後用固體氯化鈉使其飽和。萃取至10%異丙醇於氯仿中之溶液中。再添加2 M氫氧化鈉水溶液以維持pH值為8。重複萃取至10%異丙醇於氯仿中之溶液中。繼續萃取過程直至預期物質之85%得到回收。用鹽水洗滌異丙醇於氯仿中之溶液，經Na₂SO₄乾燥，過濾且蒸發，得到2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯鹽酸鹽(82.1 g%產率)。MS(m/z)：201.1(M+1)。

製備5

合成4-乙烯基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯

藉由用氮氣吹掃10分鐘來脫氣4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(2.0 g，9.8毫莫耳)、三乙烯基硼氧雜環己烷吡啶(triethenylboroxin pyridine)(1.3當量；3.1 g，12.7毫莫耳)及碳酸鉀(3當量；4.1 g，29.4毫莫耳)於1,4-二噁烷(20 mL)及水(10 mL)之混合物中的溶液。添加參(二亞苄基丙酮基)雙鈀(Pd₂(dba)₃)(0.01當量；0.0925 g，98.0微莫耳)及1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵(dtbpf)(0.03當量；0.0853 g，294.1微莫耳)且在95℃下加熱3小時。冷卻至室溫，隨後分配於水(50 mL)與己烷/***之1：1混合物(100 mL)之間。用水(2×50 mL)、隨後鹽水洗滌有機層。經Na₂SO₄乾燥，過濾且蒸發，得到呈淡黃色油狀物之4-乙烯基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1.5 g)。未經進一步純化即使用。1H-NMR(CDCl₃),δ：8.90(1H,br.s),7.02(1H,m),6.95(1H,m),6.56(1H,q)5.48(1H,dd),5.05(1H,dd),3.86(3H,s)。

製備6

合成4-乙基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯

向500 mL帕爾瓶(Parr bottle)饋入5%鈀/木炭(0.2 g)於乙醇(25 mL)中之混合物且添加4-乙烯基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1.4 g，9.3毫莫耳)。在206.8 kPa下氫化3小時，藉由 LC-MS得知完全轉化。經矽藻土過濾且蒸發得到油狀物。與異己烷/乙酸乙酯(100：0至75：25)一起通過矽膠墊，得到呈淺黃色油狀物之標題化合物(1.12 g)。1H-NMR(CDCl₃),δ：8.87(1H,br.s),6.73-6.78(2H,m),3.83(3H,s),2.50(2H,q,J=7.8Hz)及1.19(3H,t,J=7.3Hz)。

製備7

合成4-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯

混合4-碘-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(1.5 g，5.98毫莫耳)、4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧硼(3.01 g，17.98毫莫耳)、1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵(dtbpf)(0.3 g，0.06毫莫耳)、參(二亞苄基丙酮基)雙鈀(Pd₂(dba)₃)(0.3 g，0.06毫莫耳)、磷酸三鉀(2.54 g，11.95毫莫耳)及甲醇(12 mL)。在140℃下在微波中在密封管中加熱混合物30分鐘。冷卻，過濾反應混合物且用甲醇洗滌燒結濾器，在減壓下蒸發濾液且在二氧化矽上層析，以異己烷/二氯甲烷溶離(梯度溶離，100：0至0：100)。蒸發含有產物之溶離份，得到4-(丙-1-烯-2-基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。(0.679 g，68.79%產率)。MS(m/z)：166.1(M+1)。

製備8

合成3-甲氧基-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

添加硫酸二甲酯(3 mL，3.99 g，31.63毫莫耳)至3-羥基-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(3.5 g，20.69毫莫耳)及2 M氫氧化鈉(75 mL，1500毫莫耳)之混合物中且在室溫下(應用水冷卻浴)劇烈攪拌反應混合物30分鐘。收集所得沈澱物且用水洗滌。再添加硫酸二甲酯(3 mL，3.99 g，31.63毫莫耳)至濾液中且攪拌30分鐘。收集所得沈澱物且用水洗滌。再添加硫酸二甲酯(3 mL，3.99 g，31.63毫莫耳)至濾液中且攪拌1小時。合併經分離之沈澱物且在真空烘箱中在50℃下乾燥30分鐘，得到3-甲氧基-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(3.221 g，84.98%產率)。MS(m/z)：184.09(M+1)。

製備9

合成1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

劇烈攪拌2-(溴甲基)-4-氯-1-硝基-苯(25.02 g，99.88毫莫耳)於DCM(200 mL)中之溶液，且向此添加4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(15 g，97.92毫莫耳)於DCM(200 mL)中之溶液。隨後添加30水合之氫氧化四正丁銨(0.508 g)且使用外部冰浴在氮氣下冷卻所攪拌之混合物至5℃。經15分鐘逐滴添加25%氫氧化鈉水溶液(200 mL)，觀測到內部溫度上升至10℃。攪拌且升溫至室溫。在室溫下攪拌3.5小時。再添加50%氫氧化鈉水溶液(20 mL)且再在室溫下攪拌1小時。停止攪拌且使各層分離。轉移至分液漏斗且用1 N鹽酸(200 mL)洗滌有機層，使用試紙觀測到此層之pH值為酸性。隨後用水(600 mL)及隨後鹽水(600 mL)洗滌有機層且最終經Na₂SO₄乾燥。過濾混合物且在40℃下在真空中移除溶劑，得到橙色油狀物。藉由與異己烷/乙酸乙酯(10%至20%梯度溶離)一起通過矽膠墊來純化，得到呈黃色油狀物之1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(33 g，定量)。MS(m/z)：322.98(M+1)。

製備9替代方案

合成1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

在氮氣氛圍下在攪拌下添加碳酸銫(96 g，295毫莫耳)至4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(30 g，196毫莫耳)於DMF(240 mL)中之溶液中且加熱反應混合物至40℃至45℃持續1小時。冷卻反應混合物至室溫且逐滴添加2-(溴甲基)-4-氯-1-硝基-苯(54 g，216毫莫耳)於DMF(120 mL)中之溶液。攪拌所得懸浮液1.5小時至2.0小時，過濾固體且用DMF(45 mL)沖洗濾餅。轉移固體至清潔反應容器，添加水(200 mL)且在攪拌下冷卻懸浮液至10℃至15℃持續1小時至2小時。過濾懸浮液，以水(75 mL)沖洗且轉移固體至另一個反應容器。添加乙醇(125 mL)且在5℃至10℃下攪拌懸浮液1小時至2小時。過濾固體，用乙醇(20 mL)沖洗濾餅，且在減壓下在低於50℃下在烘箱中乾燥固體，得到呈黃色固體之1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(54 g，94.1%純度，73.3%產率)。

製備10

合成4-溴-1-(5-氯-2-硝基苄基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

用少量異己烷(×2)洗滌60%礦物油懸浮氫化鈉(1.2當量；1.1 g，27.52毫莫耳)。懸浮於N,N-二甲基乙醯胺(15 mL)中且在冰浴中冷凍。經15分鐘逐份添加4-溴-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(5.0 g，22.93毫莫耳)，使氣體逸出在添加之間消退。在室溫下攪拌15分鐘，得到棕色溶液。經15分鐘逐份添加2-(溴甲基)-4-氯-1-硝基-苯(1.15當量；6.61 g，26.37毫莫耳)且在室溫下攪拌所得紫色溶液2.5小時。在冰浴中冷卻且以水(10 mL)淬滅。分配於1 M鹽酸(100 mL)與EtOAc(300 mL)之間。用水(2×100 mL)、隨後鹽水洗滌有機層。經Na₂SO₄乾燥且用活性炭脫色。經矽藻土過濾且蒸發，得到呈橙色油狀物之4-溴-1-(5-氯-2-硝基苄基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(9.1g，定量)。1H-NMR(CDCl₃)δ：8.12(1H,d),7.40(1H,dd),7.07(1H,d),6.92(1H,d),6.53(1H,d),5.87(2H,s),4.17(2H,q),1.25(3H,t)。

