CN103173445B - 一种欧米伽3的合成基因、含有合成基因的大肠菌及其构建方法 - Google Patents
一种欧米伽3的合成基因、含有合成基因的大肠菌及其构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基因技术和微生物技术领域,涉及微生物制药领域中的基因工程菌株大肠菌sHJPF02,该菌株通过将欧米伽3合成酶基因导入大肠杆菌BL21得到,保藏登记号为CGMCCNo.7338,具有SEQIDNO.1-3的核苷酸序列。本发明提供的菌株可以生产EPA和DPA,可在工业化生产欧米伽3中应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术和微生物技术领域,涉及微生物制药领域中的基因工程菌株大肠菌sHJPF02。
背景技术
欧米伽3脂肪酸的学名叫做Ω-3脂肪酸,其功用在20世纪20年代就逐渐被发现,当时被称为“维生素F”,近30年内的研究表明,欧米伽3是人体正常生长发育和新陈代谢必需的不饱和脂肪酸,主要含有DHA、EPA和DPA这三种极为重要的生理物质。欧米伽3主要具有以下功效:维护视网膜功能和延缓脑的衰老;促进婴幼儿智力开发和智商提高,增强记忆力;预防心脑血管疾病;抗炎、抑制过敏反应。EPA最重要的功能是具有抗血栓形成、调节血脂、降血压等作用,从而具有预防心血管疾欧米伽3病的作用;DHA俗称脑黄金,最重要的功能是参与脑细胞的形成和发育,添加DHA对促进出生后脑容量发育具有重要意义;DPA 的功效是DHA的十倍以上,且DPA 对幼儿的生长是至关重要的。
加拿大政府最近向25-49岁的国民建议每日应服用1.5-3克的欧米伽3;2004年美国FDA批准欧米伽3脂肪酸治疗高甘油三脂血症的成人患者;最近美国***已同意每日对欧米伽3的吸取量应增加为3克;世界卫生组织(WHO)最近建议成年人欧米伽3每天增加3克的吸收量(必须补充)。2010年欧米伽3的全球市场销售额约38亿美元,大部分来自于海洋鱼类提取法,以深海鱼油的形式出售,其余来自于微生物发酵法,主要是作为食品添加剂加入婴幼儿奶粉、牛奶和其它食品之中。
本发明提供了3个欧米伽3的合成基因和一株生产欧米伽3的基因工程菌株大肠杆菌sHJPF02,该菌株遗传性状稳定,可以生产EPA和DPA,培养和发酵条件适合于工业化生产。
发明内容
发明目的
提供了3个欧米伽3的合成基因和一株生产欧米伽3的基因工程菌株大肠杆菌sHJPF02,该菌株遗传性状稳定,可以生产EPA和DPA,培养和发酵条件适合于工业化生产。
技术方案
欧米伽3的合成基因1,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
欧米伽3的合成基因2,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
欧米伽3的合成基因2,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。
该菌株通过将欧米伽3的合成酶基因1-3利用生物工程的方法导入大肠杆菌BL21得到,可以生产EPA和DPA,命名为sHJPF02,分类名为大肠埃希氏菌,Escherichia coli,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏日:2013年3月20日,保藏登记号:CGMCC No. 7338,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所。
一株生产欧米伽3的基因工程菌株构建的方法,将具有SEQ ID NO. 1序列的DNA克隆到质粒pETDeut-1中得到质粒pHJPF01;将具有SEQ ID NO. 2序列的DNA克隆到质粒pACYCDeut-1中得到质粒pHJPF02;将具有SEQ ID NO. 3序列的DNA克隆到质粒pCOLADeut-1中得到质粒pHJPF04;将pHJPF01、pHJPF02和pHJPF04同时导入大肠杆菌BL21得到一株基因工程菌株sHJPF02,该菌株可以生产EPA和DPA。
本发明的有益效果:提供了一株生产欧米伽3的基因工程菌株,该菌株生产EPA的产量稳定在1.0 g/L左右,DPA的产量稳定在0.3 g/L左右,相比于欧米伽3的原始生产菌株,该菌株生长速度快,欧米伽3的产量高,遗传性状稳定,适合于在工业化生产欧米伽3。
该菌株命名为sHJPF02,分类名为大肠埃希氏菌,Escherichia coli,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏日:2013年3月20日,保藏登记号:CGMCC No. 7338,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院 中科院微生物研究所。
附图说明
图1是质粒pHJPF01的构建示意图(A)、质粒pHJPF02的构建示意图(B)和pHJPF04的构建示意图(C)。
图2是质粒pHJPF01用限制性内切酶NdeI/XhoI消化的电泳图(A)、质粒pHJPF02用限制性内切酶NdeI/XhoI消化的电泳图(B)和质粒pHJPF04用限制性内切酶NdeI/XhoI消化的电泳图(C)。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例中所使用的液体LB培养基成分:蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,pH 7.0,所述百分含量均为质量百分含量。实施例中所使用的固体LB培养基成分,在液体LB培养基中加入1.5%琼脂(质量百分含量)。
