CN111925963A - 暹罗芽孢杆菌b11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用 - Google Patents

暹罗芽孢杆菌b11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用。本发明将暹罗芽孢杆菌B11用于预防和/或治疗绵竹枯梢病,效果非常好,当将暹罗芽孢杆菌B11制成纳米微乳剂后,其储存时间长,菌种存活率高,对绵竹枯梢病有良好防效,且抗逆性好,抗高温、低温、耐干燥,适宜于商品化生产,无公害、绿色环保,可持续控制病害发生,生产成本低。

Description

暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域,具体涉及一种暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用。
背景技术
绵竹(学名:Bambusa intermedia Hsueh et Yi)是禾本科,簕竹属乔木状竹类植物,分布于中国云南中部和南部,栽培较广,亦见于四川、贵州局部地区,绵竹的纤维度、韧性基本同慈竹,投产早、产量高,适合竹编加工、造纸及作为笋子食用。由Arthriniumparaphaeospermum和Arthrobotryum rickii引起的绵竹枯梢病先在主捎或枝条的节叉处出现舌状或梭形病斑,初为淡褐色后变成紫褐色。当病斑包围枝或干一圈时,其上部叶片变黄,纵卷直到枯死脱落。在林间因病害危害的程度不一,竹子可出现枯梢、枯枝和全株枯死三种类型。剖开病竹,可见病斑内壁变为褐色,并长有白色絮状菌丝体。翌年春,枯梢或枯枝节处出现不规则的小突起,后不规则开裂,病菌借水、风雨传播或人为传播。在发病区,凡遇7~8月份高温、干燥的年份,此病易流行。
绵竹枯梢病的病害严重发生可造成整株绵竹树的死亡,制约绵竹生产的发展,对中国绵竹产业构成严重威胁。镰刀菌引起的绵竹枯梢病主要发生在主干和主枝上,病斑初现呈湿目前防治绵竹枯梢病主要以预防为主,化学防治为辅。用500倍的多苗灵或72%甲基托布津水溶液,可预防。主要食叶虫害为竹螟,防治方法为白僵菌粉剂或0.5%阿维菌素烟剂15千克/公顷;或 20%氰戊菊脂3000倍液喷施。但使用化学农药会污染环境,易引起人、畜中毒,还会使某些害虫产生不同程度的抗药性。因此,找到一种有效预防和/或治疗绵竹枯梢病的方法是非常有意义的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题,本发明的目的是提供一种暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis,该暹罗芽孢杆菌命名为B11,于2020年6月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.19894,该暹罗芽孢杆菌B11可有效预防和/或治疗绵竹枯梢病。
当将暹罗芽孢杆菌B11用于预防和/或治疗绵竹枯梢病时,可以将暹罗芽孢杆菌B11做成生物制剂,如液态制剂或者纳米微乳制剂;液态制剂是将暹罗芽孢杆菌B11制成液体发酵液,直接喷洒于绵竹易形成枯梢病的部位即可;纳米微乳制剂是将暹罗芽孢杆菌B11先制成液体发酵液,再与辅料如乳化剂等混合,均质,制成纳米微乳剂。
进一步地,发酵液和辅料的重量比为100:15-25;优选发酵液和辅料的重量比为100:17。
进一步地,辅料为乳化剂、稳定剂和防冻剂,乳化剂、稳定剂和防冻剂的重量比为8-12:1-4:2-8;优选乳化剂、稳定剂和防冻剂的重量比为10:2:5。当采用这些组分作为辅料时,纳米微乳剂具体制备过程为:将暹罗芽孢杆菌 B11先制成发酵液,将发酵液与乳化剂、稳定剂和防冻剂混匀,均质,制得。
进一步地,乳化剂由Tween 80与木质素磺酸钠按质量比为1:3混合制得,稳定剂为山梨酸醇,防冻剂聚乙二醇。
进一步地,暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂中暹罗芽孢杆菌B11的活芽孢的含量不低于1×109cfu/g。
当采用上述制剂预防和/或治疗绵竹枯梢病时,若制剂为液体,则可以直接涂抹或喷洒,若制剂为纳米微乳制剂,将其稀释后涂抹,具体为将制剂稀释成活芽孢含量为1×109cfu/ml的稀释液,然后喷洒在绵竹枝干上,使用量为10-50ml/亩,综合成本和防效,推荐最佳使用量为30-40ml/亩。
本发明具有以下有益效果:
本发明将暹罗芽孢杆菌B11用于预防和/或治疗绵竹枯梢病,效果非常好,当将暹罗芽孢杆菌B11制成纳米微乳剂后,其储存时间长,菌种存活率高,对绵竹枯梢病有良好防效,且抗逆性好,抗高温、低温、耐干燥,适宜于商品化生产,无公害、绿色环保,可持续控制病害发生,生产成本低。
附图说明
图1为基于16S rDNA序列构建的菌株B11的***发育树。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1暹罗芽孢杆菌B11的分离与鉴定
1、暹罗芽孢杆菌B11的分离
本发明的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11菌株于2017年6月15 日采用平板稀释涂布法分离于四川宜宾竹栽培区根际土,具体为将采回的土壤样本用无菌水稀释,稀释10-1,10-2,10-3,10-4,10-5共5个梯度,分别吸取100μL 10-3,10-4,10-5这3个梯度土壤稀释液,分别涂布NA平板(牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂粉15-20g,蒸馏水1000mL,pH7.0,混匀分装后121℃高压灭菌30min),每个处理3次重复,27℃培养48h,挑取菌落形态差异明显的单菌落进入初筛。