以下化合物基本上藉由製備10之方法製備。

製備22

合成1-(2-胺基-5-氯苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

將5%鉑(S)/炭(2.5 g)及1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(16.0 g，49.57毫莫耳)饋入至500 mL帕爾瓶中。添加乙醇(200 mL)，隨後添加二溴化鋅(0.22當量；2.46 g，10.91毫莫耳)且置放混合物於275.8 kPa之氫氣下且在室溫下氫化隔夜，監測到形成部分氫化中間物。移除帕爾瓶，在水浴中緩和地加熱以溶解結晶物質，且經矽藻土過濾。與來自相同操作之濾液合併且蒸發，得到1-(2-胺基-5-氯苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯灰白色固體。置放於高真空下以移除殘餘乙醇，得到物質(35 g，定量)。MS(m/z)：293.1(M+1)。

製備22替代方案

合成1-(2-胺基-5-氯苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

在氮氣下於反應容器中饋入1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(100.0 g，310毫莫耳)於THF(800 mL)中之溶液且在室溫下在攪拌下添加二溴化鋅(0.22當量；15.4 g，68.4毫莫耳)。饋入5%鉑(S)/炭(13.3 g)於THF(25 mL)中之漿液，且置放容器於380 kPa之氫氣下。在室溫下氫化30小時至40小時，監測到形成部分氫化中間物且經矽藻土過濾。用THF(300 mL)沖洗助濾器且在低於40℃下濃縮濾液以達到約200 mL之體積。添加DCM(250 mL)，在低於40℃下濃縮溶液，達到約200 mL之體積，且再添加DCM(600 mL)。可視需要重複此過程以自反應混合物移除非期望含量之THF。饋入水(500 mL)，分離各層，且用水(300 mL)，隨後用氯化鈉之25%水溶液(250 mL)洗滌有機層。在40℃下濃縮溶液，達到約200 mL之體積，添加庚烷(400 mL)，且在低於40℃下濃縮溶液，達到約200 mL之體積。添加庚烷(400 mL)且在攪拌下加熱反應混合物至40℃至45℃持續2小時至3小時。冷卻反應混合物至5℃至10℃且在此溫度下繼續攪拌1小時至2小時。過濾所得固體且在減壓下在烘箱中在低於50℃下乾燥，得到呈黃色固體之1-(2-胺基-5-氯苄基)-4-甲基-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(81.4 g，95.8%純度，85.9%產率)。

以下化合物基本上藉由製備22之方法製備。

製備26

合成1-(2-胺基-5-氯苄基)-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸乙酯

在70℃下經0.5小時向經充分攪拌之4-溴-1-(5-氯-2-硝基苄基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(9.1 g，23.48毫莫耳)於乙酸(60.00 mL)中之溶液逐份添加鐵(5當量；6.56 g，117.38毫莫耳)。在添加中途，觀測到在移除油浴的情況下維持溫度為85℃之放熱。反應混合物將隨著放熱分散而變得更稠且可添加剩餘鐵。在85℃下攪拌0.5小時。冷卻至室溫且傾於水(200 mL)上。萃取至氯仿(2×200 mL)中。合併有機層且用水(2×100 mL)、隨後用飽和NaHCO₃水溶液洗滌。經Na₂SO₄乾燥，過濾且蒸發為呈橙色油狀物之標題化合物(7.7 g，92%產率)。MS(m/z)：358.98(M+1)。

以下化合物基本上藉由製備26之方法製備。

製備32

合成7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮

經10分鐘向1-[(2-胺基-5-氯-苯基)甲基]-4-甲基-吡咯-2-甲酸乙酯(35 g，119.55毫莫耳)於二甲亞碸(120 mL)中之溶液添加第三丁醇鉀(14.76 g，131.5毫莫耳)。在80℃(油浴溫度)下加熱1小時。使其冷卻，隨後傾於水(400 mL)上。藉由過濾收集所得棕色粉末固體，用水充分洗滌。抽吸燒結濾器至儘可能乾燥，隨後轉移至盤且在真空烘箱中在55℃下經五氧化二磷乾燥隔夜，得到7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(22 g，91%)。MS(m/z)：247.1(M+1)。

製備32替代方案

合成7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮

向1-[(2-胺基-5-氯-苯基)甲基]-4-甲基-吡咯-2-甲酸乙酯(20 g，68.3毫莫耳)於二甲亞碸(60 mL)中之溶液添加於DMSO(40 mL)中之第三丁醇鉀(8.4 g，74.9毫莫耳)且加熱反應混合物至75℃至80℃持續1小時至2小時。緩慢添加水(200 mL)，冷卻至室溫，且攪拌1小時至2小時。過濾固體，用水(75 mL)洗滌濾餅，且轉移固體至清潔反應容器。添加THF(100 mL)且加熱反應混合物至30℃至35℃直至固體溶解。添加DCM(350 mL)且在30℃至35℃下繼續攪拌1小時至2小時。添加1 N鹽酸(250 mL)且在30℃至35℃下繼續攪拌1小時至2小時。分離各層，用1 N鹽酸(250 mL)、隨後用氯化鈉之25%水溶液(50 mL)洗滌有機層，且在低於50℃下濃縮溶液，達到約25 mL之體積。添加乙醇(50 mL)，在低於50℃下濃縮溶液，達到約25 mL之體積，且再添加乙醇(50 mL)。在低於50℃下濃縮溶液，達到約25 mL之體積，加熱反應混合物至45℃至50℃，且攪拌1小時至2小時。在攪拌下冷卻反應混合物至5℃至10℃持續2小時至3小時，且過濾所得固體。用乙醇(25 mL)沖洗濾餅且在減壓下在烘箱中在低於50℃下乾燥，得到呈灰白色固體之7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(14.9 g，99.9%純度，88.5%產率)。

以下化合物基本上藉由製備32之方法製備。

製備43

替代性合成7-氯-2-(三氟甲基)-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮

在50℃下添加二氯化錫(3當量；3.02 g，15.77 mmol)於5 M鹽酸(20 mL，100 mmol)中之溶液至1-(5-氯-2-硝基苄基)-4-(三氟甲基)-1H-吡咯-2-甲酸乙酯(1當量；1.98 g，5.26毫莫耳)及乙醇(100 mL)中。加熱隔夜且隨後再持續26小時，在真空中移除大部分乙醇且用水稀釋所得溶液且藉由過濾收集所得沈澱物，用水充分洗滌且在40℃下在真空中乾燥。使固體吸附於二氧化矽上，以DCM/甲醇(5：95)溶離層析，得到非環化胺基酯(0.260 g)及7-氯-2-(三氟甲基)-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(0.613 g)。加熱該非環化酯與5 M鹽酸(10 mL，50 mmol)之混合物80小時。在真空中移除乙醇且藉由過濾收集所得沈澱固體且用水洗滌，得到7-氯-2-(三氟甲基)-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(0.17 g)。與先前7-氯-2-(三氟甲基)-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮合併，得到(0.794 g，50%產率)。MS(m/z)：300.99(M+1)。

