CN102382863B

CN102382863B - 一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法

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Publication number: CN102382863B
Application number: CN201010273824.8A
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 孟鑫; 杨建明; 程涛; 刘辉; 刘炜
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2030-09-03
Also published as: CN102382863A

Abstract

本发明提供了一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法。本发明包括调控脂肪酸代谢相关基因和蛋白水平，并提高游离脂肪酸胞外分泌能力的方法。

Description

一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法

技术领域

本发明涉及一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法，使工程菌胞外游离脂肪酸含量增加，以便简化油脂提取工艺，直接用于脂肪酸生产的方法。

背景技术

脂肪酸是一种重要的平台化合物，广泛应用于化工、化妆品、食品、医药保健品等领域，特别是作为油脂原料来源在生物柴油生产中的应用。脂肪酸可以通过石油产品经化学合成法制得，但随着石油资源的日益枯竭，和世界对生态环境和环境保护的重视，近年来已从动植物油脂、餐饮废油脂中提取脂肪酸，目前已成为脂肪酸生产的主要来源。但这些油脂原料受季节、地域等因素的限制，且原料难以收集和运输，生产成本高(占到总生产成本的70％-85％)，严重制约了脂肪酸的产业化进程。

微生物油脂种类繁多，生产原料丰富，且从微生物油脂中提取脂肪酸，不受季节、地域等因素限制，因此，利用微生物制备脂肪酸已成为本领域研究热点。目前使用的微生物油脂多为产油酵母和微藻等，例如，Wynn etal，Microbiology，2001；Chisti Y，Biotechnology Advances，2007，但这些天然产油微生物存在生长周期长、遗传背景复杂、难以调控，且脂肪酸大多都是以胞内总脂形式存在，仅有少量分泌至胞外。要获得脂肪酸必须经过样品前处理、提取、精练等一系列复杂、耗时的提取精炼过程，且该过程会产生大量的工业废水，严重污染环境。

大肠杆菌因具有遗传背景清楚，易于工程调控，可高密度发酵，生长速度快等优点，已经成为微生物催化合成化学品和燃料的理想受体菌。大肠杆菌的脂肪酸代谢路线图见附图1。已有报道，可利用工程大肠杆菌生产脂肪酸，例如，Steen et al，2010，Nature；Liu et al，2010，MetabolicEngineering，并能利用秸秆等低成本、可再生物质资源，能够开发具有商业潜力的工程菌。但这些脂肪酸仍存在于细胞内，未能从根本上解决脂肪酸提取分离问题。前期研究已报道了通过调控脂肪酸代谢相关基因(Nunnet al.，1986，J Biol Chem；Reyes et al.，2005，Science；Kampf et al.，2006，JBiol Chem；Wu et al.，2006，Proc Natl Acad Sci)，获得了产胞外游离脂肪酸的工程菌，但胞外游离脂肪酸含量较低(Liu et al.，2010，MetabolicEngineering)。

本领域需要提高工程菌的脂肪酸胞外分泌能力，所述工程菌能够高产胞外游离脂肪酸。

发明内容

本发明提供了一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法，即通过基因工程和代谢调控技术，在工程菌中共表达植物硫脂酶基因、大肠杆菌硫脂酶基因和内膜脂类翻转酶基因，调控工程菌脂肪酸转运，使工程菌能够高产游离脂肪酸，提高脂肪酸胞外分泌能力。所述共表达酶基因体系、工程菌和代谢调控途径在提高游离脂肪酸胞外分泌能力中的应用；所述工程菌用于生产胞外游离脂肪酸或脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪烃等。

一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法，包括共表达调控脂肪酸代谢的一系列酶基因，其中，所述共表达基因包括植物硫脂酶(AtFatA)、大肠杆菌硫脂酶(tesA)和内膜脂类翻转酶(msbA)；

一种能水解脂酰-ACP(脂酰基载体蛋白，acyl Carrier protein，ACP)，释放游离脂肪酸，提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的植物硫脂酶(AtFatA)基因，可来源于Arabidopsis thaliana的AtFatA基因，也可来源于Arabidopsisthaliana的PtFATB基因，或来源于Umbellularia californica的BTE基因，或同AtFatA、PtFATB、BTE基因同源性超过65％的植物硫脂酶核酸序列；

一种能将脂酰-CoA水解释放出游离脂肪酸的提高工程菌胞外游离脂肪酸含量的硫脂酶基因，包含Escherichia coli的tesA基因，或同tesA基因同源性超过65％的DNA序列。

一种提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力的方法，包含提高大肠杆菌细胞膜通透性的内膜脂类翻转酶基因，来源于Escherichia coli的msbA基因，或同msbA基因同源性超过65％的DNA序列。