实施例1 3个欧米伽3的合成基因的获得
欧米伽3的合成基因1-3,其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1-3。由上海生工生物工程公司合成。
实施例2 sHJPF02的获得
SEQ ID NO.1的DNA序列通过DNA人工合成得到,合成后的5'端带有NdeI粘性末端,3'端带有XhoI粘性末端,把SEQ ID NO.1的DNA克隆到质粒pETDuet-1(购自Novagen公司)的NdeI/XhoI位点之中得到质粒pHJPF01(图1A、图2A);SEQ ID NO.2的DNA序列通过DNA人工合成得到,合成后的5'端带有NdeI粘性末端,3'端带有XhoI粘性末端,把SEQ ID NO.2的DNA克隆到pACYCDuet-1(购自Novagen公司)的NdeI/XhoI位点之中得到质粒pHJPF02(图1B、图2B);SEQ ID NO.3的DNA序列通过DNA人工合成得到,合成后的5'端带有NdeI粘性末端,3'端带有XhoI粘性末端,把SEQ ID NO.3的DNA克隆到质粒pCOLADuet-1(购自Novagen公司)的NdeI/XhoI位点之中得到质粒pHJPF04(图1C、图2C);把质粒pHJPF01转化到大肠杆菌BL21(购自上海浩然生物技术有限公司)中得到菌株sBLF01,把质粒pHJPF02转化到sBLF01中得到菌株sHJPF01,把质粒pHJPF04转化到大肠杆菌sHJPF01中得到sHJPF02,其分类名为大肠埃希氏菌,Escherichia coli,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏日:2013年3月20日,保藏登记号:CGMCC No. 7338。
实施例3 sHJPF02发酵生产EPA和DPA
将sHJPF02接种到含有100 μg/L氨苄青霉素、50 μg/L 氯霉素和50 μg/L 卡那霉素的固体LB培养基中,37 ℃培养箱中过夜;挑选sHJPF02的单克隆接种到含有100 μg/L氨苄青霉素、50 μg/L 氯霉素和50 μg/L 卡那霉素的液体LB培养基中,37 ℃,200rpm,培养16小时;再接种至含有100 μg/L氨苄青霉素、50 μg/L 氯霉素和50 μg/L 卡那霉素的液体LB培养基中,接种量1%,30 ℃,200rpm,培养24小时,8小时后每隔2小时取样分析EPA和DPA的产量。
取sHJPF02的发酵菌液1ml,离心收集菌体;菌体加入2 ml含有2M HCl的甲醇溶液,100 ℃加热1小时,真空下抽干甲醇;抽干后的固体加入1 ml乙酸乙酯和1ml 5 M NaCl,充分混合后,离心取上清液;上清液通过气相色谱分析其中的EPA和DPA的含量。
实施例4 sHJPF02的生产EPA和DPA的稳定性
sHJPF02在含有100 μg/L氨苄青霉素、50 μg/L 氯霉素和50 μg/L 卡那霉素的LB培养基中,37 ℃,200rpm,培养16小时;菌液加入无菌甘油至甘油终浓度为20%,-80℃保存0-6个月,EPA的产量稳定在1.0 g/L左右,DPA的产量稳定在0.3 g/L左右。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京江辉生物科技有限公司
<120> 一种新的欧米伽3的合成基因、含有合成基因的大肠菌及其构建方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7824
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggttcaag cgcataccaa tccggaaacc catagccagg acaataacga aagccaagag 60
acgcgcctga acaaacgtct gaaggacatg ccaatcgcaa ttgttggtat ggcaagcatt 120
tttcctaaca gccgttacct gaacaagttt atcagcgaga agatcgacgc cattacggaa 180
ttggtgccgg cgtacaccca tggtaagcgt gccgaagatt acttcgatgc agataagagc 240
tcaccagaca agagctactg caagcgtggt atggagttcg gtctgccacc aaatattctg 300
tctgaactga cgtgggatac cagccaactg ctgattctga gcctggtgat tgcaaaagaa 360
atgacggtgc tgcagttggc ggatgcaggt gggacggtta ccagcgagta cgacaccgac 420
aagatcggca ttacgctggg cgtgggtggc cttcaagaga ttaacgcaag cctgacggca 480
cgtctgcaat atccggtgct gaaaaaagtg tttaaaagca gcggtctgag cgacgccgat 540
agcgacatgc tgatcaagaa gcctcgtagg cagtacatcc actgggagga gaacagcttc 600
ccgggcagcc tgggcaatgt gatcgcaggc cgcatcgcaa atcgtttcga tgatcgtggt 660
atgaattgcg tggttgatgc agcgtgcgcg ggtagcctgg ccgcaatgcg tatggccctg 720
accgagctgg ttgagggccg cagcgaaatg atgatcaccg gcggtgtgtg tacggacaac 780
