CN103160450A

CN103160450A - 一株广谱高效的苏云金芽孢杆菌新菌株及其菌剂和应用

Info

Publication number: CN103160450A
Application number: CN2011104184123A
Authority: CN
Inventors: 王勤英; 苏俊平; 南宫自艳; 宋萍; 曹克强
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了一株对鳞翅目害虫广谱高效的苏云金芽孢杆菌菌株及其可湿性粉剂的制备和应用，属于害虫生物防治领域。本发明涉及的苏云金芽孢杆菌YX-1菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC№.5256，该菌株含有等多个杀虫基因，对梨小食心虫、棉铃虫、美国白蛾、苹小卷叶蛾、舟型毛虫、苹果蠹蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有高效的致死作用。本发明还公布了利用YX-1菌株制备可湿性粉剂的方法，本发明苏云金芽孢杆菌YX-1菌株及其可湿性粉剂主要用于多种果树和蔬菜上鳞翅目害虫和的防治，还可用于大田作物和园林植物上鳞翅目害虫的防治，具有广谱高效、对人、畜及动植物安全、无环境污染等特点。

Description

一株广谱高效的苏云金芽孢杆菌新菌株及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌，还涉及利用该苏云金芽孢杆菌制备的微生物杀虫剂、制备方法和应用，属于害虫生物防治领域。

背景技术

鳞翅目属有翅亚纲、全***类，全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目，分布范围极广，以热带种类最为丰富。本目包括蛾、蝶两类昆虫，危害粮食、棉花、油料、蔬菜、烟草、花卉、牧草、草坪、果树等多种植物，几乎每一种农作物都受其中一种或多种鳞翅目害虫的危害。为了控制这些害虫的危害，每年无节制的使用大量高毒、高残留化学杀虫剂，由此引起的环境污染、残留增高、抗药性增强等一系列问题，严重影响着我国农产品安全食生产，生产上急需发展对鳞翅目害虫有效的无公害防治技术。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）由于具有杀虫效果好，特异性强，生产和使用方便，不污染环境等特点而在害虫生物防治中发挥了重要作用。不同的Bt菌株产生不同的杀虫晶体蛋白质（Insecticidal Cyrstal Proteins 简称ICPs），使得菌株间的杀虫谱和杀虫活性存在明显差异（Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiology and Molecular Biology Reviews.1998,62(3):775-806），这就为筛选针对不同种类鳞翅目害虫具有特异性杀虫活性的新菌株提供了广阔空间。在苏云金芽孢杆菌的分离鉴定、筛选方面，文献“苏云金芽孢杆菌的分离与鉴定“河北省果园苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定（华北农学报，2010,25(4):201-205）”、“我国土壤中苏云金芽孢杆菌的分离与基因型的鉴定（应用与环境生物学报，2005,11(6):756-759）”及“河北省部分地区苏云金芽孢杆菌菌株多样性的研究（安徽农业科学，2007,35(18):5540-5541）”、“苏云金芽孢杆菌的筛选和初步鉴定（生物技术，2003,13(6):34-36）”等对我国苏云金芽孢杆菌分离、鉴定、分布特点、晶体形态、杀虫特性等进行了研究。在高效、特异性菌株的筛选方面，文献“小菜蛾高效Bt 菌株的分离、生化特性及基因型鉴定（应用昆虫学报，2011,48(2):285-290）”、“一株对美国白蛾高毒力苏云金芽孢杆菌的杀虫基因鉴定（中国农学通报，2010,26(3):242-244）”、“抗夜蛾科苏云金芽孢杆菌WY-197菌株的生物学特性研究 (微生物学杂志，2005,25(1):25-28)”、“一株对鳞翅目高毒力的苏云金芽孢杆菌亚种的分离与鉴定（四川农业大学学报，2006, 24(2):152-155）“苏云金芽孢杆菌科默尔亚种15A3株的cry基因分析及杀虫特性（微生物学报，2002,42(2):169-174）”等分别从众多苏云金芽孢杆菌筛选到了杀鳞翅目害虫的高效特异性菌株。在菌株的发酵及剂型研究方面，文献“苏云金杆菌Bt0601菌株发酵培养基的优化（生命科学研究，2007,11(4):323-327）”、Bt培养基配比及伴孢晶体纯化条件的优化（华东理工大学学报（自然科学版），2006,32(3):285-289）”、“苏云金杆菌“79007”菌株发酵工艺的研究（微生物学杂志，2006,26(3):5-8）”、“苏云金芽孢杆菌高浓度液体发酵培养基的优化研究（化学与生物工程，2006,23(9):38-39）”、“苏云金芽孢杆菌油剂增效因子的筛选（华中农业大学学报，2000,19(2):134-137）”、“17600 IU/mg苏云金芽孢杆菌浓悬浮剂的研制（湖北农业科学，2010,49(12):3048-3051）”等对苏云金芽孢杆菌的发酵及剂型方面进行了研究。