所述调控脂肪酸胞外分泌能力相关基因，共表达的内源或异源的硫脂酶和内膜翻转酶基因可以在大肠杆菌中表达，也可在其它原核生物中表达，像乙酸钙不动杆菌、枯草芽孢杆菌等。

所述的工程菌代谢生产的脂肪酸，在化工涂料、印染、乳化剂、表面活性剂、化妆品、食品、医药保健品中的应用；含有所述工程菌生产的脂肪酸衍生物脂肪醇、脂肪烃等。

与公知技术相比，本发明具有以下优点：

本发明中在工程菌中共表达植物硫脂酶(AtFatA)、大肠杆菌硫脂酶(tesA)和内膜脂类翻转酶(msbA)，提高工程菌脂肪酸胞外分泌能力，胞外游离脂肪酸含量为120mg/L，与没有调控脂肪酸转运相关酶的内源或异源基因的原始大肠杆菌相比，胞外游离脂肪酸含量提高了10倍(原始菌株为10.5mg/L)；与只表达植物硫脂酶(AtFatA)或大肠杆菌硫脂酶(tesA)的工程菌相比，工程菌胞外游离脂肪酸含量提高了约5倍，(单独表达硫脂酶基因脂肪酸含量约为25mg/L)；且胞外游离脂肪酸组成与石化油相似。

采用该菌株生产脂肪酸，解决了脂肪酸生产中提取分离复杂、油脂生产成本高、严重污染环境的问题，可直接用于工业生产，更有利于优质、低成本脂肪酸的发展。该方法生产的脂肪酸还可用于脂肪醇、脂肪醛、脂肪烃等脂肪酸衍生物的生产。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种提高微生物的胞外分泌游离脂肪酸的能力的方法，包括在所述微生物中过表达外源或内源的内膜脂类翻转酶基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在所述微生物中同时还过表达一种或多种外源或内源的硫脂酶基因。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是原核微生物，优选选自大肠杆菌(Escherichia coli)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述内膜脂类翻转酶基因选自：1)大肠杆菌的msbA基因，或2)与msbA基因具有超过65％同源性的DNA序列，优选大肠杆菌msbA基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述硫脂酶基因选自植物硫脂酶基因和细菌硫脂酶基因，优选大肠杆菌硫脂酶基因tesA的序列如SEQ IDNO.2所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述植物硫脂酶基因选自：

1)拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtFatA基因，优选拟南芥硫脂酶基因AtFatA序列如SEQ ID NO.1所示；

2)拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PtFATB基因；

3)加利福尼亚桂树(Umbellularia californica)的BTE基因；或

4)与AtFatA、PtFATB或BTE基因具有超过65％的同源性的编码植物硫酯酶的核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其中细菌硫脂酶基因选自：1)大肠杆菌的tesA基因，或2)与tesA基因具有超过65％同源性的DNA序列。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在微生物中共表达内膜脂类翻转酶基因(优选大肠杆菌内膜脂类翻转酶基因)、植物硫脂酶基因和大肠杆菌硫脂酶基因。

9.通过权利要求1-8中任一项所述的方法生产的游离脂肪酸和/或脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪烃等。

附图说明

图1.大肠杆菌中的脂肪酸代谢图((1)乙酰辅酶A羧化酶(ACC)：催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A；(2)烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)：催化苹果酸脱羧，为脂肪酸合成提供还原力NADPH；(3)乙酰辅酶A合酶(ACS)：催化乙酸到乙酰辅酶A的反应；(4)脂酰辅酶A合酶(FAS)：催化丙二酸单酰辅酶A到脂肪酸的反应；(5)硫脂酶tesA：催化长链脂酰ACP降解，释放游离脂肪酸的关键酶基因)；

图2.拟南芥硫脂酶(AtFatA)、大肠杆菌硫脂酶(tesA)和内膜脂类翻转酶(msbA)表达载体pMX36的构建示意图；

图3.拟南芥硫脂酶基因AtFatA序列；

图4.大肠杆菌硫脂酶基因tesA的序列；

图5.大肠杆菌msbA基因的序列；

图6.pMX36在E.coli中表达的SDS-PAGE分析(泳道M，低分子量蛋白标准物；泳道1：未用IPTG诱导的重组菌MX36；泳道2和泳道3：用IPTG诱导的重组菌MX36)；和

图7.GC-MS分析脂肪酸组成。

具体实施方式

以工程大肠杆菌为例，具体实施例如下：

实施例1：

通过在大肠杆菌中过量表达植物硫脂酶基因AtFatA、大肠杆菌硫脂酶基因tesA、大肠杆菌内膜脂类翻转酶基因msbA，构建高效分泌游离脂肪酸的重组菌株，用以生产游离脂肪酸燃料。

