CN112680443B - 一种启动子pCalm1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种启动子pCalm1及其应用，所述启动子pCalm1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述启动子pCalm1能应用在重组腺相关病毒中，使外源基因得以在新皮层中高效表达，在神经环路示踪领域和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于神经工程技术领域，具体涉及一种启动子pCalm1及其应用。
背景技术
新皮层是哺乳动物中枢神经***的一部分，它参与包括感觉、感知、随意运动、学习、认知等多种重要的功能。对新皮层与各核团之间连接的神经环路的解析，可以帮助我们更好地认识大脑的高级功能。对新皮层的研究也能帮助我们理解与皮层相关神经疾病的致病机理，进而寻找其治疗方法。然而，目前尚没有对新皮层高效标记的病毒工具，阻碍了对新皮层研究。
腺相关病毒是一种无包膜的单链DNA病毒。重组腺相关病毒(rAAV)是在野生型AAV基础上改造而成的重组型病毒。重组腺相关病毒由于其具有能介导基因在哺乳动物体内长期稳定表达、免疫原性低、宿主范围广等优点，已经成为神经科学领域中广泛使用的病毒工具，也是目前中枢神经***疾病临床实验中应用最广泛的基因治疗载体工具。
在应用rAAV于神经科学研究及临床治疗的过程中，如何提高基因表达的时空特异性和表达水平是基因递送的关键。调控外源基因表达的策略直接影响了基因递送的效率和安全性。对于神经科学研究而言，若要实现在特定的神经环路中标记特异的神经元，则要对不同的脑区或核团进行标记。对于神经***疾病的基因治疗而言，若要干预不同的神经***疾病，就要对全脑或不同亚型的神经元进行操纵。其中一个重要的方法是选择不同血清型的rAAV病毒。目前已有的报道中，适用于神经***的AAV血清型有：1型、2型、5型、6型、8型、9型、 DJ、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、Retro、rh10等十几种。不同血清型的病毒对不同的脑区具有不同的感染效率及扩散能力，因此，我们可以根据研究对象或治疗靶点，选择不同的rAAV血清型作为基因递送载体。然而，由于中枢神经***的复杂性，这些血清型远无法满足当前基因递送特异性的需求。另一个方法是应用组织特异性的启动子在rAAV基因组中。启动子是基因表达调控过程中必要的顺式作用元件。在具有表达特异性启动子的调控下，外源基因一般只在某些特定的细胞类型或脑区中表达。在rAAV中使用特异性启动子来驱动基因表达，能提高基因表达的效率，降低rAAV感染过程中产生的免疫反应。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种新皮层高效表达的启动子pCalm1及其应用。所述启动子pCalm1能应用在重组腺相关病毒中，使外源基因得以在新皮层中高效表达，在神经环路示踪领域和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种启动子 pCalm1，所述启动子pCalm1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，启动子pCalm1是钙调蛋白1(Calm1)基因的部分序列，所述序列选取了Calm1 基因的转录起始位点附近部分序列，以及第一外显子和第二外显子部分序列，将他们拼接成共2327bp的序列。
进一步地，所述启动子pCalm1在新皮层中高效表达。
另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，包括上述所述的启动子。
进一步地，所述重组腺相关病毒载体包括Paav-pCalm1-荧光蛋白、Paav-pCalm1-功能性蛋白或Paav-pCalm1-治疗性蛋白。
进一步地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；
优选地，所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。
Paav-pCalm1-荧光蛋白(荧光蛋白包括eYFP、tdTomato)可以实现神经环路多颜色示踪。 Paav-pCalm1-功能性蛋白(所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白)可以制得激活或者抑制特定神经元的重组腺相关病毒。Paav-pCalm1-治疗性蛋白可以应用于基因治疗。
进一步地，所述重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP采用Paav-hSyn-eYFP作为骨架载体，向该载体中替换hSyn为pCalm1启动子，得到重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP。
进一步地，所述重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP的制备方法包括以下步骤：将启动子pCalm1克隆于PUC-57载体得到PUC57-pCalm1载体；采用限制性内切酶MluI-HF和 BamHI-HF处理Paav-hSyn-eYFP载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理PUC57-pCalm1载体；对两种酶切产物进行回收、纯化、连接，得到重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP。
另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，包括上述任一所述的重组腺相关病毒载体。