atgtatatga gcttcagcaa gacgccagcc tttacgacga atgagacgat ccaaccgttc 840
ggtcgagagg acattgacag caagggcatg atgattggcg aaggcatcgg tatggttgcc 900
ctgaaacgcc tggaggacgc aggcgatcgt atctatagcg ttatcaaggg cgttggtgcg 960
agcagcgatg gtaaattcaa gaagcaacac agcatctatg ccccgcgtcc agaaggtcaa 1020
ctgaagcgtg catacgatga cgccggtttt gcgccagaaa ccgttggtct gatcgaggcc 1080
cacggcacgg gcaccgccgc aggcgatgtt tatgcggccg cggagtttaa tggcctgaag 1140
agcgtttttg gcgagaacga ccagcatatc gcactgggca gcgttaagag ccaggttggt 1200
cacacgaaaa gcacggcagg tacggcgggc gttgtgatta agatgattgc agccctggcg 1260
aaagttctgc cgccaacgat taatgtgagc aagccgaatc cgaaactgaa cgtggaagat 1320
agcccgtttt tcatcaatac gctgttactt gaaacgcgtc cgtggatgcc acgtccggat 1380
ggtacgccgc gtattagcag ctttggtttc ggtggtacga acttccacct ggtgctggaa 1440
gagtacagcc cagaacatag ccgtgacgag aagttgctta tctaccgtca acgtcaagtg 1500
gcgcagagcc tgctgattag cattgagccc aaggcggagc tgatcgcgga gatcaataag 1560
gtcgccggaa gcatcgacga cgtgctccgc acgctggacc gcttcctcgc gggcgacgag 1620
cccgcgggct ggcacaccgg cggcatcagg cggtcgcgcg gcgccggagt gcgacgcgag 1680
ccggaacagg cgcccgaggt caccagggcc ctccacgacg gacggctcga ccgggtgacg 1740
ctgagcaatg atgccgaggc gtggcagctg ccgagcggca ccagctatcg cagcagcgca 1800
ctgatcacga tcaacgcgaa ccagaaaacg accaagggta agaaagcggc gaataccccg 1860
aaagttgcgg cagcgggcca aggtagccag tgtctagcgt acgtgaatat gggcatcgtt 1920
cagacccgtg gcatgggagc cggtctcttc gagcggttcc ccgaaccgac cgcgctggcc 1980
ttcgataaga ccccactgag ccaagttgtt agcctaattc cggcgtttga gaaagccgat 2040
caagcagcac tgctgacgag caccgataat aaagatgcgg cacagagcgc catcggtgtg 2100
atgagcatga gccagtatca actgttcacg caaagcggtt ttagcgccga catgtttgcc 2160
ggccacagcc tcggagcccg gctggcgttc ctgctctgcc gccggctgcg cgccgagcga 2220
tactaccagc tgcgcggtgc cagcatggca gcgagcgcca gctacgcagt tgacaaagat 2280
ggtagcgtat cagacaaggg caccatgtac gcgattattc tgccggccaa tgagaacgat 2340
gcggcgaata gcgataatat cgcgaaactg tcagatgata ttagcgagtt cgagggcgtt 2400
agcgcgacgc agctggttat tgcaggtcca acgcaaagct gtgcggatgc cgcgaaaaag 2460
gttgcaaatt acaatgcgat cgcagcactg ggttttaagg ccatcgccct gccagtgagc 2520
cacacgccgc tggtgggtca tgcgcaaaag ctgtttagca atccgttcgc aaaggcgatt 2580
ccgagcgatg cgaaaagcat taaagccgca tttaaacagc acatgctgca aagcgtgcgt 2640
gataaagcca agtttacggc gggtgcattt agcaaggtgg atgcaacggg tgacaaacat 2700
catgaccctc aactgaacaa tatgtatgat gccggtgcac gcgttttcgt ggaatttggc 2760
ccgaagaata tcctgcaaaa aatggctacg gccacgctgg gcaataaagc agaggcggtt 2820
agcgtgatta gcatcaaccc aggcaacagc gacgttcaac tgcgtgtggc aaatccaaag 2880
