CN103173356B - 用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系 - Google Patents
用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系，其名称为Sulfobacillus thermosulfidooxidans 6Y-1，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2010年11月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2010297。该复合菌系的菌种组成为Sulfobacillus thermosulfidooxidans 77％、Acidithiomicrobium sp 5％、Acidithiobacillus caldus 12％和Ferroplasma sp 6％。该菌系对黄铜矿具有较高的浸出效率。
Description
技术领域
本发明涉及一个用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系。
背景技术
铜是现代工业发展中不可或缺的重要金属原料。随着经济发展和社会的进步，铜工业在国民经济发展中的地位日益提高。目前，次生硫化铜矿的常温生物堆浸技术已经广泛应用于商业生产。然而，研究证明，常温生物浸出对于铜资源的主体——黄铜矿来说却难以奏效。自1999年以来，BHP Billiton和Mintek/Bactech两个矿业大公司连续发布有关黄铜矿嗜热菌搅拌浸出的实验情况。结果表明，极端嗜热嗜酸菌搅拌浸出黄铜矿精矿切实可行，短时间内可以获得很高的铜回收率。但是，嗜热嗜酸菌对高矿浆浓度极度敏感，高温下气液传输受限，浸液中氧气和二氧化碳含量低，对浸出效率产生负面影响。
发明内容
本发明的目的在于，提供一个中温浸矿菌复合系，该菌系对黄铜矿具有较高的浸出效率。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系，其名称为Sulfobacillusthermosulfidooxidans 6Y-1，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2010年11月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2010297。
如上所述的复合菌系，其工作温度为55℃，
该复合菌系的菌种组成为Sulfobacillus thermosulfidooxidans 77％、Acidithiomicrobium sp 5％、Acidithiobacillus caldus 12％和Ferroplasma sp 6％。
如上所述的复合菌系，其获得方法为，
所述复合菌系的样品来自某黄铜矿堆浸矿堆；
采用传统方法从采集的样品中富集培养并驯化黄铜矿得到所述复合菌系；
采用16S rDNA克隆文库技术对上述复合菌系中的微生物种群组成进行分析，技术路线为：总DNA提取→16S rDNA片段扩增→与载体连接→转化大肠杆菌→筛选阳性克隆→酶切分型→测定序列→Blast比较分析；
采用传统方法考察该复合菌系对黄铜矿的浸出效果，方法为：向200mL普通自来水中加入5-10％黄铜矿矿粉，酸平衡至pH 1.6-1.75；加入0.1-0.2％的酵母粉后，以10％的接种量接入所述复合菌系培养液，55℃下140rpm培养，浸出7-15日后，检测铜和铁的浸出效率。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的中温菌系，其较高温菌具有更好的环境适应性，更易于培养，工作温度更低，操作更方便，尤其是对低品位硫化铜矿如黄铜矿在堆浸工艺的应用有极强的商业应用前景。
本发明涉及一个复合菌系，其名称为Sulfobacillus thermosulfidooxidans6Y-1，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2010年11月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2010297。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本发明，但并不用来限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
实施例1：中温浸矿复合菌系6Y-1的获得
1.富集：
取200mL普通自来水，调节其pH为1.7，加入0.20g酵母粉，加入300g取自德兴铜矿废弃堆浸矿堆的矿石样品，55℃保温24小时。
2.培养：
按下述配方配制100mL培养基A：K2HPO4 1g，(NH4)2CO3 2g，NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.2g，MgSO4 0.8g，蒸馏水1L；调节pH为1.6-1.7。按下述配制方法配置培养基B：向100mL普通自来水中，加入10g黄铜矿矿粉，优选地，黄铜矿矿粉的粒径为200目，用浓硫酸调节pH进行酸平衡，直至pH稳定在1.6-1.7。接种前将培养基A和B混合。接种时，先在混合培养基中加入0.1-0.15％的酵母粉，然后加入富集培养物，第一次接种量为总体积的20～30％；55℃140rpm振荡培养。
3.驯化：
利用相同的混合培养基加入5-10％的黄铜矿粉，在pH 1.6-1.7条件下接种10％培养物，55℃进行细菌浸矿适应性驯化培养，获得菌浓度为107～109个/mL的稳定的浸矿复合菌系。
实施例2：中温浸矿复合菌系L-A中细菌种群组成的分析
1、总DNA的提取
将实施例1中得到的复合菌系接种至上述混合培养基中，接种量为体积百分比5％，40-50℃培养20小时。
将1mL培养液放入1.5mL Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心5分钟收集菌体，用1×TES洗涤菌体2-3次。将菌体重新悬浮于435μL TES中打散菌体，加入20mg/mL的溶菌酶125μL，10mg/mL的蛋白酶K 2.5μL，37℃水浴轻振保温4小时，加入50μL 20％SDS，于37℃水浴轻振保温30分钟，加入5mol/L的NaClO4 125μL，用等体积的酚-氯仿-异戊醇(三者体积比为25∶24∶1)抽提3-4次至界面无蛋白膜出现。吸取上层水相置于冰浴中加入1/10体积的3mol/L的NaAc-EDTA-Na2，加入2倍体积冷无水乙醇，翻转混匀，冰浴5分钟。12000rpm离心20分钟沉淀DNA。加入体积百分比70％的乙醇脱盐，4℃过夜放置，7000rpm离心10分钟，吸出乙醇。风干，加二次蒸馏水溶解。电泳检测后调DNA浓度为25μg/mL。