以下化合物基本上藉由製備43之方法製備。

製備45

合成7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯

在70℃下經20分鐘向7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(40.6 g，164.58毫莫耳)於甲氧基苯(250 mL)中之懸浮液中相繼添加一份N,N-二甲基苯胺(2.8當量；58.59 mL，460.8毫莫耳)及磷醯氯(2.3當量(莫耳)；35.18 mL，378.52毫莫耳)，藉由添加控制放熱。在90℃下加熱所得暗色溶液1.5小時。再添加磷醯氯(0.33當量；5.05 mL，54.31毫莫耳)且再在90℃下加熱混合物1小時，得到完全轉化。蒸發至將近乾燥且分配殘餘物於水(500 mL)與乙酸乙酯(2×500 mL)之間。合併有機層且用水(500 mL)、隨後用鹽水洗滌。經Na₂SO₄乾燥，過濾且於二氧化矽上蒸發。與異己烷/乙酸乙酯(梯度溶離5%至25%)一起通過矽膠墊。合併產物溶離份且蒸發少量溶劑。添加異己烷(150 mL)且藉由過濾收集所得黃色粉末，得到7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(34.0 g，78%產率)。MS(m/z)：265.1(M+1)。

替代性合成：

在N₂氛圍下添加磷醯氯(124 g，819 mmol)至7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(100 g，405 mmol)、N,N-二甲基苯胺(138 g，1.14 mol)及苯甲醚(550 mL)之混合物中。加熱至80℃至85℃且攪拌4小時至6小時。濃縮至總共1.5體積至2.5體積同時維持溫度低於75℃。冷卻至15℃至25℃。逐滴添加二氯甲烷(600 mL)且攪拌1小時。添加所得混合物至水(600 mL)中同時維持溫度在10℃與35℃之間。攪拌1小時且隨後分離各層。用二氯甲烷(600 mL)萃取水層。用1.0 N HCl(600 g)、隨後用7% NaHCO₃(600 g)洗滌經合併有機層。經矽藻土(20 g至30 g)及矽膠(60 g至100 g)過濾有機層。濃縮所得濾液至總共1.5體積至2.5體積同時維持溫度低於45℃。添加庚烷(270 g至410 g)且濃縮所得濾液至總共1.5體積至2.5體積同時維持溫度低於45℃。添加庚烷(150 g至210 g)，冷卻至5℃至10℃，且攪拌2小時至3小時。過濾，用庚烷沖洗過濾器、濾餅，且在低於45℃下在真空下乾燥，獲得呈淺黃色固體之標題化合物(90%至95%產率)。

以下化合物基本上藉由製備45之方法製備。

製備50

合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

添加磷醯氯(1.47 mL，2.43 g，15.85毫莫耳)至7-氯-2-甲基-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(1.117 g，4.53毫莫耳)於DCM(50 mL)中之混合物中且在室溫下攪拌過週末。添加冰水至反應混合物中，隨後添加DCM，分離水層且用水及碳酸氫鈉溶液洗滌DCM層。用MgSO₄乾燥DCM溶液，過濾且在真空中蒸發溶劑，得到7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(1.167 g)。

2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二鹽酸鹽(1.61 g， 5.89毫莫耳)溶於水中且裝載至兩個SCX-2(10 g)柱上。兩柱用甲醇洗且用2 M氨之甲醇溶液溶離。在真空中濃縮，隨後所得油狀物溶於乙腈(40 mL)中。添加7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(1.167 g，4.4毫莫耳)至乙腈溶液中。分配乙腈溶液且置於2個微波管中，添加碳酸鉀(0.89 g，6.79毫莫耳)至各微波管中，且在微波中在140℃加熱且攪拌3.5小時。使反應混合物冷卻，過濾，用乙腈洗燒結濾器上所收集之固體，隨後濾液在真空中濃縮，添加甲醇且隨後蒸發至乾燥。再以甲醇處理且收集所得沈澱物，用甲醇洗沈澱物，得到呈結晶固體之3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(1.1 g)。MS(m/z)：429.18(M+1)。

替代性合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

向7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(34.0 g，128.23毫莫耳)於乙腈(300 mL)中之懸浮液添加2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)-丙酸甲酯鹽酸鹽(2.1當量；63.75 g，269.29毫莫耳)及碳酸鉀(4當量；70.89 g，512.93毫莫耳)。在回流下加熱混合物隔夜。蒸發至乾燥。分配殘餘物於水(500 mL)與EtOAc(2×500 mL)之間。有機層合併且用水(500 mL)、隨後用鹽水洗。經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發為棕色油狀物。添加異己烷(約150 mL)及製備50之晶種。使其經2小時結晶，隨後燒瓶移入冰箱中且靜置。藉由過濾收集所得重結晶固體，用冷異己烷洗。在真空烘箱中在40℃乾燥1小時，得到3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(53.6 g，97%產率)。MS(m/z)：429.18(M+1)。

第二種替代性合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

在80℃至85℃加熱7,11-二氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(10.0 g，37.7 mmol)、2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)-丙酸甲酯二鹽酸鹽(19.4 g，71.0 mmol)、二異丙胺(22.9 g，226 mmol)及乙腈(80 g)之混合物22小時至26小時。冷卻至30℃至40℃且添加乙酸乙酯(80 g)。逐滴添加水(80 g)。攪拌40分鐘至60分鐘且分離各層。用乙酸乙酯(60 g至80 g)萃取水層。用25%氯化鈉水溶液(2×40 g)洗合併之有機層。濃縮有機層至總共1.5體積至3.5體積，同時維持溫度低於50℃。在40℃至50℃下添加庚烷(41 g至55 g)且攪拌2小時至3小時。濃縮至總共1.5體積至3.0體積，同時維持溫度低於50℃。冷卻至0℃至10℃且攪拌2小時至3小時。過濾，用庚烷(3.0 g至10.0 g)洗滌濾餅，且在低於60℃下在真空下乾燥，提供呈淡黃色固體之標題化合物(16.0 g，94.7% w/w%分析，94%產率)。

製備51

合成3-[4-(2,7-二氯-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

添加磷醯氯(5當量；4.36 mL，7.19 g，46.89毫莫耳)至2,7-二氯-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(1當量；2.505 g，9.38毫莫耳)於氯仿(80 mL)中之混合物中且加熱且在50℃下攪拌隔夜。傾析反應溶液且在真空中蒸發為油狀物。溶解油狀物於DCM中，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。經Na₂SO₄乾燥DCM溶液，過濾且濃縮至乾燥，得到呈奶油色固體之2,7,11-三氯-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯。並行地藉由溶解於甲醇中來對2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯鹽酸鹽(0.837 g，3.54毫莫耳)脫鹽，添加甲醇溶液至SCX-2管柱(10 g)，用甲醇洗滌且隨後用2.5 M氨之甲醇溶液溶離，蒸發甲醇氨溶離份，得到呈油狀物之2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯(0.665 g)。混合此油狀物與2,7,11-三氯-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(0.505 g，1.77毫莫耳)、碳酸鉀(0.733 g，5.31毫莫耳)及乙腈(20毫升)且在回流下加熱隔夜。冷卻反應混合物至室溫且過濾，用EtOAc洗滌燒結濾器，隨後在真空中蒸發濾液為固體。在二氧化矽上層析，以甲醇/DCM(梯度溶離2：98至8：92)溶離。蒸發含有產物之溶離份，得到3-[4-(2,7-二氯-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(0.69 g)。MS(m/z)：449.13/451.07(M+1)。

以下化合物基本上藉由製備51之方法製備。

製備60

合成2,2-二甲基-3-[4-(7-甲基-2-(甲基硫基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-丙酸甲酯