1目的基因的克隆

1.1 拟南芥硫脂酶基因AtFatA的克隆

提取Arabidopsis thaliana的总mRNA，然后反转录为cDNA(采用上海生工UNIQ-10柱式Trizon总RNA提取试剂盒和Revert Aid First strandcDNA Synthesis Kit反转录试剂盒操作)，根据GenBank Accession No.Z36912设计引物，PCR扩增克隆的硫脂酶基因AtFatA，再利用Fermentas凝胶回收试剂盒回收目的基因。

扩增的拟南芥硫脂酶基因AtFatA序列如图3和SEQ ID NO.1所示。

参考上述序列设计引物序列如下(划线部分为酶切位点)：

上游引物th-L：CATGCCATGGTTTTGAAGCTTTCGTGTAATGTGAC，

下游引物th-R1：CGCGGATCCTTAACTTGAAGGCTTCTTTCTCCAC。

1.2 大肠杆菌硫脂酶基因的克隆

提取E.coli K12(NRRL B-3707)基因组DNA(SDS-CATB结合法提取细菌基因组DNA，具体操作方法参考分子克隆实验指南(第三版))，根据GenBank Accession No.CP000948设计引物，PCR扩增tesA基因，并用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

大肠杆菌硫脂酶基因tesA的序列如图4和SEQ ID NO.2所示。

参考上述序列设计引物序列如下(划线部分为酶切位点)：

上游引物tesA-L：CCGGAATTCATGAACTTCAACAATGTTTTCC，

下游引物tesA-R’：ACGCGTCGACTTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC

1.3 大肠杆菌内膜脂类翻转酶基因的克隆

提取E.coli K12基因组DNA，根据GenBank序列Accession No.U00096设计引物，PCR扩增msbA基因，并用胶回收试剂盒回收目的基因片段。

大肠杆菌msbA基因的序列如图5和SEQ ID NO.3所示。

参考上述序列设计引物序列如下(划线部分为酶切位点)：

上游引物msbA-L：CGCGGATCCATGCATAACGACAAAGATCTCTCTACG，

下游引物msbA-R：AATCGCGAGCTCTCATTGGCCAAACTGCATTTTG。

2 重组质粒pMX36构建

2.1 AtFatA基因与tesA基因整合

将胶回收后的AtFatA基因与pET-30a(+)载体(Novagen)都用NcoI和BamH I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶1-1∶10的比例，加T4DNA连接酶(Fermentas公司)，37℃连接2-16h，连接产物采用热击法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞(Transgene公司)中。随机挑选单菌落，菌液PCR筛选阳性克隆，提取重组质粒，再通过限制性酶切和测序鉴定，即为构建的重组质粒pYJM1。含有重组质粒pYJM1的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)称为YJM1。再用相同的限制性内切酶(NcoI/SalI)酶切重组质粒pYJM1和胶回收试剂盒纯化后的tesA基因片段，并按照1∶1-1∶10比例连接，同样，连接产物采用热击法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，经菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，即为整合AtFatA基因与tesA基因的重组质粒pMX25。

2.2 AtFatA基因、tesA基因与msbA基因整合

将上述整合好AtFatA基因与tesA基因的重组质粒pMX25与胶回收纯化的msbA基因与用相同的限制性内切酶(NcoI/SalI)酶切，载体与外源片段按摩尔比1∶1-1∶10的比例，37℃连接2-16h，连接产物热击法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建重组菌株MX36。随机挑选单菌落，菌液PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒后，再通过限制性酶切和测序鉴定，即为整合AtFatA基因、tesA基因与msbA基因的重组质粒pMX36(质粒图谱见图2)。

2.3 蛋白的诱导表达及纯化

将构建好的工程菌按1％的接种量接种至5mL含50μg·mL^-1Kan的LB液体培养液中，37℃，200-220rpm振荡培养约2-2.5h，当OD₆₀₀约为0.4-0.6时，加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，37℃振荡培养3-5h，诱导表达目的蛋白。取出诱导后的培养物，12,000g离心2min，收集菌体，菌体细胞用0.05M的磷酸盐缓冲液(pH 7.8)洗涤一次，按1∶10的比例再用此缓冲液重悬细胞，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，瞬时高速离心，10％SDS-PAGE电泳检测，即可检测到目标蛋白的表达(见图6)，并经Ni亲和层析柱纯化目的蛋白。

实施例2：

用构建好的工程菌株MX36发酵生产脂肪酸，其步骤如下：

1)菌株培养：将工程菌MX36按体积比1％的接种量接种到100mL含50μg·mL^-1卡那霉素的LB液体培养液中，在37℃，225rpm的条件下振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，30℃继续培养18-24h；