苏云金芽孢杆菌杀虫剂是一种无污染的生物农药，为了扩大苏云金芽孢杆菌的杀虫谱及提高杀虫活性，国内外都致力于新菌株的分离鉴定和新杀虫基因的开发。但是，广谱高效的苏云金芽孢杆菌的分离及应用仍很少报道，特别是针对果树及蔬菜上鳞翅目害虫的Bt菌株更少。Bt YX-1是目前分离到的一株天然广谱高效杀鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌，含有多个杀虫蛋白质编码基因，对果树及蔬菜上多种鳞翅目害虫如美国白蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、小菜蛾、梨小食心虫、苹小卷叶蛾、苹掌舟蛾及苹果蠹蛾等害虫均有高效毒杀作用，发酵性能优良，是一株极具开发应用前景的天然苏云金芽孢杆菌。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株对美国白蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、小菜蛾、梨小食心虫、苹小卷叶蛾、苹掌舟蛾及苹果蠹蛾等多种鳞翅目害虫具有较高毒力的苏云金芽孢杆菌YX-1（Bacillus thuringiensis YX-1）。本发明的另一个目的是针对以往苏云金杆菌制剂存在的持效期短、性能不稳定、起效慢等问题，提供了一种Bt YX-1可湿性粉剂的制备方法，用该方法制备的杀虫剂可用于果树和蔬菜及其它植物鳞翅目害虫的防治，其特点是杀虫谱广，持效期长，药效稳定，不杀伤昆虫天敌，对人、畜无毒，对环境安全。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明菌株是河北省保定市易县花生地土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）新菌株，已于2011年9月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，编号：CGMCC№.5256，名称为苏云金芽孢杆菌YX-1（Bacillus thuringiensis YX-1）。

苏云金芽孢杆菌YX-1具体通过如下方法获得：采用醋酸钠-抗生素分离法，称取10g土样放入装有50mL醋酸钠培养基的摇瓶中，加入青霉素钠盐400μg/mL，200rpm/min、30℃摇床培养4h。培养结束后取土壤悬液10mL，加入无菌的离心管内308g离心15min，取上层浑浊液1.5mL于65℃水浴锅水浴15min，取热处理后的浑浊液0.2mL涂平板，将平板置30℃培养箱中培养。3-4d后从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，发现一株含有菱形晶体形态的Bt菌株，根据其土壤样品来源地的名称（易县）的首字母组成代码YX，又因该菌株是从同一批土壤样品中分离的多株苏云金芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为1的一株，因此将该苏云金芽孢杆菌命名为YX-1。

经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢，同时能形成菱形伴孢晶体（见图1）；其晶体蛋白在14h开始表达，而生长曲线表明其14h已进入稳定期（见图2）；经过PCR-RFLP分析，Bt YX-1的杀虫晶体蛋白质基因为cry1Ac、cry2Ac、cry1I、vip3Aa、cry34-35（见图3和图4）；SDS-PAGE电泳表明，Bt YX-1主要产生约130kDа和65kDа两种杀虫晶体蛋白质（见图5）；生物测定结果表明（见表l），Bt YX-1对美国白蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、小菜蛾、梨小食心虫、苹小卷叶蛾、苹掌舟蛾等多种鳞翅目害虫有较高杀虫活性，其中对美国白蛾和小菜蛾最为敏感，LC₅₀值分别为14.48mg/L、15.03mg/L，对斜纹夜蛾的敏感性最差，LC₅₀值为6.24×10⁴ mg/L，该菌对这些害虫的LC₅₀值均低于标准菌株Bt HD-1对这些害虫的LC₅₀值。Bt YX-1对苹果蠹蛾幼虫也具有杀虫活性，72h校正死亡率达到86.5±6.8%。