依据菌落的大小、颜色、是否突起,边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异,挑取单菌落在NA平板上划线纯化,纯化后转接NA斜面于 4℃保藏备用。按五点对峙法,在PDA平板中心接种直径5mm绵竹枯梢病病原菌菌饼,四周等距离接种上述待筛选菌株,25℃恒温培养,每个处理3 个重复。根据各筛选菌产生的抑菌圈的大小确定拮抗程度(表1,表2),效果优良的菌株为B11(编号11)。
表1内生细菌对绵竹枯梢病菌Arthrinium paraphaeospermum的抑制作用
编号 抑菌圈(mm) 编号 抑菌圈(mm)
1 0 9 0
2 0 10 4.0
3 5.5 11 21.2
4 0 12 0
5 11.0 13 0
6 10.5 14 0
7 0 15 8.8
8 0 16 6.9
表1内生细菌对绵竹枯梢病菌Arthrobotryum rickii的抑制作用
编号 抑菌圈(mm) 编号 抑菌圈(mm)
1 0 9 0
2 15.2 10 0
3 13.3 11 19.8
4 0 12 0
5 0 13 0
6 4.5 14 0
7 7.5 15 0
8 0 16 6.0
2、暹罗芽孢杆菌B11的鉴定
在NA平板培养基上培养了2天的B11菌株的单菌落呈乳白色,圆形,表面粗糙,边缘波纹状,不透明,无粘性。
除上述形态学观察,还结合了生理生化指标(表3)和分子生物学鉴定该内生菌B11为暹罗芽孢杆菌。
表3菌株B11生理生化指标
Figure BDA0002643772800000041
分子生物学鉴定(16S rDNA):通过提取细菌DNA进行PCR扩增及电泳,回收产物送至生物技术公司测序;将所测序列与GenBank数据库中已经报道的序列进行同源性BLAST分析,并用Clustalx(1.83)软件进行多重序列比较,再用Mega4.0软件中的邻接法构建***发育树,确定B11菌株在微生物***发育学上的地位。分子生物学鉴定得到长度为688bp的DNA片段(如 SEQ ID NO.1所示),将B11菌株的16S rDNA序列递交GenBank数据库进行BLAST分析,选取其中与之同源性较高的细菌16S rDNA序列,并用 Clustalx软件进行多重匹配排列分析,用Mega分析软件构建***发育树,构建的***发育树见图1。由图1可知,B11(MT482698)菌株与MT052693 以99%的16SrRNA基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1个分支,而与其他芽孢杆菌相距较远,表明B11与Bacillus siamensis的亲缘关系最近。
基于以上特征,所述菌种其分类命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11,已于2020年6月1日保藏在中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.19894。
实施例2暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂的制备
将暹罗芽孢杆菌B11,经过发酵,与乳化剂混合,均质,制成纳米微乳剂,具体包括以下步骤:
(1)发酵:将暹罗芽孢杆菌斜面种子接种于液体培养基中,初始接种量为4%,然后于25℃,185r/min,通气量200L/h条件下震荡培养48h;
其中,液体培养基中含有以下重量百分比的组分:0.5%纳米二氧化硅、 2%蔗糖、1%胰蛋白胨、0.1%氯化钠和0.05%硫酸镁,其余为无菌水,液体培养基pH值为7.2。
(2)制备纳米微乳剂:向上述发酵液中加入乳化剂、稳定剂、防冻剂于高压混合釜中使得乳化剂、稳定剂、防冻剂所占的重量百分比分别为10%、2%、5%,混匀,然后均质,即得暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂;其中,乳化剂由Tween 80与木质素磺酸钠按质量比为1:3混合制得,稳定剂为山梨酸醇,防冻剂聚乙二醇。
上述制得的纳米微乳剂进行袋装后,常温保存1.5年或低温(4℃)保存 3年不影响预防和治疗效果。
实施例3绵竹枯梢病的预防与治疗实验
制备暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂稀释液:取1g实施例2制得的暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂,用无菌水将其稀释成活芽孢含量为1×109cfu/ml 的稀释液。
制备病原菌液:病原菌在PDA培养基接种14天后,制孢子悬浮液。一个培养皿用50毫升无菌水冲洗,用移液枪吸出后脱脂棉过滤,离心机过滤后,用无菌水稀释,血球计数板观察计算孢子浓度,稀释至1×106cfu/ml。病原菌液由Arthrinium paraphaeospermum和Arthrobotryum rickii孢子悬浮液 1:1(重量比)混合而成。
盆栽防治实验:在宜宾绵竹种植区选取健康的绵竹栽至大棚进行盆栽试验(2年生,竹高1m),分别做如下处理:1)先采用针刺法在枝干中部接种病原菌液,每株100ml,15天后在原处采用喷洒法分别接种不同用量的暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂稀释液,每株100ml。2)每株先接种不同用量的暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂稀释液100ml,15天后接种病原菌液100ml。3) 同时接种病原菌和不同浓度的暹罗芽孢杆菌B11纳米微乳剂。每处理10个重复,分别以无菌水和无菌培养液作为对照。
处理完成后30天观察发病情况,进行病害调查统计,并计算发病率,病情指数和防治效果,记录如表4。
