JP2020068734A

JP2020068734A - Ｓｐｒをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びそれを含む組成物

Info

Publication number: JP2020068734A
Application number: JP2018206643A
Authority: JP
Inventors: 宏一瀬; Hiroshi Ichinose; 怜原; Rei Hara; 勇輝吉田; Yuki Yoshida; 慎一村松; Shinichi Muramatsu; 節子加藤; Setsuko Kato
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC; Jichi Medical University
Current assignee: Tokyo Institute of Technology NUC; Jichi Medical University
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-05-07
Also published as: JP2023041849A

Abstract

【課題】ＳＰＲ関連疾患の治療及び予防に使用し得る新規薬剤の提供。【解決手段】ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。【選択図】なし

Description

本発明は、セピアプテリンレダクターゼ（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びそれを含む組成物に関する。

ＳＰＲは、セピアプテリンから７，８−ジヒドロプテリン（ＢＨ２）への変換を触媒する酸化還元酵素である（図１を参照）。ＢＨ２はその後、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）によってテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）へと変換される。またＳＰＲは、６−ピルボイルテロラヒドロプテリン（ＰＴＰ）からＢＨ４への変換も触媒する。生体内におけるＳＰＲ遺伝子の異常、ＳＰＲの産生量の低下及びＳＰＲの不活性化は、ＢＨ４の産生量の低下につながる。

ＢＨ４は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びトリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）の補酵素として機能することが知られている。生体内におけるＢＨ４の産生量の低下は、これらのヒドロキシラーゼの活性の低下につながる。ＰＡＨはフェニルアラニンをチロシンへと変換する酵素である。ＰＡＨの不活性化は、生体内におけるフェニルアラニンの蓄積につながり、高フェニルアラニン血症の原因となり得る。ＴＨはチロシンをＬ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）へと変換する。Ｌ−ＤＯＰＡはドーパミン、ノルアドレナリン及びアドレナリンの前駆体である。ＴＨの不活性化は、生体内におけるＬ−ＤＯＰＡの減少につながり、ジストニア、パーキンソン病などの原因となり得る。ＴＰＨは、トリプトファンを５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）へと変換する。５−ＨＴＰはセロトニン（５−ＨＴ）の前駆体である。ＴＰＨの不活性化は、生体内におけるセロトニンの減少につながり、摂食障害（例えば肥満）、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、および排尿障害などの原因となり得る。ＢＨ４はまた、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の補酵素として機能することが知られている。ＮＯＳの不活性化は、活性酸素種の増加及び一酸化窒素生物活性の減少につながり、心血管疾患（心臓病、不整脈、動脈硬化など）、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞など）、脳血管障害（脳梗塞など）、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害などの原因となり得る。

ＳＰＲをコードする遺伝子の異常に起因する先天性代謝異常症として、ＳＰＲ欠損症が知られている。ＳＰＲ関連疾患であるＳＰＲ欠損症の治療法として、Ｌ−ドーパ（Ｌ−ＤＯＰＡ）と５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰ）の補充療法が知られている。

ＳＰＲ関連疾患である心血管疾患の治療法として、ＢＨ４の経口投与が検討された（非特許文献１）。しかし、経口投与されたＢＨ４は血中で速やかに酸化されてジヒドロビオプテリン（ＢＨ２）に変換されてしまい、有効ではなかった。

特開２０１７−１２３８４０号公報国際公開第２００８／１２４７２４号国際公開第２０１２／０５７３６３号

Ｃｕｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０；１２５（１１）：ｐｐ．１３５６−６６

本発明は、ＳＰＲ関連疾患の治療及び予防に使用し得る新規医薬の提供を目的とする。

本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ＳＰＲ欠損症の疾患動物モデルであるＳＰＲＫＯマウスに対して、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターが有効に作用することを見出し、本発明に至った。