表1 Bt YX-1对鳞翅目9种害虫的致死中量（LC₅₀）

摇瓶发酵:摇瓶发酵的目的在于选择最佳发酵配方，优化发酵条件，采取不同的含固量、不同的C/N比和不同的无机盐进行正交试验。

1.发酵培养基的选择：

（1）碳源、氮源筛选

选择黄豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、蛋白胨、玉米粉、酵母粉、蔗糖等7个因素，每个因素选高、中、低3个浓度进行正交试验设计，在不同培养基中KH₂PO₄固定为1，通过L₁₈(3⁷)正交试验对各组分进行优化。以黄豆饼粉、花生饼粉为主要氮源，以玉米粉为主要碳源，考察不同培养基组分对发酵液毒力和活芽孢数的影响，正交设计见表2。

表2 L₁₈(3⁷)正交试验因素水平表（g/L）

水平	黄豆饼粉	花生饼粉	鱼粉	蛋白胨	玉米粉	酵母粉	蔗糖
								1	30	30	10	3	16	6	1
2	32	32	12	6	14	3	2
								3	34	34	16	9	18	9	3

（2）无机盐筛选

以L₁₈(3⁷)正交试验确定的较佳培养基为基础培养基，分别加入不同浓度的硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸铁等，考察无机盐类对发酵液毒力的影响，每种无机盐选高、中、低3个浓度，采用L₉(3⁴)正交表进行试验设计，实验设计方案见表3。

表3 L₉(3⁴)正交试验因素水平表（g/L）

水平	MgSO₄·7H₂O	KH₂PO₄	CaCO₃	FeSO₄·7H₂O
					1	0.2	1	0.1	0.02
2	0.4	2	0.5	0.06
					3	0.6	4	1	0.04

根据正交试验，获得Bt YX-1的最佳培养基配方为：黄豆饼粉32g/L、花生饼粉30g/L、鱼粉16g/L、蛋白胨6g/L、玉米粉20g/L、酵母粉6g/L、蔗糖1g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄1g/L、CaCO₃0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.06g/L、余者用水补足。

2.发酵培养步骤：

（1）菌种活化：将保存于-20℃的菌株YX-1在LB平板培养基上进行活化（30℃），挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁（30℃）备用，所得作为接种菌；

（2）种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入100mL LB培养液，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶接入步骤（1）一接种环上述活化好的YX-1菌株，在摇床上进行振荡培养，30℃、180rpm培养24h，所得作为种子液；

（3）制备发酵培养基：按照上述发酵培养基的配方配制培养基，分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL，121℃灭菌30min，降至室温后备用；

（4）发酵培养：向步骤（3）所得每瓶发酵培养基中接种步骤（2）所得种子液2mL，30℃、180rpm条件下进行发酵培养；

（5）24h以后，每隔1h从步骤（4）的三角瓶中进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90%即可停止发酵培养；既得苏云金芽孢杆菌YX-1液体制剂。

3.剂型制备：

一种苏云金杆菌可湿性粉剂，主要是由定量的苏云金芽孢杆菌孢晶混合物原粉和定量的非活性物质组成，其中：

（1）该可湿性粉剂的配方为：苏云金杆菌原粉40%~50%，分散剂5%～10%，润湿剂5%～10%，稳定剂1%，紫外光保护剂1%，载体28%～48%。

（2）所述分散剂可以是木质素磺酸钠、CNF、HK-2302、NNO或扩散剂MF；润湿剂可以是Morwet EFW、洗衣粉、蚕沙粉、十二烷基苯硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或拉开粉；稳定剂可以是黄原胶或羧甲基纤维素钠；紫外光保护剂可以是脱脂奶粉、腐殖酸、维生素C或羧甲基纤维素；载体可以是白炭黑、高岭土、硅藻土、轻质碳酸钙或滑石粉；所述的苏云金杆菌的原粉是苏云金杆菌经过离心浓缩后冻干或经喷雾干燥的孢晶混合原粉；