进一步地，所述重组腺相关病毒包括AAV8-retro-pCalm1-荧光蛋白、AAV8-retro-pCalm1- 功能性蛋白或AAV8-retro-pCalm1-治疗性蛋白；
优选地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；
优选地，所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。
重组腺相关病毒AAV8-retro-pCalm1-eYFP、AAV8-retro-pCalm1-tdTomato可以有效逆向跨突触标记纹状体到皮层的神经环路，并表达高荧光强度的eYFP或tdTomato。
再一方面，本发明提供了一种试剂盒，包括上述所述的启动子pCalm1、上述任一所述的重组腺相关载体或上述任一所述的重组腺相关病毒。
再一方面，本发明提供了一种上述所述的启动子pCalm1、上述任一所述的重组腺相关载体、上述任一所述的重组腺相关病毒或上述所述的试剂盒在制备神经环路示踪和/或操控神经细胞和/或基因治疗试剂中的应用。
再一方面，本发明提供了一种神经网络示踪剂，包括Paav-pCalm1-荧光蛋白和/或包括 Paav-pCalm1-荧光蛋白的重组腺相关病毒；
优选地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；
优选地，所述重组腺相关病毒包括AAV8-retro-pCalm1-eYFP、AAV8-retro-pCalm1- tdTomato。
再一方面，本发明提供了一种上述所述的神经网络示踪剂在纹状体-皮层环路示踪中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明启动子pCalm1，在新皮层具有高效表达效率，在新皮层可以实现外源基因高效表达，提高病毒感染后的表达特异性，其在神经环路示踪，基因治疗领域具有广泛的应用前景；
(2)本发明启动子pCalm1在细菌和哺乳动物细胞中无细胞毒性；
(3)本发明重组腺相关病毒载体采用pCalm1作为启动子，在新皮层具有高效表达效率；
(4)本发明重组腺相关病毒在大脑可以高效地逆向标记纹状体到皮层的神经环路，标记效率高，感染能力强。
附图说明
图1是本发明Paav-pCalm1-eYFP载体的构造流程图；
图2是本发明AAV8-retro-pCalm1-eYFP在纹状体及皮层的表达效率图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1构建PUC57-pCalm1载体
pCalm1启动子是钙调蛋白1(Calm1)基因的部分序列，所述序列选取了Calm1基因的转录起始位点附近部分序列，以及第一外显子和第二外显子部分序列，将他们拼接成共2327bp 的序列。所述启动子pCalm1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将所述启动子pCalm1经过人工合成后克隆于PUC-57载体得到PUC57-pCalm1载体。
实施例2构建重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP
本实施例由于采用YFP作为启动子的报告基因，因此在构造重组载体时，选用了含有YFP 基因的重组腺相关载体Paav-hSyn-eYFP作为载体骨架来连接pCalm1启动子，步骤如下：
如图1所示，采用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理Paav-hSyn-eYFP载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和BamHI-HF处理PUC57-pCalm1载体，37℃下酶切3h，酶切体系如表1和表2所示，回收酶切产物后采用链接预混液(2×ligation premix，TAKARA)在16℃下进行连接 30min，体系如表3所示，得到连接成功的Paav-hSyn-eYFP载体。
表1 Paav-hSyn-Eyfp载体酶切体系
| 试剂 | 用量 |
| 酶切缓冲液10×CutSmart Buffer | 5μL |
| MluI-HF | 1μL |
| BamHI-HF | 1μL |
| Paav-hSyn-Eyfp | 1μg |
| ddH2O | 补齐至50μL |
表2 PUC57-pCalm1载体酶切体系
| 试剂 | 用量 |
| 酶切缓冲液10×CutSmart Buffer | 5μL |
| MluI-HF | 1μL |
| BamHI-HF | 1μL |
| PUC57-pCalm1 | 1μg |
| ddH2O | 补齐至50mL |
表3连接体系
| 试剂 | 用量 |
| 连接预混液2×ligation premix | 5μL |
| Paav-eYFP连接骨架 | 0.5μL |
| pCalm1连接片段 | 4.5μL |
实施例3重组腺相关病毒AAV8retro-pCalm1-eYFP的制备
本实例采用三质粒共转染法制备病毒。病毒制备前，需要将包装病毒所需质粒进行中提，包括重组腺相关病毒载体Paav-pCalm1-eYFP、包装质粒AAV8-retro-RCB和辅助质粒。具体步骤如下：
制备细胞：将293T细胞铺在含有全培养基(10％胎牛血清、1％双抗)培养皿中，于培养箱中培养。
制备转染试剂：吸取5.25mL的超纯水、75μg包装质粒、75μg重组质粒、75μg辅助质粒和 800μL的氯化钙溶液，轻轻混匀。向前述试剂中，加入等体积2×HBS，涡旋后静置30min。
转染细胞：向每盘细胞加20μL氯奎，加入转染试剂后培养。
收取病毒：72h后将前述转染后的细胞收集于离心管以3000rpm离心30min。弃上清后加入细胞裂解液，随后用反复冻融法裂解细胞。得到含有病毒的细胞破碎液。