gtcgaggagc tgtggggcga ggagcccccg cgccaggccg tcgccacgct ccagagccat 2940
gtatcccacc tgcgccgcgc actgcagccg gcgtccgggc ccggccgtcc caccgtgctg 3000
cgccaccgcg cgcccggcta cgtcctggaa ctcgcccccg aacagatcga cgtctgccgc 3060
atcgttgaaa aggaagtgat caagaccgag tacgtggagg tggcgacgag cggcgcaacg 3120
ttcgagcgcc tggtcgccga cgggcggcgg ctcctggaag gacgcgaccc gcgcgccgcc 3180
accgtgagca acgtggcccc acaggcaatc gcgccacatg cgagcgcgca agcagcccca 3240
gcgagcggta gcctggaagc attcttcaat gcacagcaac aggcggccga tctgcaccaa 3300
cgcgaggcac gccgccaccc ggcgcgggaa cgcctggtcg gccatctgat gacggcgctg 3360
ccagcggcaa tggcagcacc aaccccgccg gttgagccga tcaaagcccc ggcaccggtt 3420
gcagcgccag ttgtgagcgc accagtggtt ccgaccccag ccggcctgag cgcccaaacg 3480
tcccggctcg ggcggcaggc cgaggcgctc gaagtgtacg aacggacccg cgtccacctg 3540
gacgaggagt tcggcgtggg cacggccgcc gaactccgcc gggtcaggac cgcgatcctg 3600
caggcaagcc agaatgccct gaatatgctg acgggccaga cgccggtgac cgccccggtg 3660
gttaatgcgc cgatcgttaa tagcccggtg gtggaagccg tgaaggtggc accgccagtg 3720
caaacgccag ttgtgaacac cccggttgtt ccggcggtga aggcaacccc agttgcccaa 3780
gacaccgcga acgcaaccca taccgccgtt aaactgccag cagcgggtgc gatgaacagc 3840
atgaagcagg aactcaagaa gcacatggaa gagcggttca tgttcgagtt cgactcggac 3900
atcaccgagg acaccgacct gttcaaggcg ggcatcctcg actcgttcgg ctacatctcc 3960
ctgatggcgc acatcgagga ggagtacggc gtgccgctcg gcgacgagat cctcggcaac 4020
gtcatggtct cgctgaacgg catcgtcggg ctcgtcgacg ccgcccgctc gcgcgccgcc 4080
gggagccggt ggagcgtcgg tagcaagctg ccggcggcag gcgccatgaa cagcaaactg 4140
ccagccagcg ccgcagagca gccacagacg gccccagttc aagccgccag cggtctgagc 4200
cgttattggg ttctgaacac gatgctggag gttgtggccg aaaagaccgg ttacccaacg 4260
gagatgctgg aactgagcat ggacatggaa gccgatctgg gcatcgatag cggcctaatg 4320
ggtacggtgc aagatgagct gccaaccctg ccggagctga gcccagagga tctggcggag 4380
gtggaaattc tgtgtcgtac cctgggcgag atcgtggact atatgaatag caaactgcca 4440
gcagccggta gcgccccagt gatggccgcc acccaggaag agatcgtcaa gggtctcgcc 4500
gagatcgtga acgagatcgc cgggatcccc gtcgaggacg tcaagctgga caagtccttc 4560
accgacgacc tggatgtcga ctcgctgtcc atggtcgagg tcgtcgtcgc cgccgaagag 4620
cgcttcgacg tgaagatccc cgacgaggac gtcaagaacc tcaagaccgt cggcgacgcg 4680
tccgactaca tcctcaagca ccagggctgg gagatcgtgg attacatggg cagcaagctg 4740
ccggccgcag gcatggcatg gaatctatcc ccagccgagg gcgccaatac gcaagcggca 4800
aacacgaagc tgccggccga aggcgcgaac ttccgaatcg ccggtgcaag ccaggtgatg 4860
accactgaac tgaccttcga cgagctggcc tcgctgatga aatcggccgc cggtctcacc 4920