（3）制备方法：将Bt原粉以及上述其它原料按照上述配比称量好，用低温粉碎气流机粉碎后，混合均匀，过筛制成44μm以下的细小颗粒，既得Bt YX-1可湿性粉剂；

（4）Bt YX-1可湿性粉剂毒力效价测定方法：将Bt标准品（产品名为生绿16000IU/mg苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂，购自湖北康新农药技术有限公司）和Bt待测样品依次稀释，选择5个合适的浓度梯度，以小菜蛾为试虫通过浸液法进行生物测定。即将大小一致新鲜的甘蓝叶片在个处理浓度溶液中浸渍10s，自然晾干后放入生测盒内，每盒接入15头生长一致的二龄幼虫，每个处理重复3次，用无菌水做空白对照。试虫置于（26±1）℃、65%相对湿度、14h光照条件下培养，记录72h各处理幼虫死虫数。然后利用DPS 7.05软件分别计算出Bt标准品LC₅₀值和Bt待测样品的LC₅₀值，按下式计算待测样品的毒力效价：

式中：X---待测样品毒力效价

S---标准品LC₅₀值

P---标准品效价

Y---待测样品LC₅₀值

本发明与现有技术相比，具有以下优点：该发明针对果树、蔬菜上重要的鳞翅目害虫，对美国白蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、小菜蛾、梨小食心虫、苹小卷叶蛾、苹掌舟蛾及苹果蠹蛾等害虫均有很好的防效，杀虫谱广，其毒力均高于标准菌株Bt HD-1。利用菌株的这一优点，研制开发出的Bt YX-1可湿性粉剂既可用于防治多种果树、蔬菜上的鳞翅目害虫，也可用于防治大田作物以及园林植物上的鳞翅目害虫。

附图说明：

图1：Bt YX-1的芽孢和晶体的光学显微镜图片

图2：Bt YX-1的生长曲线及pH值变化曲线

图3：Bt YX-1的PCR扩增图谱，其中：

M：DNA分子量标准(8kb,5kb,3kb,2kb,1kb,0.75kb,0.5kb,0.25kb,0.1kb)

1-6：Bt YX-1 cry1、cry2、cry1I、vip3A、cry34-35的PCR产物

图4：Bt YX-1的酶切分析图谱，其中：

M：DNA分子量标准(8kb,5kb,3kb,2kb,1kb,0.75kb,0.5kb,0.25kb,0.1kb)

1：cry1-KUN2/PstI＆EcoRI

2：cry1-KUN3/PstI＆XbaI

3：cry2/MspI＆HincⅡ

4：Vip3A/HindⅢ＆EcoRI

图5：Bt YX-1晶体蛋白SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

下列实例是进一步对本发明的说明，不应当成为对本发明的限制。

下列实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下列实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1、苏云金芽孢杆菌YX-1的分离与鉴定

本发明人自行从土壤中分离了Bt菌株YX-1，土壤来源于河北省保定市易县。

称取10g土样放入装有50mL醋酸钠液体培养基（蛋白胨0.5g，酵母粉0.25g，NaCl 0.5g，醋酸钠1.8g，水50mL，调pH值7.2-7.4，121℃，高压灭菌30min）的摇瓶中，加入青霉素钠盐400μg/mL，摇床培养（200rpm/min，30℃）4h。培养结束后取土壤悬液10mL，加入无菌的离心管内308g离心15min，取上层浑浊液1.5mL于65℃水浴锅水浴15min，取热处理后的浑浊液0.2mL涂LB固体培养基（蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl 2g，琼脂粉3.2g，水200mL，调pH值7.2-7.4，121℃，高压灭菌30min）平板，将平板置30℃培养箱中培养。3-4d从平板上挑取类似Bt的菌株涂片，用碱性复红和孔雀绿染色，在油镜下观察晶体形状﹑大小以及芽孢和晶体的分离率，发现一株含有菱形晶体的菌株，命名为YX-1。