2)脂肪酸提取：离心收集上清液，用抽提剂(氯仿/正庚烷/甲醇，56∶42∶2，v/v)按照1∶1体积比率萃取，萃取三次，收集萃取液，旋转蒸发，挥发除去有机溶剂，即为提取到的脂肪酸粗品；

3)脂肪酸甲酯化：向步骤2)的脂肪酸粗品中直接加入2mL甲酯化试剂(三氟化硼/甲醇：1/4)，置于60℃水浴中反应0.5h，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得脂肪酸粗品(多种脂肪酸甲酯的混合物)；

4)脂肪酸含量测定：通过GC-MS测定重组菌生产的脂肪酸组成及含量。GC-MS检测方法：取1μl甲酯化后的样品，GC-MS检测重组菌脂肪酸组成。色谱条件如下：TR-Wax MS GC毛细管色谱柱(30m，0.25mm，0.25μm，美国Agilent 6897)，载气：高纯氮气(99.999％)，进样器温度：250℃，检测器温度：300℃，载气柱头压：10psi；程序升温：起始100℃，持续2min，100℃/min升温至250℃，保持5min。以C20:0为标准品进行定量。

5)GC-MS谱图如图7所示。

6)脂肪酸计算公式如下，实验结果见表1和表2。

M_FA＝(V_FA/V_S)·MS

M_FA：脂肪酸质量(mg)；

V_FA：样品各脂肪酸组分峰面积之和；

V_S：标准品峰面积；

MS：标准品质量(mg)。

表1 游离脂肪酸产量比较

菌株编号	游离脂肪酸产量(mg/L)	菌株描述
			BL21(DE3)	5.21±0.82	原始菌
YJM1	33.53±6.92	只表达AtFatA
			MX33	25.23±9.12	只表达tesA
MX36	120.8	共表达AtFatA、tesA、和msbA

菌株MX33的构建过程如下：

(1)PCR扩增目的片段

大肠杆菌硫脂酶基因tesA的序列如图4和SEQ ID NO.2所示。

参考上述序列设计引物序列如下(划线部分为酶切位点)：

上游引物tesA-L：CCGGAATTCATGAACTTCAACAATGTTTTCC，

下游引物tesA-R’：ACGCGTCGACTTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC

(2)重组质粒构建

将纯化的PCR产物用限制性内切酶EcoRI/SalI酶切，与用相同酶酶切后的表达载体pET30连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经菌落PCR初筛，再经PCR鉴定和酶切鉴定，结果完全一致，得到单一目的条带，获得阳性重组菌，证明重组质粒构建成功。随机挑取2-4个阳性重组菌测序，结果表明，目的片段成功***到表达载体的相应位点上，且构建过程中未发生突变，即获得了重组菌MX33。

表2 MX36生产的脂肪酸的组成

组成	C16:0	C16:1	C14:0	C18:1
					含量(mg/L)	55.8	18.4	11.8	25.2

实施例3：

用构建好的工程菌株MX36发酵生产脂肪酸，其步骤如下：

1)将工程菌MX36按体积比1％的接种量接种到100mL含50μg·mL^-1卡那霉素的LB液体培养液中，在37℃，225rpm的条件下振荡培养至OD₆₀₀约为0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1mM，同时加入底物苹果酸钠(添加目的：反应的辅底物，促进苹果酸酶功能发挥)至终浓度为15mM，继续培养18-24h；

2)离心收集上清液，用抽提剂(氯仿/正庚烷/甲醇，56∶42∶2，v/v)按照1∶1体积比率萃取，萃取三次，收集萃取液，旋转蒸发，挥发除去有机溶剂，即为提取到的脂肪酸粗品；

3)向步骤2)的脂肪酸粗品中直接加入2mL甲酯化试剂，置于60℃水浴中反应0.5h，采用2mL正己烷萃取脂肪酸甲酯，减压蒸馏浓缩，制得脂肪酸粗品；

4)通过GC-MS测定重组菌脂肪酸产量，脂肪酸计算公式同实施例2。

实施例3的发酵培养结果如表3所示：

表3 发酵罐发酵重组菌MX36

参考文献

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9.Liu T，Vora H，Khosla C.Quantitative analysis and engineering of fattyacid biosynthesis in E.coli.Metabolic Engineering，2010.

Claims

1.一种提高微生物的胞外分泌游离脂肪酸的能力的方法，包括在所述微生物中共表达大肠杆菌内膜脂类翻转酶基因、植物硫脂酶基因和大肠杆菌硫脂酶基因，其中所述内膜脂类翻转酶基因为大肠杆菌的msbA基因，其序列如SEQ ID NO.3所示；所述大肠杆菌硫脂酶基因是大肠杆菌硫脂酶基因tesA；所述植物硫脂酶基因是拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtFatA基因，并且其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述大肠杆菌硫脂酶基因tesA的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtFatA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。