用乙酸(15 mL)處理1-(5-甲基-2-硝基苄基)-4-(甲基硫基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(3.49毫莫耳；1.12 g)，隨後用鐵粉末(10.5毫莫耳；585 mg)處理，隨後在油浴中在80℃下緩慢加熱。在若干小時之後升高油浴溫度至90℃。隨後使反應物在60℃下靜置2天。隨後濃縮至乾燥以移除乙酸，隨後以EtOAc處理，且再用EtOAc洗滌通過二氧化矽墊直至橙黃色停止脫離為止。濃縮紅色溶離液至乾燥，隨後以甲醇處理，隨後再濃縮且溶解於DCM(20 mL)中且以磷醯氯(1.0 mL)處理。在油浴中在50℃下加熱反應物隔夜。隨後冷卻反應物至室溫且以冰處理，隨後用水洗滌兩次且隨後用NaHCO₃(水溶液)洗滌。經MgSO₄乾燥有機層，過濾且濃縮為焦油。同時溶解2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯二鹽酸鹽(1.60 g，5.86毫莫耳)於水中，隨後裝載至SCX-2柱(2×10 g)上且用甲醇洗滌，隨後用氨之甲醇溶液溶離。濃縮鹼性溶液至乾燥為油狀物。隨後溶解此油狀物於乙腈(50 mL)中且添加至焦油及碳酸鉀(1.0 g)之混合物中，隨後加熱回流。在2小時之後，微波反應至140℃持續2小時。隨後過濾反應物且用乙腈及丙酮萃取。合併且於二氧化矽上濃縮母液至乾燥，隨後藉由急驟層析二氧化矽(40 g)(10%至50% EtOAc於己烷中)純化。獲取含有清潔產物之溶離份，合併且濃縮，獲得2,2-二甲基-3-[4-(7-甲基-2-(甲基硫基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-丙酸甲酯(418 mg；27%產率)。MS(m/z)：441.18(M+1)。

製備61

合成7-氯-2-(甲基硫基)-11-(哌嗪-1-基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯

添加磷醯氯(5當量；2.21 mL，3.64 g，23.76毫莫耳)至7-氯-2-(甲基硫基)-5,10-二氫-11H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-酮(1.38 g，4.75毫莫耳)於氯仿(20 mL)中之混合物中且加熱且在45℃下攪拌2小時。升高反應溫度至60℃且再攪拌2小時。在真空中移除氯仿且溶解殘餘物於DCM(100 mL)中且用飽和碳酸氫鈉溶液(100 mL)洗滌。經由相分離玻璃料過濾DCM層且在真空中蒸發溶劑，得到黏性油狀物。溶解油狀物於乙腈(10 mL)中且添加碳酸銫(3當量；4.65 g，14.26毫莫耳)。向此混合物添加哌嗪(10當量；4.09 g，47.52毫莫耳)於無水乙腈(10 mL)中之混合物且加熱且在回流下攪拌混合物隔夜。冷卻反應混合物且添加飽和氯化銨溶液(100 mL)且萃取至EtOAc(2×50 mL)中。合併有機層且用水(3×100 mL)洗滌，經MgSO₄乾燥，過濾且在真空中蒸發溶劑，得到7-氯-2-(甲基硫基)-11-(哌嗪-1-基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(1.0 g，60%)。MS(m/z)：347.13(M+1)。

製備62

合成3-[4-(7-氯-2-(甲基硫基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

添加2,2-二甲基-3-側氧基-丙酸甲酯(0.928 g，7.13毫莫耳)於DCM(5 mL)中之混合物至7-氯-2-(甲基硫基)-11-(哌嗪-1-基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(1.0 g，2.85毫莫耳)於DCM(10 mL)中之混合物中且在室溫下在氮氣下攪拌30分鐘。添加三乙醯氧基硼氫化鈉(3當量；1.89 g，8.56毫莫耳)至反應混合物中且在室溫下在氮氣下攪拌隔夜。添加甲醇且施加於SCX-2管柱，用甲醇洗滌且用2 M氨之甲醇溶液溶離。蒸發甲醇溶液，得到3-[4-(7-氯-2-(甲基硫基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(1.23 g，84%)。MS(m/z)：461.12(M+1)。

製備63

合成2,2-二甲基-3-{4-[7-甲基-2-(丙-2-基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基]哌嗪-1-基}丙酸甲酯

混合3-[4-(2-溴-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(1.00當量；600.00 mg，1.27毫莫耳)、4,4,5,5-四甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,3,2-二氧硼(3.00當量；638.93 mg，3.80毫莫耳)於甲醇(15 mL)中。添加預摻合之1.09重量%參(二亞苄基丙酮基)雙鈀(Pd₂(dba)₃)、1.16重量% 1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵(dtbpf)及97.75重量%磷酸三鉀(1.06)之混合物且在微波中在140℃下加熱25分鐘。經矽藻土過濾反應混合物且用甲醇稀釋至25 mL體積。在50℃下藉由以1毫升/分鐘通過H-Cube®流動氫化器使用10% Pd/C催化柱來氫化甲醇溶液。在真空中蒸發溶劑，得到2,2-二甲基-3-{4-[7-甲基-2-(丙-2-基)-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基]哌嗪-1-基}丙酸甲酯。MS(m/z)：437.28(M+1)。

製備64

合成3-[4-(2-乙基-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯

混合3-[4-(2-溴-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(1.00當量；620.00 mg，1.31毫莫耳)、三乙烯基硼氧雜環己烷吡啶(1.5當量；472.79 mg，1.96毫莫耳)於甲醇(15 mL)中。添加預摻合之1.09重量%參(二亞苄基丙酮基)雙鈀(Pd₂(dba)₃)、1.16重量% 1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵(dtbpf)及97.75重量%磷酸三鉀(1.10 g)之混合物且在微波中在140℃下加熱25分鐘。經矽藻土過濾反應混合物且用甲醇稀釋至25 mL體積。在50℃下藉由以1毫升/分鐘通過H-Cube®流動氫化器使用10% Pd/C催化柱來氫化甲醇溶液。在真空中蒸發溶劑，得到3-[4-(2-乙基-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯。MS(m/z)： 423.18(M+1)。

實例1

合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸

向3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸甲酯(28.0 g，65.27毫莫耳)於異丙醇(150 mL)及水(150 mL)之混合物中的懸浮液添加氫氧化鈉(3當量；7.83 g，195.82毫莫耳)且在70℃下加熱4小時，得到澄清溶液。再在70℃下加熱1小時，隨後稍微冷卻。添加5 M鹽酸以得到pH值8且沈澱出白色固體。再添加5 M鹽酸，得到6.5與7之間的pH值。減少溶劑體積達一半且隨後在冰箱中冷凍燒瓶0.5小時。藉由過濾收集所得白色固體且在真空烘箱中在40℃下經五氧化二磷乾燥隔夜，得到3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸(26.5 g，98%產率)。MS(m/z)：415.3(M+1)。DSC熔點=246.5℃(起始)。

以下化合物基本上藉由實例1之方法製備。

實例13

合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽

在60℃下經10分鐘向3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸(24.25 g，58.44毫莫耳)於異丙醇(250 mL)中之懸浮液中添加4 M氯化氫之二噁烷溶液(2.4當量；35.07 mL，140.26毫莫耳)，得到澄清溶液。使其稍微冷卻，隨後蒸發為灰白色固體。用少量***濕磨且藉由過濾收集粉狀乳膏固體。在真空烘箱中在40℃下乾燥隔夜。研磨為細粉末且在真空烘箱中在60℃下乾燥6小時。藉由1H NMR監測殘餘異丙醇含量。溶解於溫乙醇(350 mL)中且蒸發至乾燥。用乙醇(50 mL)濕磨且再次蒸發至乾燥。用無水***(200 mL)濕磨且藉由過濾收集所得固體。在真空烘箱中在50℃下乾燥6小時，得到3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽(26.9 g，94%產率)MS(m/z)：415.2(M+1)。