Bt YX-1在LB固体培养基中上30℃培养24h，形成针尖大小的浅黄色菌落，边缘平滑，培养72h，形成圆盘状菌落，乳白色，边缘不整齐，表面似毛玻璃，有皱纹。将孢晶混合物涂在载玻片上，用酒精灯热固定、孔雀绿和碱性复红染色，光学显微镜下观察晶体的形状（见图1），可见营养体细胞呈杆状，单个或成短链状，孢子囊未见膨大，芽孢椭圆形，伴孢晶体呈菱形。

上述苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）YX-1，已于2011年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC№.5256，名称苏云金芽孢杆菌YX-1（Bacillus thuringiensis YX-1）。

实施例2、苏云金芽孢杆菌YX-1的生长特性观察

将Bt YX-1接种于LB液体培养基中活化过夜，按1%的接种量接菌于LB液体培养基中，振荡培养(28℃、230rpm/min)，每隔2h取样测定OD₆₀₀，共测24h。同时测定培养液的pH值，并观察其发酵过程中菌株的生长发育状况。

苏云金芽孢杆菌YX-1在LB液体培养基中生长良好，在生长周期24h内，可正常产生芽胞和伴孢晶体。每隔2h取样测定培养液的OD₆₀₀值和pH值绘制生长曲线与pH变化曲线(见图2)，并观察其发酵过程中菌株的发育状况。其中0～4h为潜伏期，pH值变化不大；4～14h为对数生长期，14h营养体开始出现内生芽孢，芽孢位于杆菌的中央，pH值呈先迅速下降，后缓慢回升的现象，在10h时达到最低点pH 5.89；14～24h为稳定期，有大约80%的营养体出现芽孢，芽孢位于杆菌的中央，晶体蛋白位于杆菌的两端，但是没有发生孢晶分离，此阶段pH值呈缓慢上升，到24h时pH达7.53。

实施例3、苏云金芽孢杆菌YX-1的基因型鉴定

Bt YX-1总DNA的提取参考Narva (Novel Bacillus thuringiensis microbes active against nematodes,and genes encoding novel nematodes-active toocin from Bacillus thuringiensis isolates. European Patent Office.1991,EP0462721)方法。

利用Bt cry基因鉴定体系（Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA. Appli- ed and Environmental Microbiology.1996,62:1369-1377；苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立.中国农业科学，1998, 31(3):13-18），以Bt YX-1的总DNA为模板，用31对通用引物进行PCR扩增，结果表明Bt YX-1含有cry1、cry2、 cry1I、vip3A、cry34-35基因（见图3）。用K5un2/K3un2、K5un3/K3un3、S5un2/S3un2、vip3A-1/vip3A-2四对引物进行扩增，扩增产物进行酶切分析（见图4），根据此结果进行判定，Bt YX-1含有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、vip3Aa、cry34-35基因。

实施例4、苏云金芽孢杆菌YX-1晶体蛋白的SDS-PAGE分析

在油镜下观察已经孢晶分离的菌落，刮取少量菌苔充分溶于100μL灭菌水中，振荡重悬，离心(4℃、15294g、5min)，弃上清，用 200mL 1M NaCl重悬后，离心(4℃、15294g、5min)，弃上清，再用灭菌水重悬后，离心(4℃、15294g、5min)，弃上清，将沉淀重悬于20μL灭菌水中，加入相同体积的2×上样缓冲液，混匀后，100℃煮沸5min，离心(4℃、15294g、1min)，取上清用于SDS-PAGE检测，采用5%的浓缩胶，8%的分离胶，采用恒流电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝染色。同时以标准菌株HD-1作阳性对照，以同样的方法制作检测样品，结果见图5。