大田防治实验:在枯梢病发病(经调查和鉴定由Arthrinium paraphaeospermum和Arthrobotryum rickii引起)的绵竹种植区与健康绵竹种植区分区域,按50ml/亩、40ml/亩、30ml/亩、20ml/亩、10ml/亩喷施稀释液(1×109cfu/ml),每十天施用一次,共3次,每处理10个重复,分别以无菌水和无菌培养液作为对照。30天后观察发病情况,进行病害调查统计,并计算发病率,病情指数和防治效果,记录如表5。
病情分级标准:0级:无枯萎;1级:25%以下枝枯;2级:25%~50%(包含25%和50%)枝枯;3级:50%~75%枝枯(包含75%);4级:75%以上枝枯。
发病率(%)=(病株数/株数总和)×100;
病情指数=[∑(病级株数×代表数值)/株数总和×发病最重级的代表值] ×100;
防治效果(%)=[(对照病情指数增长率-处理病情指数增长率)/对照病情指数增长率]×100。
表4 B11微乳剂对绵竹枯梢病的盆栽防治效果
Figure BDA0002643772800000071
表5 B11微乳剂对绵竹枯梢病的大田防治效果
Figure BDA0002643772800000081
因以无菌水和无菌培养液作为对照时,两者并没有明显差异,因此,表 4和表5中仅给出了无菌水作为对照时的数据。
由表4、表5可知,在暹罗芽孢杆菌B11防治绵竹枯梢病试验中发现,暹罗芽孢杆菌B11对绵竹枯梢病的预防效果远远高于治疗效果,这可能是由于生防菌株在作物生长前期施用能够较早的定殖于植物表面,占领生存空间,降低病原菌侵染率;中期再次施用后进一步提高其繁殖能力,抑制病原菌生长。而仅在发病严重时施用,由于植物已被病原菌侵染,生防菌株的定殖和繁殖能力必然会降低,从而使防治效果下降。因此,应该从绵竹移栽后生长初期就开始施用。B11纳米微乳剂经稀释后,防治效果随稀释的增加而降低表现出不同的防治效果,10-50ml/亩的用药量的防效均超过50%,50ml/ 亩用药量对绵竹枯梢病防治效果最好,防效最高达98%,综合成本和防效,推荐使用量为30-40ml/亩。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 暹罗芽孢杆菌B11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60
acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120
atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180
ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240
ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300
ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360
gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420
gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540
tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600
aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtacagatg 660
tggaggaaca ccagtggcga aggcgagt 688

Claims (9)

1.暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11在预防和/或治疗绵竹枯梢病中的应用,所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11于2020年6月1日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC No.19894。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11制成液体制剂或乳制剂用于预防和/或治疗绵竹枯梢病。
3.一种预防和/或治疗绵竹枯梢病的制剂,其特征在于,包含权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11。
4.根据权利要求4所述的预防和/或治疗绵竹枯梢病的制剂,其特征在于,所述制剂为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11液体发酵液。
5.根据权利要求3所述的预防和/或治疗绵竹枯梢病的制剂,其特征在于,所述制剂为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11纳米微乳剂。
6.权利要求5所述的预防和/或治疗绵竹枯梢病的制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11制成液体发酵液,然后与辅料混合,均质,制得。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,辅料包括乳化剂、稳定剂和防冻剂。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于,暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)B11纳米微乳剂中暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)B11的活芽孢的含量不低于1×109cfu/g。
9.采用权利要求3-5任一项所述的制剂预防和/或治疗绵竹枯梢病的方法,其特征在于,将制剂稀释成活芽孢含量为1×109cfu/ml的稀释液,然后喷洒在绵竹枝干上,每亩喷洒10-50ml。
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