CN109517766A - 一种杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌BtYJ2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌BtYJ2及其应用，该苏云金芽孢杆菌的分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)BtYJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018801，保藏日期为2018年11月19日，保藏地址为中国武汉武汉大学。本申请用发酵液饲喂法对美国白蛾3龄幼虫进行了生物测定，结果显示，8小时致死率达80％，24小时致死率达100％，表明该菌具有较好的杀虫活性，为该菌进一步的生物防治应用打下了坚实的基础，具有很好的实用性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌BtYJ2及其应用。
背景技术
农林业病虫害严重损害林木作物的健康生长，是威胁林木和农作物安全的重要因素之一。目前应对农林业病虫害的主要方法为化学防治，但长期使用化学农药会使害虫产生抗药性使其更加难以杀灭，并且化学药剂会对环境造成很大危害。生物防治是指利用生物物种之间的相互关系，以一种或者一类生物抑制另一种或另一类生物的方法，目前生物防治大致可以分为捕食性天敌防治、寄生性天敌防治和微生物防治三大类。利用生物防治病虫害，能有效地避免这些问题，因而生物防治具有广阔的发展前途。
美国白蛾(Hyphantriacunea)是世界性检疫害虫。主要危害果树行道树观赏树木，尤以阔叶树危害严重，对农作物林木果树等造成了严重的危害，目前已被列入我国首批外来入侵物种。其食性较杂，对300多种植物都有危害。最严重的一次灾情发生在1984年陕西杨凌的一个飞机修理厂。近400亩厂区所有法国梧桐和杨树的树叶都被吃光，虫子还跑到职工家里，窗体底端天花板、墙角、炉灶、床，无所不在。1995年，美国白蛾虫灾在天津塘沽再次暴发。当时市民出行必须打伞，以防止幼虫掉进脖子里。天津市政府的一份报告说，虫灾发生的地区有6成的叶子被吃光，原本翠绿的街道变成了灰色。近年来，美国白蛾又呈现出爆发的势态，2017年，江苏省涟水县美国白蛾疫情扩散范围大、灾情重；平均有虫株率达52.3％，部分调查样地有虫株率高达100％，远远高于美国白蛾成灾标准数倍；在部分危害重的乡镇地面随处可见美国白蛾老熟幼虫，有的甚至爬到居民家中，给百姓生活带来了极大困扰。
芽孢杆菌是一种能形成芽孢的杆菌或者球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、苏云金芽孢杆菌属等。芽孢杆菌由于产生内生孢子，对于外界环境具有较强的抵抗力，对于其所生存环境中的干燥。紫外线辐射伤害和热具有抵抗力并且能让自己免受影响，这样的生物学特征使芽孢杆菌具有非常良好的应用前景，例如使用活菌制剂的生物制品，很多生物农药是利用芽孢杆菌制成的，尤其是苏云金芽孢杆菌，苏云金杆菌生产的伴胞晶体在农林业上是有效的生物杀虫剂，目前已成为世界上使用量最大的生物农药。
目前已知的苏云金芽孢杆菌亚种有以色列亚种，库斯塔柯亚种，科莫尔亚种，加拿大亚种等九个亚种。苏云金芽孢杆菌的母细胞会在形成芽孢的同时伴随着形成晶体蛋白，称之为伴胞晶体，伴胞晶体呈现立方体、球形、菱形、镶嵌形、无定形，是具有杀伤活力的杀虫晶体蛋白。它的伴孢晶体由一种或多种对昆虫具有专一毒性的蛋白质即δ内毒素组成。因为苏云金芽孢杆菌具有良好的特异性杀虫活性，效果好还不污染环境，苏云金芽孢杆菌已经成为目前最有效的生物杀虫剂。目前已知苏云金芽孢杆菌对鳞翅目、鞘翅目等九个目的昆虫和螨虫、植物线虫、原生动物、扁形动物等有特异性杀虫活性。
苏云金芽孢杆菌对危害农林业的害虫有很强的杀虫活性。1999年姚江、徐兴权对苏云金芽孢杆菌Ly30的室内毒力测定结果表明，Ly30菌株对赤松毛虫、柏毛虫、菜青虫和玉米螟有明显的致病力。Ly30菌悬液感染的供试虫表现为食量小、排粪少、死虫较多且倒挂于枝叶上；对照菌株H7型标准菌株感染的供试虫表现为食量较大、排粪多、虫活跃，发育正常。此外，Ly30菌悬液喂毒菜青虫时最早在16h即有虫死亡，28h时其死亡率达96.17％；而对照菌株鲇泽亚种标准株感染时最早在24h有虫死亡，48h时其死亡率为73％。这证明Ly30对赤毛虫具有特异性的高毒力，Ly30会在林业防虫上有大规模的应用。
国内美国白蛾的危害非常严重，是我国首批外来入侵物种，广泛分布于我国云南、广西、广东、江西、浙江、湖南、贵州、湖北和四川等地，美国白蛾幼虫喜欢群集在树叶上并吐丝网巢，并喜欢在网内食用叶片，网巢稀松不规则，1～2龄幼虫只食用叶肉，有时会将整片叶子上的叶肉全部吃光，只留下叶脉，会使叶片呈现为纱网状，4龄的白蛾幼虫开始食量大增，5龄后则进入暴食期造成严重的危害。幼年期的美国白蛾食量大，造成植物长势衰弱，抗逆性低下，果实品质降低，部分枝条甚至整株死亡。严重受害的果树，果实产量大减，被虫害的植物抗寒抗病能力下降，容易受到细菌真菌的侵袭。目前美国白蛾主要通过化学方法来进行防治，但长期使用化学药剂会对环境造成很大危害，寻找其他可代替的防治方法是有必要的。苏云金芽孢杆菌具有出色的杀虫活性，但是对美国白蛾具有有效的杀虫特异性的苏云金芽孢杆菌还未见有人报导。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述一株杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌，其分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)BtYJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018801，保藏日期为2018年11月19日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2在杀美国白蛾中的应用。
