CN103159742B

CN103159742B - 5-氯嘧啶类化合物及其作为egfr酪氨酸激酶抑制剂的应用

Info

Publication number: CN103159742B
Application number: CN201110425602.8A
Authority: CN
Inventors: 张波; 李功; 马涛; 辛宝娟; 张烜; 王鹏; 文圣焕
Original assignee: Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN103159742A

Abstract

本发明公开了表皮生长因子受体EGFR酪氨酸激酶抑制剂，其结构式如式(I)所示。本发明还公开式(I)所示任一种化合物及其药学可接受的盐的用途，本发明还提供治疗一种药物组合物，包含式(I)所示化合物和EGFR调节剂。

Description

5-氯嘧啶类化合物及其作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及EGFR酪氨酸激酶抑制剂及其应用。

背景技术

癌症，又称恶性肿瘤，已经成为严重危害人类生命与健康的第二大疾病。据统计，全球66亿人口中，每年新发肿瘤病人约1000万，约500多万人死于癌症，而且这样的数字还在呈现不断增加的趋势。我国***《中国癌症预防与控制规划纲要(2004-2010)》规定，肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、***和鼻咽癌等8种癌症合计占癌症死因的80％以上，是我国今后将重点防治的主要癌症。

研究发现，大多数肿瘤的发生、发展中均有蛋白酪氨酸激酶(PTK)信号通路过度活化的现象。通过抑制酪氨酸激酶活性达到抑制肿瘤细胞过度增殖而进行的药物设计，酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的出现，成为抗癌领域里程碑式的进展。尤其靶向表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶的研究，在过去的几十年中取得了长足的进展。

EGFR信号转导途径在肿瘤细胞的增殖、损伤修复、侵袭及新生血管形成等方面起重要作用。EGFR是一种跨膜受体，EGF结合于胞外结构域，受体发生二聚化并激活胞内酪氨酸激酶结构域，引发激酶自身磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在内的多种细胞功能。依据药物作用在EGFR的不同位置，主要形成了两种策略，一种是作用于胞外区，主要是单克隆抗体类药物；另一种是作用于胞内催化区域，干扰ATP结合从而阻止功能性蛋白进行磷酸化的小分子抑制剂。

肺癌是致死率非常高的一类恶性肿瘤，组织学上将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，后者包括腺癌，鳞状细胞癌和大细胞癌等，占肺癌总数的80-85％，约65％该类患者在确诊该病时已属于晚期(IIIB/IV)，此时，癌细胞已侵犯重要脏器或发生转移，已无法采取手术治疗，只能考虑化疗，放疗或中药保守治疗，当前的一线化疗以含有铂类药物的两药化疗方案为主，但缓解率不到30％，即使添加使用贝伐单抗(血管表皮生长因子抗体)，总存活中位数仍不到12个月。尽管多西他赛和培美曲塞已经被用作晚期NSCLC的二线治疗，但是往往预后不良。

近年来，分子靶向治疗已经成为肿瘤治疗的新手段，它具有高效、特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常组织和细胞损伤小的特点。在对肺癌的分子分型的深入了解中，对EGFR突变的NSCLC连续三项大规模随机对照临床研究：IPASS、WJTOG3405和NEJ002，确认了在EGFR突变的NSCLC患者中一线使用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼的疗效优于传统的含铂两药化疗方案。EGFR-TKI吉非替尼和厄洛替尼已经被批准用作一线铂类化疗失败的NSCLC患者，在晚期EGFR突变型NSCLC的治疗中发挥着重要作用。人们从吉非替尼和厄洛替尼的临床试验中观察到，它们仅对EGFR突变型NSCLC的人群治疗敏感(Paez et al Scinece 2004；Lynch et al.NEJM 2004；Pao et al.PNAS 2004)，该突变超过90％为外显子19缺失(E19del)和外显子21的L858R突变，这样的病例常见于亚洲、不吸烟、女性患者，腺癌尤其是支气管肺泡癌及分化程度高的NSCLC的EGFR突变率高(Shigematsu et al.JNCI 2005)。

研究表明，约75％的EGFR突变型患者对EGFR-TKI敏感，其余不敏感的突变，如外显子20的***突变，在5％的NSCLC病例中被观察到。另外，在使用吉非替尼或厄洛替尼治疗EGFR-TKI敏感型的NSCLC，6-12月后均出现继发性耐药，其中约50％包含由外显子20编码的T790M突变(Kosakaet al.CCR 2006；Balak et al.CCR2006 and Engelman et al.Science)，其它突变(如D761Y，L747S，T845A)只占不到5％；另外，还有约20％包含MET肿瘤基因扩增导致的耐药，而且，其中一半也并存着T790M突变。以上研究表明，T790M突变是对EGFR-TKIs耐药的主要原因(Kobayashi et al.N.Engl.J.Med)。另外，研究发现，NSCLC中含KRAS突变(占15-25％)，BRAF突变(占2-3％)或ALK突变(占5％)对EGFR-TKI也不敏感。