以下化合物基本上藉由實例13之方法製備。

實例25

合成3-[4-(2-氯-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽

溶解2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)-丙酸甲酯二鹽酸鹽(1.49 g，5.47毫莫耳)於水中且吸附於SCX2管柱上。用甲醇洗滌管柱且用2 M氨之甲醇溶液溶離2,2-二甲基-3-哌嗪-1-基-丙酸甲酯。在真空中移除甲醇且添加2,2-二甲基-3-(哌嗪-1-基)丙酸甲酯至乙腈(12 mL)中。添加2,11-二氯-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯(0.85 g，3.22毫莫耳)及碳酸氫鈉(0.405 g，4.83毫莫耳)至該乙腈溶液中。在微波中在140℃下加熱且攪拌30分鐘。冷卻至室溫，使反應混合物吸附於二氧化矽上且藉由層析(用EtOAc/異己烷0：100%至100：0%梯度溶離)純化。收集含有產物之溶離份，在真空中蒸發溶劑且溶解殘餘物於甲醇(10 mL)中且添加氫氧化鋰(0.235 g，9.65毫莫耳)。在微波中在140℃下加熱且攪拌甲醇溶液12.5分鐘。冷卻至室溫且用乙酸酸化且隨後在減壓下蒸發溶劑。溶解殘餘物於過量2 M HCl(水溶液)中且隨後蒸發至乾燥。溶解殘餘物於水中且固定於大孔聚苯乙烯碳酸氫鹽(PL-HCO3)樹脂上。用水洗滌樹脂且用2 M HCl(水溶液)自樹脂溶離。蒸發溶液至乾燥，得到3-[4-(2-氯-7-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽(0.177 g；11.28%產率)。MS(m/z)：415.18(M+1)。

以下化合物基本上藉由實例25之方法製備。

實例29

合成3-[4-(7-氯-2-乙基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸鈉

溶解3-[4-(7-氯-2-乙基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽(201 mg，400微莫耳)於水及甲醇(5 mL)中，隨後裝載至SCX-2柱(2 g)上。用甲醇洗滌且隨後用氨之甲醇溶液溶離。濃縮鹼性溶液至乾燥，得到3-[4-(7-氯-2-乙基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸(160 mg，373微莫耳)。隨後以2 N氫氧化鈉(187 μL，373微莫耳)及水(3 mL)處理以產生溶液。隨後凍乾，獲得3-[4-(7-氯-2-乙基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸鈉(164 mg，98%產率)。MS(m/z)：429.18(M+1)。

實例30

合成3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二-甲烷磺酸鹽

添加乙腈(5 mL)至3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸(0.106 g，0.255 mmol)中以產生漿液。添加甲烷磺酸(0.050 ml，0.075 g，0.76 mmol)至該正攪拌之漿液(1000 rpm)中且在60℃攪拌所得溶液直至白色固體沈澱。冷卻此漿液，且藉由過濾分離固體，獲得3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二-甲烷磺酸鹽(0.15 g)。

文獻資料(Morairty SR,Hedley L,Flores J,Martin R,Kilduff TS.(2008)Selective 5-HT _2A and 5-HT ₆ receptor antagonists promote sleep in rats.Sleep 31,34-44；及Barbier,A.J.及Bradbury,M.J.,Histaminergic Control of Sleep-Wake Cycles：Recent Therapeutic Advances for Sleep and Wake Disorders,CNS & Neurological Disorders-Drug Targets，第6卷，第31頁至第43頁(2007))及在非臨床動物研究中所得到之資料支持雙重活性H1反向促進劑/5-HT_2A拮抗劑在治療失眠症中及在對症治療與其他病症(諸如抑鬱症、焦慮症、疼痛、過敏症、肺或氣管病症、精神病症、癡呆及/或神經退化性疾病及/或晝夜節律睡眠障礙)相關之失眠症中之作用。特定言之，使用EEG監測齧齒動物發現某些雙重活性H1反向促進劑/5-HT_2A拮抗劑對增加總睡眠時間有效，沒有不相稱的或臨床上相關之活動減退、REM睡眠減少或過度嗜睡。

為了進一步證明本發明化合物之特徵，可在以下活體外及活體內分析法中驗證化合物：

活體外結合及活性分析法：

H1競爭結合分析法

以SPA(閃爍近接分析)96孔格式進行[³H]-吡拉明(Pyrilamine)結合實驗。由穩定表現重組H1受體(人類)之HEK-293細胞製備用於此分析之膜。藉由添加WGA PVT SPA珠粒(1毫克/孔，Perkin Elmer(MA,USA)RPNQ0001)及3 μg膜之混合物至含有3.5 nM[³H]-吡拉明及不同濃度測試化合物(10點濃度反應曲線)之分析緩衝液(67 mM Tris；pH 7.6)中開始培育。在10 μM曲普利啶(Triprolidine)存在下測定非特異性結合。樣品在室溫(22℃)培育四小時且隨後在Microbeta Trilux中讀數。

5-HT _2A 競爭結合分析法

以SPA 96孔格式進行[³H]-酮色林(Ketanserin)結合實驗。自穩定表現重組5-HT_2A受體(人類)之AV-12細胞製備用於此分析之膜。藉由添加WGA YSi SPA珠粒(1毫克/孔，Perkin Elmer(MA,USA)，RPNQ0001)及2 μg膜之混合物至含有3.1 nM[³H]-酮色林及不同濃度之測試化合物(10點濃度反應曲線)之分析緩衝液(67 mM Tris，0.5 mM EDTA；pH值7.6)中來開始培育。在20 μM 1-(1-萘基)哌嗪存在下測定非特異性結合。在室溫(22℃)下培育樣品四小時且隨後在Microbeta Trilux中讀數。

5-HT _2C 競爭結合分析法

以SPA 96孔格式進行[¹²⁵I]-(±)DOI結合實驗。自穩定表現重組5-HT_2C受體(人類)之AV-12細胞製備用於此分析之膜。藉由添加WGA PVT SPA珠粒(0.5毫克/孔，Perkin Elmer(MA,USA)，RPNQ0001)及2.5 μg膜之混合物至含有0.2 nM[¹²⁵I]-(±)DOI及不同濃度之測試化合物(10點濃度反應曲線)之分析緩衝液(50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，0.5 mM EDTA，10 μM巴吉林(pargyline)，0.1%抗壞血酸，pH值7.4)中來開始培育。在20 μM 1-(1-萘基)哌嗪存在下測定非特異性結合。在室溫(22℃)下培育樣品四小時且隨後在Microbeta Trilux中讀數。

結合資料分析

使用4參數邏輯非線性方程評估曲線，獲得產生放射性配位體結合之50%抑制的競爭者之濃度(IC₅₀)。根據方程式K_i=IC₅₀/(1+L/K_d)計算平衡解離常數(K_i)，其中L等於實驗中所用之放射性配位體之濃度且K_d等於由標準飽和分析或同源競爭實驗測定的受體之放射性配位體之平衡解離常數。K_i之報導值(其中指定n值)顯示為幾何平均值±平均值之標準誤差(SEM)，平行測定次數用n指示。由方程式幾何平均值=10^(平均(log K_i 1+log K_i 2+...log K_i n)/n之平方根)計算幾何平均值。

使用原代神經元培養物中之原生受體之GABA _A 拮抗作用

藉由使用96孔格式FLIPR®系統(螢光成像板讀取器)(FLIPR®，Molecular Devices)監測鈣通量來評估化合物對原生GABA_A受體之活性。簡言之，使皮層胚胎神經元自E18大鼠胚胎分離且以最適密度塗於黑色壁、透明底的經聚D-離胺酸塗佈之96孔FLIPR®培養盤中。在用鈣敏感性染料(Fluo4-AM，Molecular Devices)裝載細胞之後，將細胞浸於含有低氯化物之溶液中(氯化物經葡糖酸鹽置換)。在此等條件下GABA_A受體之活化導致氯離子流出(朝化學梯度方向)，此導致膜去極化且因此活化電壓閘控鈣通道(VGCC)。記錄經由VGCC之鈣流入量且使用FLIPR®系統作離線分析。在分析之藥理學驗證中，記錄標準促進劑(GABA)及標準拮抗劑(丙泊酚(Gabazine))之濃度反應曲線 (CRC)。相對於10 μM促進劑GABA之固定濃度(與EC₉₀ GABA反應等同)以CRC模式測定任何效應。