由图5可以看出，Bt YX-1含有分子量大约为130kDa和65kDa的两个蛋白主条带。

实施例5、苏云金芽孢杆菌YX-1对鳞翅目害虫杀虫活性测定

孢晶混合母液制备：分别将Bt YX-1和Bt HD-1接种于LB固体平板培养基上28℃培养72h后镜检，在产生大量晶体时，加入适量灭菌水，将菌体从平板上刮下，放入离心管中，15294g 离心5min弃上清，取沉淀为孢晶混合物，称重后加入一定量的无菌水充分混匀后制备成均匀的500mg/mL的孢晶混合母液备用。

分别将Bt YX-1和Bt HD-1的孢晶混合母液稀释成系列浓度梯度，按以下两种方法饲喂供试昆虫，并将各处理试虫置于（26±1）℃、60%～70%的相对湿度、14h光照的条件下培养，72h后观察试虫的生长状况，记录死虫数，采用DPS数据处理***计算LC₅₀值。

对棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟的2龄幼虫及梨小食心虫的3龄幼虫的生物活性测定用人工饲料混合饲喂法。按每10g饲料加入1mL孢晶混合菌悬液，充分混合均匀，平均分装于24孔板内，每孔接入1头试虫。每个处理重复3次，每次重复24头供试昆虫，以无菌水处理饲料作为对照。

对美国白蛾、斜纹夜蛾、小菜蛾和苹掌舟蛾的2龄幼虫及苹小卷叶蛾的3龄幼虫的生物活性测定用浸叶法。取新鲜的杜仲叶片、蓖麻叶片、甘蓝叶片和苹果叶片，分别在制备好的Bt孢晶混合菌悬液（内含0.3%土温80）内浸渍10s，取出然晾干后放入4×9cm生测盒内，每盒接入幼虫20头。每个处理重复3次，每次重复20头试虫，用无菌水（内含0.3%土温80）浸渍叶片做空白对照。

采用饲料混合饲喂法测定Bt YX-1对苹果蠹蛾3龄幼虫的杀虫活性。利用梨小食心虫的人工饲料，按10g饲料加入1mL孢晶混合物（20mg/mL），混匀后分装入24孔生测板内，每孔接入1头试虫。每个处理重复3次，每次重复24头供试昆虫，以无菌水处理饲料作为对照。72h后观察试虫的生长状况，记录死虫数。

由表1可以看出，该菌株对美国白蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、玉米螟、小菜蛾、梨小食心虫、苹小卷叶蛾及苹掌舟蛾的幼虫均有杀虫活性，并且对这些害虫的致死中量（LC₅₀值）均低于标准菌株Bt HD-1对这些害虫的LC₅₀值。

Bt YX-1菌株对苹果蠹蛾幼虫也具有杀虫活性，72h校正死亡率达到86.5±6.8%。

实施例6、苏云金芽孢杆菌YX-1的摇瓶发酵

1.发酵培养基的选择：

摇瓶发酵的目的在于选择最佳发酵配方，优化发酵条件，采取不同的含固量、不同的C/N比和不同的无机盐进行正交试验。

（1）碳源、氮源筛选

（2）无机盐筛选

2.发酵培养步骤：

（1）菌种活化：将保存于-20℃的菌株YX-1在LB平板培养基上进行活化（30℃），挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁（30℃）备用，所得作为接种液；

（3）制备发酵培养基：按照上述发酵培养基的配方配制培养基，分装于500 mL三角瓶中，每瓶200mL，121℃灭菌30min，降至室温后备用；

（4）发酵培养：向步骤（3）所得每瓶发酵培养基中接种步骤（2）所得种子液2mL，30℃、180rpm条件下进行发酵培养培养；

实施例7、苏云金芽孢杆菌YX-1的原粉制备

Bt YX-1冻干粉的制备方法按以下步骤完成实现：a、取保藏的苏云金杆菌YX-1接种于LB固体斜面培养基上，在30℃条件下培养24h，然后再在LB固体斜面培养基上用接种环挑取菌苔转接于5ml LB液体培养基中，在30℃条件下，以200rpm/min的转速摇菌12h，作为苏云金杆菌种子菌液；b、将种子菌液按体积分数4%-5%接种于50ml发酵培养基中，在30℃条件下，以200rpm/min的转速摇菌72-96h,直至芽孢脱落量为85%-95%，得到苏云金杆菌发酵液；c、将培养液在6082g离心10min，弃上清液，收集沉淀即得Bt孢晶混合物；d、将Bt孢晶混合物分装于50ml三角瓶中，冻干厚度为1cm-1.5cm，后置超低温冰箱进行预冻5h，取出放入真空冻干机内进行冻干处理。真空冻干机控制仓内温度设定在-60℃左右，真空度保持在60~100Pa之间，48h后干燥结束，即得到本发明中的Bt原粉。