L858R-T790M双突变的EGFR对比L858R单突变的EGFR，对ATP具有更高的亲和力，即T790M突变减弱了吉非替尼和厄洛替尼等ATP竞争性抑制剂的效能(Yun CH et al.PNAS)，那么耐药性的出现也得到了解释。为了克服因T90M突变导致EGFR对ATP的结合能力恢复所引起的突变，正在开发非ATP竞争性的不可逆抑制剂，称为第二代EGFR-TKI，这一类在研的化合物有HKI-272，BIBW2992，PF-00299804等，它们可以与EGFR的ATP结合口袋处的Cys797形成共价键，在体内和体外实验中均显示出强于吉非替尼和厄洛替尼的抗T790M突变作用。但是临床试验表明，随即产生的放大或高表达T790M突变将导致对这些不可逆抑制剂的耐药；另一方面，由于受限于药物代谢动力学性质，它们在临床上很难达到可以抑制T790M突变所需的浓度。WZ4002是2009年报道的一种采用苯胺基嘧啶为母核的新型EGFR不可逆抑制剂(Wenjun Zhou et al.Nature)，也称为第三代EGFR-TKI。在体内和体外实验中，其对EGFR双突变E19del-T790M及L858R-T790M的抑制强于对单独的药物敏感突变(E19del或L858R)及野生型EGFR，故因抑制非肿瘤组织中野生型EGFR而产生皮疹和腹泻等毒副作用会大大降低。另一种针对耐药性的策略是合用靶向其它信号通路的抑制剂，如联合使用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂依维莫司，此外，多种合用给药方案已经开始准备进行临床试验。

发明内容

本发明发现了一类EGFR突变选择性的不可逆抑制剂，体外实验表明其在纳摩尔浓度下可抑制L858R-T790M双突变细胞株H1975的增殖；同时，对EGFR敏感性突变细胞株HCC827(Del E746_A750)也有很高的抑制强度，而对野生型EGFR细胞株A431的抑制则相对较弱。因此，此类结构不但可用于EGFR敏感型突变癌症的治疗，还适用于目前EGFR-TKI治疗中产生继发性耐药的病例；同时，其突变选择性大大减小了因抑制野生型EGFR而产生的毒副作用，是第一代EGFR-TKI的理想替代物。

本发明的一个目的是提供一类EGFR突变选择性的不可逆抑制剂，为式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药：

其中，X选自于O，NR₈或缺失；

m选自于1或2；

n选自于1，2或3；

A环和B环独立地选自于C_5-8芳基或杂芳基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基，8-14元稠环，且可以不被取代或者被一个或多个硝基，卤素，氰基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代；

R₁选自于氢，N(R₄)(R₅)，N(R₄)CO(R₅)，N(R₄)SO₂(R₅)，N(R₄)SO(R₅)，C(O)OR₄，C(O)N(R₄)(R₅)，SO₂R₄，SOR₄，SR₄，SO₂NR₄R₅，OR₄，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基，C_5-8芳基，C_5-8杂芳基，C_3-8杂环烷基-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-SO₂-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C_1-6烷基-C_5-8芳基，杂芳基或C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-C_5-8芳基或杂芳基，C_3-8杂环烷基-CO-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C(O)N-C_1-6烷基或C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-CO₂-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-CO-C_3-8环烷基或杂环烷基，以上各基团可以不被取代或者被一个或多个卤素，氰基，氨基，C_1-6烷基取代的胺基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代；

R₂选自于

R₃选自于氢，C_1-6烷基，CO-C_1-6烷基，CO-C_2-6烯基，CO-C_2-6炔基，卤素取代的C_1-6烷基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基

R₄和R₅独立地选自于氢，C_1-6烷基，C_2-6烯基，C_2-6炔基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基，C_5-8芳基或杂芳基，C_1-6烷基-C_3-8杂环烷基，C_1-6烷基-C_5-8芳基或杂芳基，C_3-8杂环烷基-C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-C_5-8芳基或杂芳基。其中，R₄和R₅亦可连接形成5-8元杂环烷基，环上可以不被取代或者被一个或多个卤素，氰基，胺基，C_1-6烷基取代的胺基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代；

R₆和R₇独立地选自于氢，卤素，C_1-6烷基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基，C_5-8芳基或杂芳基，亦可连接形成C_3-8杂环烷基或环烷基；