纯化病毒：将上述细胞破碎液以11500rpm离心30min，弃上清后加入200μL HBS混匀，加入200μL氯仿以12000rpm离心5min，取上清，加入100μL 2.5mM NaCl和100μL 40％PEG8000，涡旋混匀，4℃冰箱过夜。将前述过夜样品以12000rpm离心30min，弃上清，加入30μL的HBS、 0.5μL核酸酶，静置30min。随后加入30μL氯仿，以12000rpm离心5min。纯化完成后于-80℃冰箱保存。
测定滴度：用AAV滴度测定染料法荧光定量试剂盒(TAKARA公司)对前述纯化病毒进行滴度测定，滴度结果为1.0×1013VG/mL。
实施例4重组腺相关病毒标记小鼠纹状体-皮层神经环路
将纯化后的重组腺相关病毒，采用立体定位注射至小鼠右侧纹状体(AP:+0.62；R:+1.75；D: 3.5)。所述重组腺相关病毒衣壳是AAV8-retro，具有逆向感染能力，能够感染所注射纹状体上游的皮层的神经元。三周后，将小鼠灌流取脑，利用免疫组化方法切片染色，并观察脑片结果。实验结果如图2所示，eYFP在小鼠新皮层均有很高的表达效率。
综上，本发明在小鼠上进行验证，证明启动子pCalm1在新皮层具有高效表达水平。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种启动子pCalm1及其应用
<130> CP120010890C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2327
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttccccaag gccaaccacc gtgtcctcaa cacagtcctc tcgcctctac agctaaggtt 60
ggattccgcc tccccgcggc tgtcctcagc ccctagatct cctccaggtc ctcccctgtg 120
ggggacccag gattggtggc tctgcaacct cgaagccacc aggagtggtg ggagggggga 180
cacacaggtg aagtggggct gagtgacgga cacgcgcctg gaagcccggg acggcccccc 240
agatttcgct acgcaggcat tccagctcta gaggactctt gcagcaacag accagcaccc 300
tcgctcaggt ctccgactcc ccagtgaccc ctgcccgcgt aatgggcccg ccgcgccggg 360
cgcgcctggg gggcggagcc ttgcggtgag gtccggctgc cgcagcgccg ccctgcgcga 420
ggcggtactg ccgcggcgga gggataccgc gcaccgtata tatatcgcgg cacacaggct 480
cgcgctacgg cagtggtgct gggagtctcg tgtccgtggt gccgttactc gaagtcgggc 540
ggcggctgag gctcagcgca caacgcaggt agcgcgttag cagcagcaga agcggaggca 600
cctcggcggt cacagcccct gcgctggtgc agccaccctc gcctgctccg ttcttccttc 660
cttcgctcgc accatggtag gttgggatcg gcagtggcag acgtagcagc tgcccgagct 720
ttctgaacag atttgtagtt gagtcttggg gtctccccct tttcctggtt gaggttaccc 780
cctaccccat tttgccaggt gttacgcagc agctgcagtg aaaggggatg tattttcggg 840
tttgcatctc cgctctggct gccagagaac ctcctctgag ttttgggcgc ctctggggct 900
ggactctaca gtgggctgtg cgcgggctgg agccgctgcc acagctgcac cggggccttc 960
cgcatccacc ccctccgcca gccccgcacc cactgcatcc aacgcgccgc acccgggctg 1020
cctgcagcgc agcgcctcgg ccggggccag cggggcgggg gagccgggcg gggcaggccg 1080
cgacgtcccg gtagtcagtc cccgaccgcg gagaatgaat gggtcgcggc gagccgggag 1140
acgtacaggg cttggaccgc ggcctcgggg tgtcctcagc caccttcaga ccccctgacc 1200
agcccagtcg ggagtccccc ctcgcttgcg gtcccctcct tcctcccggg gggcgcggcg 1260
cgggcgtgag ctgggaagga aggagccggg gaagggtggg gttgggggca ggaaggcgaa 1320
ggctgggggg cggagagggc ggaagcggcc gccctgcgcc cgggcggggc cccgcagggt 1380
ggccgcgcgc gtggctgggc cgtgcgacct cggtccccct cccggtgccg cgcgagacgg 1440
gcgcgatcgc tcgtgtccgc ggggaggccc cttcccgcgg gaggtgctcg gctcgcgcta 1500
attggggcgg cagggcgggg gaggagagag ttggcgcgct cctcggtttc cattagagac 1560