本発明の一以上の実施形態は、以下の＜１＞〜＜１４＞を包含する。
＜１＞
セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
＜２＞
前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、＜１＞に記載の組換えベクター。
＜３＞
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、＜１＞又は＜２＞に記載の組換えベクター。
＜４＞
野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号７）のアミノ酸配列中４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列中４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列中４４６位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、＜３＞に記載の組換えベクター。
＜５＞
前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター配列、チュブリンαＩプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質（ｈＧｆａ２）プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列から成るグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、＜３＞又は＜４＞に記載の組換えベクター。
＜６＞
前記ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む、＜３＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の組換えベクター。
＜７＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物。
＜８＞
前記ＳＰＲ関連疾患は、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、摂食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（うつ病性障害及び双極性障害など）及び自律神経障害からなる群から選択される、＜７＞に記載の組成物。
＜９＞
皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与、又は吸入投与される、＜７＞又は＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞
他の医薬と組み合わせて投与される、＜７＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１１＞
前記他の医薬が、Ｌ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬である、＜１０＞に記載の組成物。
＜１２＞
それを必要とする患者に＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクター又は＜７＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防方法。
＜１３＞
ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防における使用のための、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクター。
＜１４＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用医薬の製造のための、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の組換えベクターの使用。

本発明の組換えベクターを使用することによって、ＳＰＲ関連疾患を効果的に治療及び予防することができる。本発明の組換えベクターは脳内移行性を有するようにその性質を調整することが可能であり、またＢＨ４よりも生体内で安定である点などから、ＳＰＲ関連疾患に対して有効な医薬として使用可能である。

図１は、ＢＨ４の生合成経路を示した図である。図２は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の体重変化を示す。各群ｎ＝３。ＷＴ−ＰＢＳ：野生型マウスにＰＢＳを投与；ＫＯ−ＰＢＳ：ＳｐｒＫＯマウスにＰＢＳを投与；ＷＴ−ＡＡＶ：野生型マウスにｒＡＡＶベクターを投与；ＫＯ−ＡＡＶ：ＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクターを投与。なお、ＷＴ−ＰＢＳ、ＫＯ−ＰＢＳ、ＷＴ−ＡＡＶ、ＫＯ−ＡＡＶは、他の図でも同様の意味である。図３は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の体長変化を示す。図４は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後の総ビオプテリン量の変化を示す。図５は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後のモノアミン量の変化を示す。図６は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後のＰｈｅ／Ｔｙｒ値の変化を示す。図７は、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクター又はＰＢＳを投与した後におけるＳＰＲタンパク質の発現量変化をウェスタンブロッティングによって定量した結果を示す。図８は、ＢＨ４を野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスに腹腔内投与した後の体重変化を示す。

＜本発明の組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクターである。

本発明において、「セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）」は、天然のＳＰＲのみならず、天然のＳＰＲと高い同一性を有し、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドを含む。本発明におけるＳＰＲは特に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来であり得る。ヒトＳＰＲ、マウスＳＰＲ及びラットＳＰＲのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、３及び５で示される。一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号１、３又は５のアミノ酸配列において、１個以上（例えば１〜５０個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加したアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。アミノ酸の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。

本発明の組換えベクターに含まれるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドにおいて、相互に置換可能なアミノ酸残基の例は以下の通りである。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン。
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸。
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン。
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
アミノ酸残基が置換されたＳＰＲは、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチドであるか、あるいは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を有するヌクレオチド配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

また一実施形態において、本発明の組換えベクターは、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列と、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Kalin, S. and Altschul, SF., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 (6), pp 2264-2268； Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1993, 90(12), pp 5873-5877）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J Mol Biol, 1990, 215(3), pp 403-410）。ＢＬＡＳＴＮを用いてヌクレオチド配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。

本発明において「組換えベクター」は、目的のポリヌクレオチド（本発明では、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチド）を目的の標的細胞に導入する１つの手段である。本発明において使用される組換えベクターは特に限定されないが、例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、センダイウィルスベクター、プラスミドベクター、リポソームやポリマーとの複合体などが挙げられる。好ましくは、本発明の組換えベクターは組換えＡＡＶベクター（以下で、「本発明のｒＡＡＶベクター」とも呼ぶ）である。目的のベクターを得る又は構築するための方法として、当前記分野で公知であるような、標準的な遺伝子操作技術、配列決定法、制限酵素消化、ポリメラーゼ反応、ＰＣＲ、ＰＣＲＳＯＥｉｎｇ、ライゲーション、組換え反応（例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術）、部位特異的突然変異誘発プロトコールなどを利用できるが、これらに限定されるわけではない。