方法：

使用10點劑量反應曲線藉由在存在與不存在化合物下比較促進劑GABA之峰值螢光反應來定量化合物之拮抗作用。分析窗係定義為由GABA在其預定EC₉₀濃度下所得之最大反應減去由丙泊酚之完全抑制濃度(50 μM)所得之反應。拮抗作用按分析窗之百分比來計算。使用四參數邏輯曲線擬合程式(Prism Graphpad® 3.01)將所有資料計算為相對IC₅₀值。將所有化合物之拮抗效能在各分析操作中以一式三份與丙泊酚進行比較。

基本上如上所述測試例示之化合物或例示之其鹽且發現其對於H1及5-HT_2A受體具有高親和力及對5-HT_2C受體具選擇性。發現例示之化合物對H1及5-HT_2A受體之K_i分別小於100 nM及200 nM，而發現對5-HT_2C受體之K_i大於1000 nM。

此外，可在結合分析法及功能活性分析法中藉由熟知方法測試本發明化合物對於其他生理學重要受體之影響，該等受體諸如有(但不限於)hERG通道、其他血清素受體(特定言之有5-HT_1A、5-HT_1B、5-HT_1D、5-HT_1E、5-HT_1F受體，其對5-HT_2B受體、5-HT_2C、5-HT₄、5-HT₅、5-HT₆及5-HT₇受體缺乏促進活性)、蕈毒鹼受體、多巴胺激導性受體(特定言之為D1、D2及D3)、GABA_A受體、腎上腺素激導性受體及單胺轉運體。針對此等受體測試某些例示之化合物且其顯示缺乏顯著活性。

基本上如上文所述測試實例1及13之化合物且發現其具有如表1中所示之活性概況。

因此，預期本發明化合物之生理學相關劑量可提供H1及 5-HT_2A受體活體內之實質性抑制，同時實質上不與其他生理學相關受體相互作用，且因此預期其可提供所需藥理學性質，同時避免與脫靶活性相關之不良效應。該等不良效應包括(但不限於)以下：與治療突發性體重增加相關之5-HT_2C拮抗活性、與心瓣膜病相關之5-HT_2B促進活性、與QT延長相關之hERG通道調整及與癲癇活動(seizure activity)相關之GABA_A活性。此外，對睡眠/覺醒生理機能之干擾利用超過多巴胺受體、其他血清素受體、腎上腺素激導性受體及單胺轉運體之選擇性而得到避免。

5-HT _2A 受體佔有率：分析受體佔有率以證明與5-HT_2A受體活體內之相互作用程度。簡言之，使重約230公克至280公克之雄性史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis,IN)隨意獲取食物及水直至3小時實驗方案開始為止。1 mg/kg酮色林(非選擇性5-HT_2A拮抗劑)用作陽性對照以確立分析有效性。藉由口服管飼投與於包含20%羥丙基β-環糊精之媒劑中之測試化合物或對照物。選擇性5-HT_2A拮抗劑MDL 100907((R)-(+)-α-(2,3-二甲氧基苯基)-1-[2-(4-氟苯基)乙基]-4-哌啶甲醇)用作示蹤物。使MDL 100907懸浮於含5 μl稀乳酸(1 mg/ml)之水中，用鹽水稀釋至6 μg/ml，且經由側向尾靜脈經靜脈內投與1 mL/kg之體積以獲得3 μg/kg之示蹤劑量。向大鼠投與測試化合物、酮色林或媒劑(N=4)，在1小時之後經靜脈內投與3 μg/kg示蹤劑量之MDL 100907。認為應在示蹤物投與時量測受體佔有率(RO)。在示蹤物投與之後15分鐘，藉由頸椎脫臼來處死大鼠。收集血漿樣品且移取額部皮質及小腦之樣品。量測各皮質及小腦樣品中MDL 100907示蹤物之含量。使用公認比率法計算RO，該方法採用代表總結合之高受體密度區域(額部皮質)，用沒有受體或具有極低含量的受體之區域(小腦)校正。稱為無效區域之此區域代表配位體探針之非特異性結合。皮質相對於小腦之示蹤物含量之媒劑比率代表0%佔有率。比率1代表100%佔有率且當MDL 100907示蹤物所有與5-HT_2A受體之特異性結合被阻斷時可達成。將來自測試化合物預處理組之皮質與小腦示蹤物之中間比率線性地內插於媒劑處理動物之示蹤物含量之比率(0%佔有率)與1之比率(100%佔有率)之間以確定5-HT_2A RO百分比。

MDL 100907分析：稱量皮質及小腦樣品且將其置於在冰上之圓錐形離心管中。添加四體積(w/v)含有0.1%甲酸之乙腈至各管。隨後使樣品均質化且在14,000 RPM(21,920×g)下離心16分鐘。於HPLC注射小瓶中藉由添加100 μL至900 μL無菌水來稀釋上清液以供LC/MS/MS分析。使用Agilent 1200型HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto,CA)及API 4000質譜儀來分析MDL 100907。在2.1×50 mm C18管柱(Agilent件號971700-907)上層析分離，移動相由含總體0.1%甲酸含量的60%乙腈之水溶液組成。藉由監測前驅體至產物之離子躍遷來實現MDL 100907之偵測，質荷比(m/z)為374.2至123.0。藉由添加已知數量之分析物至未處理大鼠之腦組織樣品中且如上文所述加以處理來製備標準物。

統計方法：使用JMP 8.0版(SAS Institute Inc,Cary NC)將各研究之曲線擬合為將下限定為0%之4參數邏輯函數(parameter logistic function)且利用該軟體計算絕對ED₅₀。獲得值為平均值、標準誤差及95%信賴區間。基本上正如所述測試實例13之化合物且發現其達成高5-HT_2A受體佔有率，EC₅₀為0.27 mg/kg(SE=0.069，95% CI=0.16 mg/kg至0.48 mg/kg)。

組織胺H1受體佔有率：分析H1 RO以證明與H1受體活體內之相互作用程度。簡言之，使重約230公克至280公克之雄性史泊格多利大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Indianapolis,IN)隨意獲取食物及水直至3小時實驗方案開始為止。3-[4-(8-氟代二苯并[b,f][1,4]噁氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸二鹽酸鹽用作陽性對照且多慮平用作示蹤物。藉由口服管飼投與於包含20%羥丙基β-環糊精之媒劑中之測試化合物及對照物。溶解多慮平於無菌水(100 μg/ml)中，用鹽水稀釋至2 μg/ml，且經由側向尾靜脈經靜脈內投與0.5 ml/kg之體積以獲得1 μg/kg之示蹤劑量。向大鼠投與測試化合物、15 mg/kg陽性對照物或媒劑，在1小時之後經靜脈內投與「示蹤」劑量之多慮平(N=4)。認為應在示蹤物投與時量測RO。在示蹤物投與之後40分鐘，藉由頸椎脫臼來處死大鼠。收集血漿樣品且移取額部皮質。量測各皮質樣品中多慮平示蹤物之含量。使用在媒劑條件(0%佔有率)及陽性對照條件(100%佔有率)下之組織內示蹤量比較來計算RO。預定在30分鐘預處理下經靜脈內投與15 mg/kg之陽性對照物代表完全阻斷示蹤物與H1受體之特異性結合。將投與測試化合物之其他處理組線性地內插於媒劑與陽性對照組之間以計算H1 RO百分比。