2、PCR扩增16S rDNA部分序列
通用引物：细菌引物27F和1492R
27F(SEQ ID：No.1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R(SEQ ID：No.2)：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
古菌引物25F和1492R
25F(SEQ ID：No.3)：5’-TCYGGTTGATCCYGCCRG-3’
1492R(SEQ ID：No.2)：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应条件：
预变性：95℃ 5min；
循环：95℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 1min，30个循环；
延伸：72℃ 5min。
经电泳检测，证明得到大约1000bp的PCR产物。
3、PCR产物纯化
采用Promega公司的Wizard SV Gel and PCR Clean-up System产品(产品目录号：A9281)进行纯化。具体操作为：经凝胶电泳后将所需条带切下放入1.5mL离心管；称量胶条的重量，并以1μL/mg的量加入膜结合溶液，在50-65℃保温溶解；将溶解后的混合物倒入柱子室温放置1分钟后以16000转速离心1分钟；加入700μL洗膜溶液以同样转速离心1分钟后再加入500μL洗膜溶液离心5分钟；将柱子轻轻转移到干净的离心管中加入50μL无核酸酶水，离心1分钟后置4℃保存。
4、PCR产物与载体连接
连接载体选用Promega公司的pGEM T-easy载体(产品目录号：A1360)，连接体系如下表：
混匀后4℃过夜放置。
其中，Control DNA为Promega公司的pGEM T-easy载体中提供。
5、转化
将步骤4的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(北京博大泰恒生物技术有限责任公司产品)。分别取50μL，100μL，200μL涂平板，于37℃温箱培养12-16小时。依据蓝白斑筛选的原理挑取白色菌落点种在平板上，每个平板点种50个菌落，每个菌落的位置标记号码1-50，37℃培养12小时。
6、阳性克隆的筛选
采用菌落PCR技术。用牙签挑取共60个不同菌落的菌体分别加入事先装有50μL无菌水的PCR管中，在PCR管上做好标记，该标记与所取菌落在平板上的标记号码一一对应。将PCR管于95℃加热5分钟，冷至室温后，15000rpm离心5分钟。取10μL上清为模板进行菌落PCR，引物为SP6和T7，其中SP6序列为(SEQ ID：No.4)5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’，T7序列为(SEQ ID：No.5)5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’。菌落PCR体系组成以及反应条件均与上述16S rDNA的扩增条件相同。取10μL PCR产物经凝胶检测确定阳性克隆。
7、阳性克隆测序和***发育分析
将阳性克隆菌落接种于LB培养基固体平板上，37℃过夜培养后送测序公司进行测序。将所得序列输入NCBI网站用Blast程序与Genebank中已有的序列进行比较。
8、中温浸矿复合菌系微生物种群结构组成：
经上述分析，结果表明：该菌系由Sulfobacillus thermosulfidooxidans(77％)、Acidithiomicrobium sp(5％)、Acidithiobacillus caldus(12％)和Ferroplasmasp(6％)组成。
将该中温浸矿复合菌系命名为Sulfobacillus thermosulfidooxidans 6Y-1，于2010年11月10日将其保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC(地址：武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M2010297。
实施例3：该中温浸矿复合菌系对黄铜矿的浸出效果分析
首先将低温保藏的复合菌系Sulfobacillus thermosulfidooxidans 6Y-1在装有200mL培养基的三角瓶中活化；所述培养基为按照下述配方配制而成：K2HPO41g，(NH4)2CO3 2g，NaHCO3 0.5g，CaCl2 0.2g，MgSO4 0.8g，酵母粉1g，蒸馏水1L。活化后的菌种离心后，将菌泥转接入200mL已经酸平衡的、含有5％黄铜矿矿粉的普通自来水中，55℃培养一周后，取50mL浸出液，过滤后检测其中的铜和铁离子浓度，计算铜和铁的浸出效率。结果表明，铜的浸出效率为34.78％，铁的浸出效率为30.3％。此浸出效率高于现有中温菌种的效率。
Claims (1)
1.一种用于黄铜矿浸出的中温浸矿复合菌系，其特征在于，
其名称为Sulfobacillus thermosulfidooxidans6Y-1，该复合菌系已保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址位于武汉大学内，保藏日期为2010年11月10日，保藏编号为CCTCC NO：M2010297，该复合菌系的菌种组成为热氧化硫化芽孢杆菌(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)77％、嗜酸硫微菌属(Acidithiomicrobium sp)5％、嗜酸高温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)12％和铁原体属(Ferroplasma sp)6％。
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