实施例8、效价18420 IU/mg Bt YX-1可湿性粉剂的制备

取Bt YX-1原粉40g，木质素磺酸钠5g,十二烷基磺酸钠10g, 黄原胶1g，脱脂奶粉1g，白炭黑43g，各组分混合均匀，然后在气流粉碎机中粉碎后过筛制成44μm以下的细小颗粒，即为Bt YX-1可湿性粉剂。以标准品为参照，检测其生物效价为18420 IU/mg。

实施例9、效价24800 IU/mg Bt YX-1可湿性粉剂的制备

取Bt YX-1原粉50g，木质素磺酸钠5g,十二烷基磺酸钠10g, 黄原胶1g，脱脂奶粉1g，白炭黑33g，各组分混合均匀，然后在气流粉碎机中粉碎后过筛制成44μm以下的细小颗粒，即为Bt YX-1可湿性粉剂。以标准品为参照，检测其生物效价为24800 IU/mg。

由于各成分及参数的选取组合举不胜举，故上述各实施例仅供参考，上述各实施例可在不脱离本发明的范围下加以若干变化，故以上的说明所包含的应视为例示性，而非用以限制本发明申请专利的保护范围。

Claims

1.一株苏云金芽孢杆菌YX-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC №.5256。

2.根据权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌菌株YX-1，其特征在于，该菌株有如下特征：

（1）至少具有cry1Ac、cry2Ac、cry1I、cry34-35、vip3Aa杀虫基因组合；（2）对鳞翅目的梨小食心虫、棉铃虫、美国白蛾、苹小卷叶蛾、舟型毛虫、苹果蠹蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫、小菜蛾、甜菜夜蛾均有较高的致死作用。

3.根据权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YX-1生产的微生物杀虫剂，其特征在于所述杀虫剂为可湿性粉剂。

4.根据权利要求3所述的可湿性粉剂，其特征在于，其组分及其含量为：苏云金杆菌原粉40%~50%，分散剂5%～10%，润湿剂5%～10%，稳定剂1%，紫外光保护剂1%，载体28～48%。

5.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，YX-1菌粉为芽孢和晶体混合物，是苏云金芽孢杆菌YX-1通过发酵培养基培养至孢晶分离期，经浓缩干燥所得。

6.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述的分散剂为木质素磺酸钠、CNF、HK-2302、NNO、扩散剂MF中的任何一种。

7.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述湿润剂为Morwet EFW、洗衣粉、蚕沙粉、十二烷基苯硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、拉开粉中的一种或几种混合物。

8.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述稳定剂为黄原胶、羧甲基纤维素钠中的一种或几种混合物。

9.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述紫外光保护剂可以是脱脂奶粉、腐殖酸、维生素C、羧甲基纤维素的一种或几种混合物。

10.根据权利要求4所述的可湿性粉剂，其特征在于，所述载体为白炭黑、高岭土、硅藻土、轻质碳酸钙、滑石粉中的一种或几种混合物。

11.根据权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，发酵培养基各组分为：黄豆饼粉32g/L、花生饼粉30g/L、鱼粉16g/L、蛋白胨6g/L、玉米粉20g/L、酵母粉6g/L、蔗糖1g/L、 MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、KH₂PO₄1g/L、CaCO₃0.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.06g/L、余者用水补足。

12.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌YX-1菌株或权利要求3所述苏云金芽孢杆菌YX-1可湿性粉剂在植物害虫生物防治领域中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述植物害虫为果树鳞翅目害虫、蔬菜鳞翅目害虫、大田作物鳞翅目害虫和园林植物鳞翅目害虫。