CN103204909A - 一种抗高血压活性肽vppipp - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗高血压活性肽，其氨基酸序列为：缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸，本发明是在前期研究的基础上，选择了更可取的降血压肽的结构，并通过体外和体内生物活性验证合成六肽的抗高血压能力，本发明获得的具有抗高血压能力的合成六肽，可分别用于抑制ACE酶的活性，降低AngII的生成水平，达到降低血压的效果。该抗高血压活性肽具有高效低毒的特点，对于开发治疗高血压药物和功能食品有着较好的应用前景，由于能通过人工化学合成技术进行大规模制备，为将来药物开发中低成本和高产率的制备奠定了基础。

Description

一种抗高血压活性肽VPPIPP

技术领域

本发明涉及一种抗高血压活性肽，具体涉及通过将抗高血压功能肽段异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP）和缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP）反式链接并通过体外和体内生物活性实验验证的一种的抗高血压的合成六肽。

背景技术

我国高血压患病率的态势越来越严峻，当前常见的治疗高血压的药物有以下六种：利尿剂（可能引起低血钾症，影响糖代谢，使糖耐量下降）、β－阻滞剂（可带来中枢神经***、消化***以及血管***的不良反应）、α－阻滞剂、钙拮抗剂（会导致水肿、头痛、潮红、多尿、低血压以及心脏传导受阻）、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）和血管紧张素II受体阻滞剂（可引起干咳、血钾高、甚至血管性水肿）。由于现有大部分药物都有较强的副作用，所以科学家们一直致力于开发高效低毒的药品或食品，譬若说，含有抑制血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE,EC3.4.15.1）活性的小肽的功能食品或药品，使高血压患者得益，本发明就是基于此背景诞生的。ACE酶是一种外肽酶，是调节血压的重要因子，主要存在于血管的内皮细胞，在肺毛中含量最为丰富。根据文献：赵海珍,陆兆新,刘战民等.天然食品来源的血管紧张素转换酶抑制肽的研究进展[J].中国生化药物杂志,2004,25(5):315-317及文献：陈强.血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂联合应用治疗肾小球疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10(3):274-277的报道，ACE酶的主要作用有两个，一个是使得血管紧张素I(Ang I)转化为血管紧张素II(Ang II)，另外一个是使缓激肽失活，以这两个作用影响肾素－血管紧张素***（RAS）来完成血压的调节。血管紧张素II可以与血管组织中的特异性受体AT1相结合，通过血流动力学作用，使得血管收缩，收缩肾小球出球小动脉，使肾血流量下降，肾小球毛细血管内压升高，缓激肽可以通过血流动力学作用，使血管舒张，舒张肾小球出球小动脉，使肾血流量上升，肾小球毛细血管内压降低。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种高效低毒的通过抑制ACE酶活性来实现抗高血压作用的活性肽。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抗高血压活性肽，其氨基酸序列分别为：缬氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)-异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(简称VPPIPP)。本发明的活性肽VPPIPP选择了抗高血压功能肽段：IPP和VPP，通过反式链接形成N-末端和C-末端之间的近似“回文结构”。由于ACE酶C端催化位点有易受到Ang I(DRVYIHPFHL)的Pro、Phe和His基团影响的部位，而VPPIPP的C端第四个氨基酸也为Pro，与Ang I相类似。因此VPPIPP会比IPP和VPP顺式链接形成的IPPVPP具有更好的抗高血压能力。

本发明的第二个目的是提供活性肽VPPIPP在制备预防或治疗高血压的药物或食物中的应用。

由此，本发明的第三个目的是提供一种抗高血压的组合物，其中含有活性肽VPPIPP作为有效成分，并含有常规药用载体和/或赋形剂。

本发明的活性六肽VPPIPP能够采用本领域常规方法制备，如采用固相多肽合成方法合成，具体包括以下具体步骤：

首先在脯氨酸二氯树脂上接入芴甲氧羰基脯氨酸，同时加入TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤3次去除末端芴甲氧羰基基团，然后用六氢吡啶进行脱保护，脱保护结束后再用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤6次。抽干后加入芴甲氧羰基异亮氨酸，TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤3次，用六氢吡啶进行脱保护，再用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基脯氨酸，TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤3次，用六氢吡啶进行脱保护，再用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基脯氨酸，TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤3次，用六氢吡啶进行脱保护，再用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基缬氨酸，TBTU和DIEA进行偶联，偶联时间为30分钟，并用20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤3次，用六氢吡啶进行脱保护，再用体积比为20%的哌啶/二甲基甲酰胺洗涤6次抽干，最后通过半制备型反相高效液相色谱(反相柱：VYDAC－C18柱(4.6×250mm，5μm)；线性梯度：溶液A(溶解于分析纯级乙腈的0.1%（v/v）三氟乙酸)，梯度：5%-30%（v/v）25分钟、100%（v/v）25.1分钟、停止30分钟；溶液B(溶解于纯水的0.1%（v/v）三氟乙酸)，梯度：95%-70%（v/v）25分钟、0%25.1分钟、停止30分钟；流速：1.0毫升/分钟；分离收集洗脱峰，冻干后备用。

本发明的六肽VPPIPP是基于已经得到广泛应用的两种三肽IPP和VPP反式链接成的，拥有较好的抗高血压能力，由体外和体内生物活性进行验证。本发明获得的具有抗高血压能力的合成六肽，能够用于抑制血管紧张素转化酶（ACE酶）的活性，降低血管紧张素II（Ang II）的生成水平，达到降低血压的效果。该抗高血压活性肽具有高效低毒的特点，对于开发治疗高血压药物和功能食品有着较好的应用前景。由于能通过人工化学合成技术进行大规模制备，为将来药物开发中低成本和高产率的制备奠定了基础。