野生型ＡＡＶゲノムは、全長が約５ｋｂのヌクレオチド長を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、センス鎖又はアンチセンス鎖である。ＡＡＶゲノムは、一般に、ゲノムの５’側及び３’側の両末端に約１４５ヌクレオチド長のインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）配列を有する。このＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製起点としての機能及びこのゲノムのビリオン内へのパッケージングシグナルとしての機能等の多様な機能を有することが知られている。ＩＴＲに挟まれた野生型ＡＡＶゲノムの内部領域（以下、単に「内部領域」とも呼ぶ）は、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子及びカプシド（ｃａｐ）遺伝子を含む。これらｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子は、それぞれ、ウイルスの複製に関与するタンパク質Ｒｅｐ及び正２０面体構造の外殻であるキャプソメアを形成するカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の少なくとも１つ）をコードする。

本発明の組換えベクターは、好ましくは天然由来のアデノ随伴ウイルス１型（ＡＡＶ１）、２型（ＡＡＶ２）、３型（ＡＡＶ３）、４型（ＡＡＶ４）、５型（ＡＡＶ５）、６型（ＡＡＶ６）、７型（ＡＡＶ７）、８型（ＡＡＶ８）、９型（ＡＡＶ９）などから作製できるｒＡＡＶベクターである。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１７２９（ＡＡＶ３）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＹ５３０５７９（ＡＡＶ９）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、５型及び９型がヒト由来である。本発明において、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９に由来するカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３など）を利用することが好ましい。ＡＡＶ１とＡＡＶ９はヒト由来のＡＡＶのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている(Taymans, et al., Hum Gene Ther 18:195-206, 2007など)。

本発明のｒＡＡＶベクターは、特に限定されないが、例えば特許文献２（国際公開２００８／１２４７２４）に記載のＡＡＶベクターや、特許文献３（国際公開２０１２／０５７３６３）に記載のＡＡＶベクターであり得る。これらの文献に開示されたＡＡＶベクターは生体内の血液脳関門を通過可能であり、末梢投与（例えば静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与など）によっても神経細胞に効率的に遺伝子送達することができる。したがって、脳実質内投与などの慎重な操作を必要とする投与形態が不要であるので、より高い安全性が期待できる。

本発明のｒＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、好ましくは特許文献２や特許文献３に記載されるように、野生型のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニンなどの別のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。例えば、野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）中の４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）中の４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列、又は野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）中の４４６位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列を有し、キャプソメア (capsomere)を形成可能である変異タンパク質が挙げられる（特許文献２及び特許文献３参照）。また、本発明のＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、上記アミノ酸配列７〜９のいずれか１つのアミノ酸配列に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつキャプソメアを形成可能であるタンパク質が含まれる。また、例えば、配列番号７〜９のいずれかのアミノ酸配列において、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個又は１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつキャプソメアを形成可能であるタンパク質が挙げられる。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組み合わせを同時に含んでもよい。別の実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクターに含まれるカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、ＶＰ２、ＶＰ３など）と一緒になってキャプソメアを形成する機能を有する。また、当該キャプソメア内には、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドがパッケージングされる。

本発明のｒＡＡＶベクターにおいて用いられるＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型ＡＡＶゲノム又はｒＡＡＶゲノムをリクルートしてパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶベクターを形成する機能など公知の機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含み得る。本発明において、好ましくは、公知のＡＡＶ３由来のＲｅｐタンパク質が使用される。

本発明において用いられるＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＴＲ配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型ＡＡＶゲノム（又はｒＡＡＶゲノム）をパッケージングする機能、本発明のｒＡＡＶベクターを形成する機能などの公知の機能を同程度に有するＲｅｐタンパク質をコードする限り、上記と同様の数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入及び／又は付加を含んでもよい。本発明において、好ましくは、ＡＡＶ２又はＡＡＶ３由来のｒｅｐ遺伝子が使用される。

本発明の一実施形態において、野生型ＡＡＶゲノムの内部領域にコードされるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）並びにＲｅｐタンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチドをＡＡＶヘルパープラスミドに組み込んで用いられる。本発明で用いるカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）並びにＲｅｐタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種又はそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質のうちの１種以上がＡＡＶゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）及びＲｅｐタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、ＡＡＶヘルパープラスミドとして提供される。