gcaaagtttc tgctggggag gaggcggcgg caggctcagt gcctggggga gcaggagcgg 1620
tgggaggtgc tggagatagg cagcaccacg gtcctggggc ccctttgggt cttcacccta 1680
gtgcggcccc tcgcccggca tgccccttgt ctctcgctgc tccctgggcg gcagggagat 1740
gcccatctgt acgtttccgc tttctctgcc gcctctggat tgccagatgc gaatatgtgg 1800
ttggccgtgt gcgtgtgccg tagccccctt ctccctcgcc aggcagagct gacatcacca 1860
gcagcacctt cagccctggc aaggtggcta ggtcgttctc ggcaggttct ggaacgcctt 1920
tgacccaaag ccagaatgac ttggggttga ggtgggggag tcgttgtccc gaaggtagat 1980
gcacttgaca ggcctctagt cagagaattt tcccgaggag gtggaactcc tctccttggt 2040
gagctggttt ctcctacgag gtgtgacagt gcttcctgtc gtgcaagact gacatggcga 2100
gcattacata aatcgtgtct ccatttgcct taaaagtagc ttccagtaat ggatagaagg 2160
gaagacccac ggtaccccag tactaatgaa ttcagcacac ttttaaaata ctgattagga 2220
agaaaagccc cacaatttta aagtataatt aggaaagcta ggttattatc aaccaaactt 2280
gtctagatta aattatgatc ttttctttct ctgtgtaggt gggatcc 2327
Claims (9)
1. 一种启动子pCalm1，其特征在于，所述启动子pCalm1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述启动子pCalm1在新皮层中高效表达。
2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子pCalm1。
3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包括Paav-pCalm1-荧光蛋白、Paav-pCalm1-功能性蛋白或Paav-pCalm1-治疗性蛋白；所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。
4.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的重组腺相关病毒载体。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒包括AAV8-retro-pCalm1-荧光蛋白、AAV8-retro-pCalm1-功能性蛋白或AAV8-retro-pCalm1-治疗性蛋白；所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的启动子pCalm1、权利要求2-3任一项所述的重组腺相关病毒载体或权利要求4-5任一项所述的重组腺相关病毒。
7.权利要求1所述的启动子pCalm1、权利要求2-3任一项所述的重组腺相关病毒载体、权利要求4-5任一项所述的重组腺相关病毒或权利要求6所述的试剂盒在制备神经环路示踪剂或操控神经细胞试剂或基因治疗试剂中的应用。
8. 一种神经网络示踪剂，其特征在于，包括Paav-pCalm1-荧光蛋白或包括Paa-pCalm1-荧光蛋白的重组腺相关病毒；所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；所述重组腺相关病毒包括AAV8-retro-pCalm1-eYFP、AAV8-retro-pCalm1-tdTomato；所述pCalm1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
9.权利要求8所述的神经网络示踪剂在纹状体-皮层环路示踪中的应用。
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Effective date of registration: 20210926 Address after: 518051 Shenzhen integrated circuit design and application Industrial Park, south of chaguang Road, Shuguang community, Xili street, Nanshan District, Shenzhen, Guangdong 312 Applicant after: Shenzhen Enji Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 1068 No. 518055 Guangdong city of Shenzhen province Nanshan District Shenzhen University city academy Avenue Applicant before: SHENZHEN INSTITUTES OF ADVANCED TECHNOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
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