附图说明

图1为大鼠喂养异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(简称IPP)（1.5mg/kg）后收缩压（Systolic Blood Pressure，SBP）与时间的关系图；

图2为大鼠喂养VPPIPP（1.5mg/kg）后收缩压（Systolic Blood Pressure，SBP）与时间的关系图；

图3为空白组大鼠收缩压（Systolic Blood Pressure，SBP）与时间的关系图。

具体实施方式

下面进一步阐述本发明。

六肽分子VPPIPP抗高血压活性测试：

实验材料：

新西兰大白兔：上海交通大学药学院动物实验中心提供；20周龄雄性高血压模式大鼠（SHR）：上海实验动物中心提供；IPP、VPPIPP，吉尔生化（上海）有限公司制备；微量移液器（100～1000μL，20～200μL，10～100μL，0.5～10μL），Eppendorf Ltd；过滤器（Φ50mm），上海医药工业研究所；微孔滤膜（Φ50mm，孔径为0.22μm），上海摩速科学器材有限公司；Centrifuge 5415 D小型高速离心机，Eppendorf Ltd；

10层析***，Superdex 30 prep grade层析柱(GE Healthcare,USA)；Zorbax SB-C18反相色谱柱(Agilent)；摩尔超纯水机，上海摩勒科学仪器有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器厂；JY2002型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；手提式压力蒸汽灭菌器，上海医用核子仪器厂；HWS26型电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；Lab Dancer试管振荡器，IKA Works Guangzhou；Electrolux BCD-252T型冰箱，伊莱克斯（中国）电器有限公司；DW-HW138型超低温冰箱，中科美菱低温科技有限责任公司；分析天平，Meitelei-tolido,German；大鼠血压计：SoftronBP-98A，北京软隆生物技术有限公司。

合成六肽VPPIPP的体外ACE酶抑制活性结果分析：

马脲酰组氨酰亮氨酸（hippuryl-L-histidyl-L-leucine，HHL）在ACE酶的催化下快速分解产生马尿酸(Hippuric Acid，HA)和二肽histidyl-leucine(HL)，加入ACE酶抑制剂后，ACE酶的活性受到抑制，HA和HL的生成量减少，通过RP-HPLC方法（色谱柱：Zorbax SB-C18柱(

5μm,4.6mm×250mm；流动相：20%(v/v)分析纯乙腈＋0.1%(v/v)三氟乙酸；流速：1.0毫升/分钟)）测定228nm下HA的生成量，按下列公式评价ACE酶抑制剂对ACE酶的抑制率。

ACE酶抑制率(%)=100×(A对照－A样品)/(A对照－A空白)

A对照：100mM硼酸钠缓冲液(BBS，pH8.3)代替六肽时生成HA的峰面积；A样品：六肽样品时生成HA的峰面积；A空白，盐酸先于HHL加入时100mM硼酸钠缓冲液(BBS，pH8.3)代替六肽时生成HA的峰面积。反应体系和条件见表1：

表1

本实施例中的ACE酶通过兔肺提取，经过酶活力测定，证明其酶活力为0.732mU/mL（一个酶单位(U)定义为在本实验条件下，每min催化三肽底物(HHL)生成1μmol产物HA时所需的酶量），满足实验要求。于是对合成的VPPIPP以及已经得到广泛应用的两种三肽缬氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)（简称VPP）、异亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)（简称IPP）进行试验，结果见表2，从结果可以看出，实验测得的抗高血压小肽在小肽浓度为10μM时的平均抑制率的相对大小为IPP>VPP≈VPPIPP。上述结果表明本发明多肽VPPIPP对ACE酶有抑制作用，进而也说明本发明多肽VPPIPP有降低血压的功效。

表2

六肽VPPIPP的体内生物活性结果分析：

六肽在体内与ACE酶反应前，还要经过消化和吸收的作用，而且在体内的理化环境十分得复杂，在体外进行的模拟结果也许不够精确。因此我们通过对自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat SHR）饲喂生物活性肽后血压的变化来衡量六肽的抗高血压效果。根据体外的活性数据的特点，选择了阳性对照IPP和VPPIPP进行体内的生物活性验证实验，表3中为大鼠给药类别：

表3

图1、2为大鼠（体重均为400g）灌胃后的血压变化情况，由试验结果可以看出，SHR高血压大鼠在喂食了二种抗高血压活性肽后，血压均发生了下降。大鼠喂养IPP（1.5mg/kg体重）后，大鼠的血压有明显的下降波谷，血压初始为195左右的正常高血压水平，在喂食IPP后1小时左右后开始下降，给药后3小时左右，下降到最低160～165，给药6小时后又重新恢复到了195～200左右的正常高血压水平，如图1所示。大鼠喂养VPPIPP（1.5mg/kg体重）后，血压值也出现了明显的波谷，药物的有效时间大约为4小时，血压在0.5h后开始下降，从200左右的高血压水平下降到150左右，最低点出现在给药2小时后，给药4小时后又恢复到初始的200水平，如图2所示。空白组大鼠饲喂了4mL去离子水后，虽然得到的数据不是十分的理想，数据的标准差略大，但是可以明显判断出，血压没有明显的降低，如图3所示。上述结果表明，在体内试验中本发明六肽VPPIPP拥有比IPP更好的降血压效果。

Claims (3)

1.一种抗高血压活性肽，其特征在于：该活性肽的氨基酸序列为：缬氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸。

2.如权利要求1所述的抗高血压活性肽在制备预防或治疗高血压的药物或食物中的应用。

3.一种抗高血压的组合物，其中含有权利要求1中所述的活性肽作为有效成分，并含有常规药用载体和/或赋形剂。

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