本発明のｒＡＡＶベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドは、野生型ゲノムの５’側および３’側に位置するＩＴＲの間に位置する内部領域（すなわち、ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットで置換することにより作製できる。好ましくは、５’側および３’側に位置するＩＴＲは、それぞれＡＡＶゲノムの５’末端および３’末端に位置する。好ましくは、本発明のｒＡＡＶゲノムは、５’末端および３’末端に位置するＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９のゲノムに含まれる５’側ＩＴＲおよび３’側ＩＴＲを含む。一般的に、ＩＴＲ部分は容易に相補配列が入れ替わった配列（flip and flop structure）を採るため、本発明のｒＡＡＶゲノムに含まれるＩＴＲは、５’と３’の方向が逆転していてもよい。本発明のｒＡＡＶゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチドの長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のｒＡＡＶゲノムは、全長が野生型の全長である５ｋｂと同程度、例えば約２〜６ｋｂ、好ましくは約４〜６ｋｂであることが好ましい。

一般的に、組換えＡＡＶベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドは、一本鎖である場合には目的の治療用タンパク質（本発明ではＳＰＲタンパク質）を発現するまで時間（数日）を要する場合がある。この場合、導入される治療用遺伝子（本発明ではＳＰＲをコードする遺伝子）を、自己相補性を有するｓｃ（self-complementary)型となるように設計して、より短期間に効果を示すことも可能である。具体的な詳細については、例えば、Foust KD, et al.(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発明のｒＡＡＶベクター中にパッケージングされているポリヌクレオチドは、非ｓｃ型であってもよいしｓｃ型であってもよい。

一実施形態において、本発明のｒＡＡＶベクターは、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。例えばプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーターなどの通常使用される強力なプロモーター配列であってもよい。またプロモーターは、神経系細胞特異的なプロモーター配列であってもよい。神経系細胞特異的なプロモーター配列としては、例えば、シナプシンＩプロモーター配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列、Ｔｉｅ２プロモーター配列（脳毛細血管特異的プロモーター）、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）を含むプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のｒＡＡＶベクターにおいて、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チュブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーターなどのプロモーター配列も使用され得る。プロモーター配列は、単独であっても任意の複数の組み合わせであってもよい。発明のｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列をさらに含んでもよい。

本発明のｒＡＡＶベクターを調製する方法としては一般的なものを利用することができ、例えば、（ａ）カプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、ＡＡＶヘルパープラスミドと称される）、および（ｂ）本発明のｒＡＡＶベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド（ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、（ｃ）アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清よりｒＡＡＶベクターを収集する工程を含むこともできる。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。

第１のポリヌクレオチド（ａ）において、本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなどを適宜使用することができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。

第２のポリヌクレオチド（ｂ）は、プロモーターが作動可能である位置にＳＰＲをコードするポリヌクレオチドを含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加シグナル配列などを適宜含み得る。この第２のポリヌクレオチドはさらに、プロモーター配列の下流に、種々の公知の制限酵素のよって切断可能なクローニングサイトを含み得る。複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトがより好ましい。当業者は、公知の遺伝子操作手順に従って、ＳＰＲをコードするポリヌクレオチドをプロモーターの下流に組込むことができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）などを参照のこと。

本発明のｒＡＡＶベクターの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌクレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノウイルス（ＡｄＶ）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。本発明において、好ましくは、ＡｄＶヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞２９３Ｔを用いる場合、ヒトＡｄＶ由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる。このようなＡｄＶヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Agilent Technologies社のAAV Helper-Free System (カタログ番号240071)）を使用することができる。

本発明のｒＡＡＶベクターの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばMolecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている。

＜本発明の組成物＞
本発明の組成物は、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物であって、本発明の組換えベクターを含む。

本発明において「ＳＰＲ関連疾患」とは、ＳＰＲタンパク質の産生量の低下、ＳＰＲタンパク質の不活性化又はＳＰＲタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因して生じる全ての疾患を含む。ＳＰＲ関連疾患には、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ（ＴＰＨ）及び／又は一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の活性低下によって引き起る疾患を含む。ＳＰＲ関連疾患は、特に限定されないが、例えば、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、喫食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（例えばうつ病性障害又は双極性障害）、自律神経障害などが挙げられる。

本発明の組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.Aを参照）、有効成分に加えて薬学的に許容される担体及び／又は添加物を含むものであってもよい。本発明の組成物中に、有効成分である本発明のベクターは、０．１〜９９．９重量％含まれ得る。

薬学的に許容される担体又は添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることができるが、これらに限定されない。