所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2的培养物在杀美国白蛾中的应用。
所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2在制备杀美国白蛾制剂中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本申请从连云港海域筛选到的BtYJ2菌株对美国白蛾2龄幼虫具有很好的活性，杀虫活性显示BtYJ2菌的杀虫效果明显，8h相对致死率即达到80％以上，24h达到100％，说明杀虫活性很强，比姚江等使用的Ly30还要活性高，是一株生防潜力极强的菌，具有很好的实用性。
附图说明
图1是BtYJ2号菌的菌落形态图；
图2是光学显微镜下BtYJ2号菌的形态观察结果图；
图3是光学显微镜下的BtYJ2芽孢和伴胞晶体形态结果图；
图4是BtYJ2菌杀虫活性测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例中所使用的培养基和试剂：
液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，1000mL H2O，pH调整到7～8之间，121℃高温高压灭菌20min。
固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，1000mL H2O，pH值调整到7～8之间，121℃高温高压灭菌20min。
实施例1
从连云港海岸分离出的一株2号菌。将2号菌进行数次的分离提纯并放在25℃的温箱中固体培养，如图1所示，在固体平板上，菌落为乳白色，呈现沙质，干燥状。
分离提纯2号菌的单菌落，培养一段时间后，进一步观察：取一张洁净的载玻片，在其中央滴一滴清水，用接种环刮取一小块2号菌，将其放置在载玻片上的清水中，自然晾干，草酸铵结晶紫染色1分钟。自来水冲洗，碘液染色约1分钟。水洗，用吸水纸吸去水分。滴加95％酒精进行脱色，蕃红染色1分钟，自来水冲洗。干燥，镜检。如图2所示，菌株革兰氏染色呈阳性，营养体细胞为杆状，两端钝圆。液体培养72h左右营养体细胞分解，只剩下芽孢和伴胞晶体(图3)，2号菌的伴胞晶体种类较多，其中大多数为球形，少数为菱形、不规则形。
2)基因组的提取
将分离纯化后的2号菌液体过夜培养(12h左右)，OD600值在0.9左右。使用捷瑞公司DNA提取试剂盒提取DNA。采用通用引物，进行16SrDNA的PCR鉴定，然后将16SrDNA PCR结果送到测序公司测序，获得16SrDNA序列，如SEQ ID NO.1所示。然后进行BLAST相似度比对，结果表明2号菌与苏云金杆菌的相似度为100％，判定2号菌属苏云金芽孢杆菌，命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)BtYJ2。
实施例2室内杀虫活性测试
供试昆虫：选用的供试昆虫为黑头型的美国白蛾幼虫，幼虫体长可以长到3.5cm，头部黑亮，体灰黑色，沿背中央有1条灰褐至灰黑色的宽纵带，背线、气门上线、气门下线浅黄色。毛带上方两侧各有1排黑色毛瘤。体两侧毛瘤多为橙黄色，毛瘤上着生白色长毛丛，杂有黑色或褐色毛。气门白色。幼虫是长椭圆形，具黑边，胸足黑色。
将实验室培育至三龄的美国白蛾幼虫作为供试昆虫，在实验前先进行8个小时的饥饿处理。另外准备形态大小相近的樱花树叶，将其分为三份。一份用苏云金芽孢杆菌BtYJ2菌液[挑取固体平板上的BtYJ2菌落，接种至液体LB培养基中，(牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，1000mL H2O，pH调整到7～8之间，121℃高温高压灭菌20min)，28℃，200rpm，摇床培养48h后即得菌液]。进行浸泡处理，一份用Ly30菌株进行浸泡处理，一份作为空白对照不做任何处理。然后将浸泡过的树叶自然晾干。将饥饿处理后的美国白蛾分为三份，分别加入三份经过不同处理的树叶，喂养一段时间后观察实验结果。
室内杀虫活性测试结果(表1)，表明BtYJ2菌对美国白蛾具有优秀的杀虫活性，BtYJ2菌悬液感染的美国白蛾表现为食量小排粪小死虫多。除此之外，未死亡的白蛾幼虫的生命活性非常低，不进食不蠕动，用毛笔拨弄无反应。用于作为对照的Ly30菌液浸泡树叶培育的美国白蛾除了致死率明显低于BtYJ2菌以外，未被毒死的白蛾幼虫活动较为旺盛，经常蠕动。空白对照的美国白蛾幼虫进食正常排粪正常。BtYJ2菌杀虫活性测试结果(图4)显示美国白蛾被毒死后形态上与活着的美国白蛾没有显著区别。
表1杀虫活性测试结果
| 种类 | 培育时间 | 8h致死率 | 24h致死率 |
| BtYJ2菌株 | 48h | 80％ | 100％ |