多慮平分析：稱量皮質樣品且將其置於在冰上之圓錐形離心管中。添加四體積(w/v)含有0.1%甲酸之乙腈至各管。使樣品均質化且在14,000 RPM(21,920×g)下離心16分鐘。於HPLC注射小瓶中以100 μL至900 μL無菌水稀釋上清液以供LC/MS/MS分析。使用Agilent 1200型HPLC(Agilent Technologies，Palo Alto,CA)及API 4000質譜儀進行多慮平之LC/MS/MS分析。層析分離採用2.1×50 mm C18管柱(Agilent件號971700-907)及使用由以下組成之梯度法之移動相：初始條件為含總體0.1%甲酸含量的10%乙腈(ACN)之水溶液，1分鐘之後-10% ACN，2分鐘之後-90% ACN，2.9分鐘之後-90% ACN，3.1分鐘之後-10% ACN，5.5分鐘之後-停止。藉由監測前驅體至產物之離子躍遷來實現多慮平之偵測，質荷比(m/z)為280至107.1。藉由添加已知數量之分析物至未處理大鼠之腦組織樣品中且如上文所述加以處理來製備標準物。

統計方法：使用Prism® 3.02版(GraphPad Software，San Diego,CA)將曲線擬合為4參數邏輯(無一者保持恆定)且利用該軟體計算相對ED₅₀。獲得值為平均值±平均值之標準誤差。基本上正如所述測試實例13之化合物且發現其達成高H1 RO，EC₅₀為0.3 mg/kg。

H1反向促進作用：為了測定本發明化合物之反向促進性質，量測其對轉染有人類重組H1受體之HEK293細胞(HEK293/hm H1純系R-40)中肌醇1磷酸鹽(IP1)含量之影響。簡言之，使HEK293/hm H1細胞(純系R-40)生長至約90%匯合(3：1 DMEM/F12，5% FBS，20 mM HEPES，G418 500 μg/ml，1% Pen/鏈球菌/麩醯胺酸)且在分析當天使用1×胰蛋白酶/EDTA(PAA Pasching，Austria L11-003)收集。將35 μl細胞(300 K)接種至96W半區白色的固體底板(Corning,UK 3688)中之刺激緩衝液(NaCl 146 mM，CaCl₂ 1 mM，KCl 4.2 mM，MgCl₂ 0.5 mM，葡萄糖5.5 mM，HEPES 10 mM及LiCl 50 mM)中。起初以1 mM溶解測試化合物於100% DMSO中，且於100% DMSO中連續稀釋(半對數)得到10點劑量反應曲線(Biomek 2000，Beckman Coulter UK)。使用Cybiwell(CiBio Jena，Germany)於刺激緩衝液中將其進一步稀釋為×2最終分析濃度且添加35 μl至分析培養盤中之細胞(10 μM最大最終濃度)。在添加15 μl各HTRF IP1偵測套組試劑(CisBio 62P1APEC)之前，在37℃/5% CO₂下培育細胞加上化合物1小時30分鐘。在量測IP1積聚(Envision培養盤讀取器，Perkin Elmer)之前，在室溫下再培育細胞培養盤一小時。藉由自分析當天獲得之標準IP1曲線外推來計算IP1積聚(nM)。使用4參數曲線擬合(Graph Pad Prism 3.02版)計算EC₅₀值。相對於陽性對照物曲吡那明(Tripelennamine)(10 μM，Sigma，UK P5514)表示負功效值。基本上正如所述分析本發明之代表性化合物且發現其為H1受體之反向促進劑。基本上正如所述測試化合物13且發現其完全抑制組成性活性(126±6%)，IC₅₀為53.9 nM±37 nM。

DOI誘發之搖頭活動之抑制：藉由本發明化合物阻止由5-HT_2A受體促進劑2,5-二甲氧基-4-碘***(DOI)誘發之搖頭活動的能力來證明其活體內5-HT_2A受體拮抗活性。(參見例如Bartoszyk GD,van Amsterdam C,Böttcher H,Seyfried CA.EMD 281014,a new selective serotonin 5-HT2A receptor antagonist.Eur J Pharmacol.2003 473：229-230。)簡言之，將雄性C57BL/6J小鼠(20 g至25 g，Charles River)以標準圈養條件圈養(32隻小鼠置放於大IVC籠中，07.00至19.00光照階段，恆溫(19℃至23℃)及恆濕(50% +/- 10)，食物及水隨意獲取)。小鼠經口接收媒劑(0.25%甲基纖維素)、DOI(3 mg/kg於鹽水中)或測試化合物(10 mg/kg)加上DOI(3 mg/kg於鹽水中)。以每實驗四隻之組個別地評估測試化合物，各化合物n=4，與媒劑及DOI+媒劑一起(n=8)。在60分鐘之測試化合物預處理時間之後，小鼠接收皮下給藥之媒劑(鹽水)或3 mg/kg DOI且隨後置放入清澈的有機玻璃觀測室。在DOI或媒劑投與之後五分鐘，計數由各個別小鼠展現之視覺上計分之搖頭次數持續15分鐘。使用ANOVA及事後頓納特測試(post-hoc Dunnet's Test)來分析資料。基本上正如所述測試例示之化合物且發現其在10 mg/kg下抑制DOI誘發之搖頭反應達到超過90%。基本上正如所述測試實例13之化合物且發現其在10 mg/kg下抑制DOI誘發之搖頭反應達到100%。

大鼠中之睡眠及行為監測：在大鼠中測試本發明之代表性化合物增加睡眠量或減少睡眠中斷或兩者而無不良效應(諸如抑制REM睡眠、覺醒運動異常及/或反彈性失眠症)之能力。藉由腦電圖(EEG)、肌電圖(EMG)及運動連續監測測試動物以量測累積非REM睡眠、累積總睡眠、平均睡眠回合持續時間、最長睡眠回合持續時間、反彈性失眠症、REM睡眠抑制及在覺醒期間之運動活性強度。該等研究之方法為此項技術中已知(參見例如在Edgar DM,Seidel WF.Modafinil induces wakefulness without intensifying motor activity or subsequent rebound hypersomnolence in the rat.J Pharmacology & Experimental Therapeutics 1997；283：757-769；van Gelder RN,Edgar DM,Dement WC.Real-time automated sleep scoring：validation of a microcomputer-based system for mice.Sleep 1991,14：48-55；及Gross BA,Walsh CM,Turakhia AA,Booth V,Mashour GA,Poe GR.Open-source logic-based automated sleep scoring software using electrophysiological recordings in rats.J Neurosci Methods.2009；184(1)：10-8中描述之方法)。研究係如下進行：

動物預備。如下以手術方式使成年雄性Wistar大鼠(在手術時約270 g至300 g)適於EEG、EMG及運動之長期記錄：以手術方式預備大鼠，其中由四個不鏽鋼螺釘組成之顱植入物用於EEG記錄(兩個額部[前囟前面3.9 mm，且中側 ±2.0 mm]及兩個枕部[前囟後面6.4 mm且中側±5.5 mm])，且兩個經鐵氟龍(Teflon)塗佈之不鏽鋼絲用於EMG記錄(置於頸部梯形肌肉下)。在手術之前將所有引線焊接至微型連接器(Microtech,Boothwyn,PA)。藉由組合不鏽鋼EEG記錄螺釘、施加於植入連接器與顱骨之間的氰基丙烯酸酯及牙科用丙烯酸(dental acrylic)來將植入組件固定至顱骨。經由以手術方式置於腹中的微型傳遞器(Minimitter PDT4000G,Philips Respironics,Bend,OR)監測運動活性。使其恢復至少3週。