経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ジカリウム、グリシンのような種々の賦形剤を、澱粉、好適にはとうもろこし、じゃがいもまたはタピオカの澱粉、およびアルギン酸やある種のケイ酸複塩のような種々の崩壊剤、およびポリビニルピロリドン、蔗糖、ゼラチン、アラビアゴムのような顆粒形成結合剤と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に非常に有効であることが多い。同種の固体組成物をゼラチンカプセルに充填して使用することもできる。これに関連して好適な物質としてラクトースまたは乳糖の他、高分子量のポリエチレングリコールを挙げることができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。

非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の組成物は皮膚などに局所的に投与することも可能である。この場合は、標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。

本発明の組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重６０ｋｇ）１日当たり１〜５０００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてｖｇ（ｖｅｃｔｏｒｇｅｎｏｍｅ）を利用する場合、例えば、体重１ｋｇあたり、１０９〜１０１４ｖｇ、好ましくは１０１０〜１０１３ｖｇ、さらに好ましくは１０１０〜１０１２ｖｇの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。

＜本発明のベクター及び組成物の投与経路＞
本発明のベクター及び組成物は、経口投与又は非経口投与される。非経口投与の例としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与及び吸入投与が挙げられるが、これらに限定されない。

＜併用投与＞
本発明のベクター又は組成物は、他の医薬と組み合わせて投与されて投与されても良い。当該他の医薬としては特に限定されないが、例えばＬ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬が挙げられる。他の医薬は、本発明のベクター又は組成物との配合剤の形態で投与されてもよい。あるいは、他の医薬と本発明のベクター又は組成物とは別々の製剤として投与されてもよい。他の医薬と本発明のベクター又は組成物とが別々の製剤として投与される場合には、同時投与および時間差による投与が含まれる。また、時間差による投与は、本発明のベクター又は組成物を先に投与し、他の医薬を後に投与してもよいし、他の医薬を先に投与し、本発明のベクター又は組成物を後に投与してもよい。それぞれの投与方法は同じでも異なっていてもよい。一実施形態において、本発明のベクター又は組成物を投与して体内のＳＰＲ量が増大した後に、セピアプテリンが投与される。セピアプテリンは、体内でＳＰＲによって還元されてＢＨ２となる。ＢＨ２はその後、ＤＨＦＲによってＢＨ４へと変換される。したがって、セピアプテリンを投与することによって生体内のＢＨ４量が増大し、ＳＰＲ関連疾患を良好に治療及び予防し得る。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

実施例１
ｒＡＡＶベクターの調製
特許文献３に記載の方法に従って、ＡＡＶ９由来の変異カプシドタンパク質、ＡＡＶ３由来のＩＴＲ配列などを含むｒＡＡＶベクターを調製した。詳細は以下の通りである。
（ａ）ベクターゲノムプラスミドの作成
マウスＳＰＲ遺伝子をインサートＤＮＡとしてＡＡＶベクターに組み込み、治療用ＡＡＶ９−ｍＳＰＲ（配列番号１０）を作成した。ＡＡＶベクターは、特許文献３に記載される、実験動物において経静脈投与で良好な脳への遺伝子導入が確認されている９型ベクター（ＡＡＶ９由来の変異カプシドタンパク質、ＡＡＶ３由来のＩＴＲ配列などを含む）を用いた。本研究では、広い組織で遺伝子の発現を誘導できるＣＭＶプロモーターの下流にＳＰＲ遺伝子を導入した。

（ｂ）ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
ｍＳＰＲ遺伝子を挿入したベクタープラスミドと、ウイルス複製やウイルス粒子の形成に必要とされるタンパク質（Ｒｅｐ，Ｃａｐ）を発現するＡＡＶヘルパープラスミド、および、アデノウイルスヘルパープラスミドの３つをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションすることにより、組換えＡＡＶ−ｍＳＰＲを産生するＨＥＫ２９３細胞を作製した。

（ｃ）ウイルスベクターの生成
以下の手順に従って、塩化セシウムＣｓＣｌの密度勾配による超遠心を行い、ｒＡＡＶベクターを精製した。超遠心チューブ内に１．５Ｍおよび１．２５ＭのＣｓＣｌを重層し密度勾配を作製した。ｒＡＡＶベクターを含む細胞破砕溶液を重層後、超遠心（３０，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行った。屈折率を計測してＲＩ：１．３６５〜１．３８０のｒＡＡＶベクターを含む画分を回収した。この分画を再度ＣｓＣｌ溶液上に重層し、超遠心（３６，０００ｒｐｍ、２．５時間）を行ってｒＡＡＶを含む分画を得た。