gtcaagccgg aggacttggc gggccggcgc gaagcgacct tcgccgacta cggcctggac 4980
tcgctcggcc tgctcggcat cgtcggtgag ctggagaacc ggctgggccg gtcgctgccc 5040
aacgacgccg agcgcagcaa gacgccgcac gacttcctcg acctggtcaa caccgtgcct 5100
acgacaggag cccaaggtgc caagctgccg gccgcgggtg caatgaacaa gaaacaggcg 5160
agcgtggaaa cccaaagcgc accggcggcc gagctggcaa cggatctgcc gccgcaccag 5220
atttcgcagt ccgcgttcga cggctcgaga ctccgggtcg tcctgatgct ggacctccag 5280
gacggtgccc agcagcggtt cctcgaagcc tacgagcacc tgcgcaacca ggtggcctcc 5340
gtccccggcc acatcacgga ccagctgtgc cagtccatcg agaacccctc gcagtggctg 5400
ccactgagca gcgatattgc atcttttacc ctgagcgccg tgaatgatga tgccattagc 5460
gatgtgatcg cgcagattag caaacagcac aaaatcgcgg gtttcgtgca tctgcaaccg 5520
accagtgagt gggagagcgc accgccgttc ctggcctggg tcaacagcga ggaacacgtc 5580
cagatggtgc agcccctgca tgagtgcgta cgaagcaccc gttccctgcg cttcagcgtg 5640
ctgcgcgaga ccaccaacgt cgccacccgc gcgcccgagc cgtccaaggg gcggctgcag 5700
ctggcaaagg cagagctgaa ccaggcggca ctgagcggtc tgaccaaaac cctgggccac 5760
gaatggccga ccgtgttttg ccgtgcactg gatatcaccc cgagctttga ggcagttgaa 5820
gaaccccgcg tcggcgacgg tgtggtccgc cacgccctga ccttcaccgt caagcccggc 5880
agcgaggaga tggtcgccga gatcctggcc ggctacacct cgcccgaggc ccgggtcgac 5940
gacaccaccc ggctgcgccg cacctcgctg ttcatgcacg gcaaccgcgt cgtacgggcc 6000
ttcgaatgtg cgctgaccct ggcgaagcaa acgcagagcc actttatcct ggcgggtcgc 6060
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gaagcccgcg acgcacggcg gcacgcgctg tactacgcgg ccaaggaagg ctgcggaatg 6180
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acgggcatta tccacggcgc aatggtcacc cgtatgaagc atattcagga caagaccctg 6420
acgaaggtga gcggtttcgc gggtatcatc gccgaactgg gtcgcgttta cggtaacgcc 6480
atcgacgcga gcatggtacg ttttcaggcc atgtttagca gcgcagcggg cttctacggc 6540
cagagcgact atagcatgag caatgagatt aatacgggcc tgaacaaaac cgcactgcaa 6600
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<210> 3
<211> 3816
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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gttaaagacg cgagctttga cacgcaagcg tgttaa 3816
Claims (4)
1.欧米伽3脂肪酸的合成基因1,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
2.欧米伽3脂肪酸的合成基因2,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 2。
3.欧米伽3脂肪酸的合成基因3,其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。
4.一种含有权利要求1-3所述的合成基因的工程菌株sHJPF02,该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏日:2013年3月20日,保藏登记号:CGMCC No. 7338;保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院,中科院微生物研究所 。
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