記錄環境。將各大鼠個別圈養於經***之聚碳酸酯過濾器-頂部提昇器改裝之微型隔離籠內以允許有更多垂直頂空。將最低限度地限制運動之柔性線纜一端連接於固定至籠頂部之換向器且另一端連接於動物之顱植入物。將各籠置於不鏽鋼睡眠-覺醒記錄腔之獨立通風隔室內。食物及水可隨意獲取且維持環境溫度為約23±1℃。在整個研究期間使用螢光燈維持24小時光-暗循環(LD 12：12)。相對濕度平均為約50%。動物在各治療之前及之後至少30小時內不受干擾。

研究設計及給藥。偽隨機地經口投與1 mL/kg媒劑(安慰劑，甲基纖維素15厘泊0.25%於水中)或測試化合物劑量中之一者以使得在任一研究中沒有大鼠接受相同處理兩次，且沒有大鼠接受8種處理中之兩種以上。各大鼠自其籠中移出約一分鐘以稱重及處理。在各處理之前及之後有至少6天之「清除」期。

資料收集。睡眠及覺醒辨別可為自動化的(例如，Van Gelder等人，1991(上述)；Edgar等人，1997(上述)；Winrow CJ等人，Neuropharmacology 2010；58(1)：185-94；及Gross等人，2009(上述))。同時放大及過濾EEG(10,000倍，帶通1至30 Hz)，放大及積分EMG(帶通10至100 Hz，RMS積分)，及監測非特定運動活性(LMA)。醒覺狀態按10秒出現時間分類為非REM睡眠、REM睡眠、覺醒或θ主導之覺醒。運動活性(LMA)係以每分鐘計數形式記錄且係藉由市售遙測接收器(ER4000,Minimitter,Bend,OR)偵測。

統計分析。具有至少一個結果之所有動物包括於概括結果中(例如，包括來自動物處理之適當資料，其遙測資料可用但EEG資料不可用)。將處理後觀察期分成適合於各結果之給藥後區間，其中給藥時間定義為起始之小時=0，且在觀察期中藉由計算每小時平均值或各時期內之累積值來概括結果(關於各結果之確切定義，參見表1註釋)。在對數標度上分析睡眠回合以穩定偏差，在線性標度上分析所有其他變量。各時期之各結果係藉由共變數分析(analysis of covariance)來分析，使用處理組及處理日期作為因子且使用相應24小時以前之處理前區間作為共變量。概括各處理組之調整平均值及與媒劑平均值相比之變化及其相應標準誤差。將在對數標度上分析之結果轉換回以報導幾何平均值及平均值比率-媒劑結果。

基本上正如所述測試實例13至28之化合物。發現實例13、15、16、18及19之化合物在3 mg/kg下顯著增加累積 NREM睡眠時間及累積總睡眠時間而無顯著反彈性失眠症、REM睡眠抑制或運動強度(LMI)之抑制。基本上正如所述測試實例13之化合物且發現其具有如表2中所示之睡眠概況及運動活性強度。

表2. 結果統計：縮寫：N=樣本大小；調整平均值=相對於媒劑對照組之調整組平均值；SE=平均值標準誤差；LCL=較低95%信賴界限，NREM=非REM(亦即除REM睡眠以外之所有睡眠)。

定義及單位-平均值為相較於媒劑對照組經調整之差值：

累積睡眠：處理後前6小時內，以分鐘計(『總睡眠』表示NREM睡眠+REM睡眠)。

平均睡眠回合：處理後前6小時內每小時平均之睡眠回合之平均，表示為相較於媒劑對照組增加之n倍。

最長睡眠回合：處理後前6小時內最長睡眠回合，表示為相較於媒劑對照組增加之n倍。

反彈性失眠症：在燈開時期之前3小時期間(亦即處理後7小時、8小時及9小時)NREM+REM睡眠之累積分鐘數。

REM抑制：在處理後前12小時期間REM睡眠之累積分鐘數。

運動活性(LMA)強度：表示為EEG定義之覺醒的每分鐘之LMA計數，在處理後前6小時內取平均值。

測定功效。藉由針對對數(劑量)繪示在治療之後6小時期間各變量相對於媒劑對照組之增加來計算四個功效變量每一者之臨限功效。各變量之臨限功效為得到所定義之功效臨限值之劑量；+30分鐘額外累積非REM睡眠，+25分鐘額外累積總睡眠，平均睡眠回合持續時間之1.75×增加，及最長睡眠回合持續時間之1.5×增加。發現實例13之化合物具有如表3中所示之臨限有效劑量。

測定不良效應。針對對數(劑量)繪示各『不良效應』結果變量(關於定義，參見表4註釋)。

REM抑制之臨限值定義為REM睡眠之累積減少為-10分鐘。反彈性失眠症之臨限值定義為-20分鐘。LMI降低之臨限值定義為EEG定義之覺醒的每分鐘運動活性之計數為-5。顯著不良效應定義為對於平均有效劑量或以上之所有劑量，當下限信賴界限低於臨限值時出現的效應。對於例示之化合物，在達到至少10 mg/kg之劑量下沒有觀察到REM抑制、反彈性失眠症或LMI降低之不當顯現。(負值分別表示REM抑制、反彈性失眠症及LMI降低)。

雖然本發明方法中所用之化合物可能在無任何調配下即直接投與，但該等化合物通常以醫藥組合物之形式投與，該等醫藥組合物包含至少一種式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽作為活性成分且包含至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。此等組合物可藉由多種途徑投與，包括經口、經舌下、經鼻、皮下、靜脈內及肌肉內。該等醫藥組合物及其製備方法為此項技術中所熟知。參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(University of the Sciences in Philadelphia編，第21版，Lippincott Williams & Wilkins Co.,2005)。

組合物較佳調配成單位劑型，各劑含有約0.1 mg至約60 mg、更通常約1 mg至約30 mg、諸如約2 mg與約10 mg之間的活性成分。術語「單位劑型」係指適用作人類個體及其他哺乳動物之單一劑量的物理個別單元，各單元含有經計算可產生所需治療作用的預定量之活性物質，與至少一種適合之醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑締合。

式I化合物通常在寬泛劑量範圍內有效。舉例而言，每日劑量通常在每公斤體重約0.002 mg至約1.0 mg、更通常約0.015 mg至0.5 mg且諸如0.03 mg與0.15 mg之間的範圍內。在一些情況下，前述範圍之下限以下之劑量可能綽綽有餘，而在其他情況下可能採用比前述範圍更大之劑量而不會產生任何有害副作用，因此上述劑量範圍不意欲以任何方式限制本發明之範疇。應瞭解，實際上投與之化合物之量應由醫師根據相關情形確定，該等情形包括欲治療之病況、所選投藥途徑、所投與之實際化合物、個別患者之年齡、體重及反應以及患者症狀之嚴重程度。

Claims

一種下式之化合物，其中R¹為氯基或甲基；R²為甲基、乙基、異丙基、氯基、溴基、三氟甲基或甲硫基；及R³為氫或甲氧基；或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其中R³為氫，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1或2之化合物，其中R¹為氯基，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其為3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基丙酸，或其醫藥學上可接受之鹽。
如請求項1之化合物，其為3-[4-(7-氯-2-甲基-5H-吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮呯-11-基)哌嗪-1-基]-2,2-二甲基-丙酸二鹽酸鹽。
如請求項1、2、4或5中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療。
如請求項1、2、4或5中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療失眠症。
如請求項1、2、4或5中任一項之化合物，或其醫藥學上可接受之鹽，其係用於治療失眠症，其中該失眠症特徵在於入睡困難或睡眠維持困難或兩者。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，與至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑組合。
一種如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療失眠症之藥劑。
一種如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其係用於製造用以治療哺乳動物之失眠症之藥劑，其中該失眠症特徵在於入睡困難或睡眠維持困難或兩者。