（ｄ）ウイルスベクター力価の測定（リアルタイムＰＣＲ）
精製したｒＡＡＶの１０^-2〜１０^-6の希釈系列を作製した。ＧＦＰ配列をスタンダードとしたプライマーセット（配列番号１１及び１２）を使用して、Applied Biosystems 7900HT Fast リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社）で定量した。

実施例２
マウスへのｒＡＡＶベクターの腹腔内投与
生後４週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社）、及び、ＢＡＬＢ／ｃマウスとの交配を繰り返して遺伝的背景をＢＡＬＢ／ｃとしたＳｐｒＫＯマウス（Lexicon Pharmaceuticals社）に対して、実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）及びＰＢＳ(15μl)の混合液、又はコントロールであるＰＢＳ(20μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。試料投与後のマウスの体重変化及び体長変化を測定した。結果を図２及び３に示す。ＳｐｒＫＯマウスにｒＡＡＶベクターを投与することで、投与開始２〜３日後から体重の上昇が確認された。投与開始２週間後には、ｒＡＡＶベクターを投与したＳｐｒＫＯマウスの体重及び体長は、野生型マウスと同程度となった。生体内のドーパミン量が増大すると体重増加することが知られている。したがって本実施例の結果は、本発明のｒＡＡＶベクターの投与によってマウス体内のＳＰＲ及びＢＨ４の量が増大し、チロシンのＬ−ドーパへの変換が良好に進行して最終的にドーパミン量の増大につながったためであると考えられる。

実施例３
マウスにおける総ビオプテリン量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳及び肝臓を採取し、中脳、線条体及び肝臓における総プテリジン量を測定した。プテリジン量の測定は、0.1 mM EDTA, 1 mM アスコルビン酸を含む0.2 M過塩素酸溶液でタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-蛍光検出器で分離定量することにより行った。プテリジン類の分離にはInertsil ODS-3カラムを用い、励起波長375nm、蛍光波長465nmにて検出した。総プテリジン量は、生体内におけるＢＨ４の量を反映している。結果を図４に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、ＳｐｒＫＯマウスの肝臓における総ビオプテリン量が、野生型マウスの肝臓における総ビオプテリン量と同程度となった。ＳｐｒＫＯマウスの脳における総ビオプテリン量も、ｒＡＡＶベクターの投与によって増加傾向が確認された。

実施例４
マウスにおけるモノアミン量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳を採取し、中脳及び線条体におけるドーパミンの量、並びに中脳におけるセロトニンの量を測定した。モノアミン量の測定は、0.1 mM EDTAを含む0.2 M 過塩素酸溶液を加えてタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-電気化学検出器で分離定量することにより行った。モノアミン類の分離にはEICOMPAK SC-5ODSカラムを用い、750 mVの印加電圧にて測定した。結果を図５に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、ＳｐｒＫＯマウスの脳内ドーパミン量及びセロトニン量は顕著に増大した。

実施例５
マウスにおけるフェニルアラニン代謝の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳及び肝臓を採取し、線条体及び肝臓におけるＰｈｅ／Ｔｙｒ値（チロシンの量に対するフェニルアラニンの比率）を測定した。PheとTyrの定量は、過塩素酸でタンパク質成分を除いた組織抽出液を、HPLC-蛍光検出器で分析することにより行なった。PheとTyrの分離にはInertsil ODS-3カラムを用い、励起波長240 nm、蛍光波長287 nmにて検出した。結果を図６に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によって、ＳｐｒＫＯマウスのＰｈｅ／Ｔｙｒ値は顕著に減少した。本発明のｒＡＡＶベクターの投与によってマウス体内のＳＰＲ及びＢＨ４の量が増大し、フェニルアラニンからチロシンへの変換が良好に進行したためであると考えられる。

実施例６
マウスにおけるＳＰＲの量の変化
実施例２と同様にして、野生型マウス及びＳｐｒＫＯマウスに対して実施例１で調製されたｒＡＡＶベクター（2.2 x 10¹³ vg/ml, 5μl）又はコントロールであるＰＢＳ(15μl)を腹腔内投与した（いずれも単回投与）。投与してから４週間後、マウスの脳、肝臓及び副腎を採取し、肝臓及び副腎におけるＳＰＲの発現を、抗ＳＰＲ抗体（Ikemoto K. et al., Brain Res 954: 237-46 に記載の方法に従って調製）を使用するウェスタンブロッティングによって定量した。それぞれの組織から組織抽出液を作製しタンパク質量を測定して、一定量のタンパク質（１００μｇ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。タンパク質量は、Bradofordの試薬と組織抽出液の一部を混合し、595 nmの吸光度を測定することにより定量した。分離後にタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、目的タンパク質をそれぞれの特異的抗体を用いて検出した。結果を図７に示す。ｒＡＡＶベクターの投与によってＳＰＲタンパク質の増加傾向が確認された。