| Ly30菌株 | 48h | 66.7％ | 100％ |
| 空白对照 | 48h | 0％ | 0％ |
为了检验美国白蛾幼虫是否是BtYJ2菌的伴胞晶体杀死，需要对其进行表面消毒体内筛菌。首先用75％的酒精对被毒死的美国白蛾进行表面消毒30s彻底杀死体表残留的BtYJ2菌，然后用无菌水洗净表面的酒精。之后将其置于研钵中研磨。采用常规平板划线结合平板稀释法对目标菌株进行菌株分离。然后对分离出的菌株进行测序，测序结果与BtYJ2菌的序列相一致则能证明BtYJ2菌的杀虫活性。
按照筛选虫体内细菌的方法从死虫体内筛出了数个不同菌落，其中一个菌落的菌落形态和2号菌的菌落形态一致，将其分离纯化并培养72h后进行显微镜下观察，结果显示其拥有的伴胞晶体和BtYJ2菌的一致，呈球形或菱形。
从死虫中分离出的菌体，扩增其16SrDNA后，进行测序，测序结果与BtYJ2菌进行BLAST比对，比对结果显示美国白蛾幼虫体内筛出的菌序列与BtYJ2菌一致，同源性达100％，可以证明对美国白蛾食用了带BtYJ2菌的叶子后，BtYJ2菌进入体内起到了致死作用。
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌BtYJ2及其应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 1
cgagcgaatg gattaagagc ttgctcttat gaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60
tgggtaacct gcccataaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggataac 120
attttgaact gcatggttcg aaattgaaag gcggcttcgg ctgtcactta tggatggacc 180
cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg 420
gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct 540
taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tgggagactt 600
gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gaaaacccta 960
gagatagggc ttctccttcg ggagcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccatc 1080
attaagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag 1200
agctgcaaga ccgcgaggtg gagctaatct cataaaaccg ttctcagttc ggattgtagg 1260
ctgcaactcg cctacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtggg gtaacctttt 1400
Claims (4)
1.一株杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌，其分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)BtYJ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018801，保藏日期为2018年11月19日，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2在杀美国白蛾中的应用。
3.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2的培养物在杀美国白蛾中的应用。
4.权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌BtYJ2在制备杀美国白蛾制剂中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN201910047784.6A CN109517766A (zh) | 2019-01-17 | 2019-01-17 | 一种杀美国白蛾的苏云金芽孢杆菌BtYJ2及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN103160450A (zh) * | 2011-12-15 | 2013-06-19 | 河北农业大学 | 一株广谱高效的苏云金芽孢杆菌新菌株及其菌剂和应用 |
-
2019
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Non-Patent Citations (2)
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| 赵焕丽等: "对美国白蛾高毒力苏云金杆菌菌株的筛选", 《河北农业大学学报》 * |
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