参考例
ＢＨ４の腹腔内投与
４２日齢の野生型マウスおよびＳｐｒ−ＫＯマウスに対して、ＢＨ４−２ＨＣｌ（５０ｍｇ／ｋｇ，サントリー）を含むリン酸緩衝液に溶解し、１日２回、１１時間から１３時間の間隔をあけて腹腔内に７日間連続投与した。対照群にはＢＨ４を含まないＰＢＳをマウスの体重１グラム当たり0.01 mL(1匹あたり約0.1〜0.2 mL)投与した。マウスの体重変化を図８に示す。ＢＨ４の投与によってＳｐｒ−ＫＯマウスにおいて体重増加が認められたが、１週間後でも野生型の半分程度の体重までにしか回復しなかった。これは、ＡＡＶ−Ｓｐｒでは持続的にＢＨ４が増加し続けるのに対して、ＢＨ４投与ではＢＨ４が体内で速やかに分解排出されてしまうので、１日２回の投与でも十分な効果が得られないためであると考えられる。

本発明のベクター及び組成物を使用することによって、ＳＰＲ関連疾患を治療及び予防することができる。

配列番号１：ヒトＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿００３１１５．１）
配列番号２：ヒトＳＰＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＮＭ＿００３１２４．４）
配列番号３：マウスＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿０３５５９７．２）
配列番号４：マウスＳＰＲのヌクレオチド配列
配列番号５：ラットＳＰＲのアミノ酸配列（ＮＰ＿０６２０５４．１）
配列番号６：ラットＳＰＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＮＭ＿０１９１８１．１）
配列番号７：野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８：野生型ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９：野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０：実施例１で製造されたＡＡＶベクターゲノムプラスミドのヌクレオチド配列
配列番号１１：ＧＦＰ検出用プライマー１ヌクレオチド配列
配列番号１２：ＧＦＰ検出用プライマー２ヌクレオチド配列
配列番号１３：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターの５’−ＩＴＲ配列
配列番号１４：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのＣＭＶプロモーター配列
配列番号１５：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのｈＧＨイントロン配列
配列番号１６：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターのＳＶ４０ｐｏｌｙＡ配列
配列番号１７：実施例１で製造されたｒＡＡＶベクターの３’−ＩＴＲ配列

Claims

セピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
前記ポリヌクレオチドが、
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであるか、あるいは
配列番号１、３又は５のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成り、かつセピアプテリン還元活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換えベクター。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１又は２に記載の組換えベクター。
野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質（配列番号７）のアミノ酸配列中４４５位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のＡＡＶ２カプシドタンパク質（配列番号８）のアミノ酸配列中４４４位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のＡＡＶ９カプシドタンパク質（配列番号９）のアミノ酸配列中４４６位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項３に記載の組換えベクター。
前記ポリヌクレオチドが、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム／カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター配列、チュブリンαＩプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター配列、Ｌ７プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質（ｈＧｆａ２）プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列から成るグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、請求項３又は４に記載の組換えベクター。
前記ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む、ＳＰＲ関連疾患の治療又は予防用組成物。
前記ＳＰＲ関連疾患は、ＳＰＲ欠損症、高フェニルアラニン血症、ジストニア、パーキンソン病、摂食障害、アルツハイマー病、統合失調症、疼痛、性的不全、てんかん、排尿障害、心血管疾患、虚血性心疾患、脳血管障害、高血圧、糖尿病、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、睡眠障害、気分障害（例えばうつ病性障害及び双極性障害）及び自律神経障害からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、脳室内投与、髄腔内投与、径鼻投与又は吸入投与される、請求項７又は８に記載の組成物。
他の医薬と組み合わせて投与される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物。
前記他の医薬が、Ｌ−ドーパ、５−ヒドロキシトリプトファン、セピアプテリン、向精神薬又は糖尿病治療薬である、請求項１０に記載の組成物。