R₈选自于氢，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基。

作为优选，本发明提供的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中化合物选自于式(II)：

其中A环和B环独立地选自于六元芳(杂)环，且可以不被取代或者被一个或多个硝基，卤素，氰基，C_1-6烷基，C_1-6烷氧基所取代；

R₁选自于氢，N(R₄)(R₅)，C(O)N(R₄)(R₅)，C_3-8杂环烷基-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-SO₂-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C_1-6烷基-C_5-8芳基，杂芳基或C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-C_5-8芳基或杂芳基，C_3-8杂环烷基-CO-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-C(O)N-C_1-6烷基或C_3-8杂环烷基，C_3-8杂环烷基-CO₂-C_1-6烷基，C_3-8杂环烷基-CO-C_3-8环烷基或杂环烷基，以上各基团可以不被取代或者被一个或多个卤素，氰基，氨基，C_1-6烷基取代的胺基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代；

R₂选自于

R₃选自于氢，甲基；

R₄和R₅独立地选自于氢，C_1-6烷基-C_3-8杂环烷基，R₄和R₅亦可连接形成5-8元杂环烷基，环上可以不被取代或者被一个或多个卤素，氰基，胺基，C_1-6烷基取代的胺基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代。

更优选的，所述化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中化合物选自式(III)

X选自于O，NH或缺失；

m选自于1或2；

n选自于1或2；当且仅当m为1时，n选自1，2或3；

k选自于1，2或3；

j选自于0，1或2；

R₉选自C_1-6烷基，C_3-8环烷基，C_3-8杂环烷基，C_5-8芳基或杂芳基，CO-C_1-6烷基，CO-C_3-8环烷基，SO₂-C_1-6烷基，C_1-6烷基-C_5-8芳基或杂芳基，CONH-C_1-6烷基，CONH-C_3-8环烷基，COO-C_1-6烷基，COO-C_3-8环烷基。

在本发明的具体实施例中，提供的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述化合物结构式选自：

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

4-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-N-(1-基基哌嗪-4-基)苯甲酰胺

1-(3-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(4-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)吡咯-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)吡咯-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)吡咯-1-基)丙-2-烯-1-酮

7-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁烷-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-4，5-二氢-1H-苯并[b]氮杂卓-2(3H)-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(3，4-二甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-吗啉苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-硫吗啉苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)哌啶-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基-1，4-二氮卓-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(3-氟-4-(4-甲基哌啶-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-(2-(二甲胺)乙基)哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(2-(4-(4-乙酰哌嗪-1-基)苯胺基)-5-氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(2-(4-(4-苄基哌嗪-1-基)苯胺基)-5-氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-苯基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(2，6-二甲基吗啉基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(哌啶-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-(环丙甲酰基)哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(3，5-二甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基胺基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙胺基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

4-(4-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)苯基)-N-乙基哌嗪-1-氨甲酰

6-(4-(3-(丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-3，4-二氢萘-1(2H)-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基胺基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)-N，N-二甲基氮杂环丁-1-氨甲酰

(E)-1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丁-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)-3-甲基丁-2-烯-1-酮

叔丁基4-(4-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)苯基哌嗪-1-甲酸酯

1-(3-(3-(2-(3-溴苯胺基)-5-氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

细胞生长抑制实验显示，本发明中部分实施例化合物对EGFR突变型细胞表现出较强的抑制活性，而对EGFR野生型细胞表现出较弱抑制活性，因此对EGFR突变株细胞具有较好的选择性；细胞毒性实验中对Hs-27人皮肤成纤维细胞有极弱的抑制作用，故表现出较低的细胞毒性；EGFR激酶抑制实验表明，对比野生型EGFR，部分实施例对突变型EGFR激酶具有更高的抑制选择性；在肝微粒体中的稳定性研究显示，本发明的化合物表现出良好的微粒体稳定性。例如实施例2和实施例19的化合物在孵育60分钟后的剩余百分比在50％以上；本发明中的部分实施例化合物对各种CYP酶均只有微弱的抑制或无抑制，其半数抑制浓度均高于或接近20μM。同时本发明的化合物表现出良好的生物利用度。

本发明还提供药用组合物，包括上述任一项所述化合物或药学可接受的盐、溶剂化物或前药以及药学可接受的载体。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药在制备调控EGFR酪氨酸激酶活性的药物中的用途或在制备治疗EGFR相关疾病的药物的用途，作为优选，所述EGFR相关疾病为癌症，糖尿病，免疫***疾病，神经退行性疾病或心血管疾病。

作为优选，所述癌症为非小细胞肺癌、头颈癌，乳腺癌，肾癌，胰腺癌，子***，食道癌，胰腺癌，***癌，膀胱癌，结肠直肠癌，卵巢癌，胃癌，脑恶性肿瘤包括成胶质细胞瘤等，或它们的任何组合。

本发明还提供上述任一化合物或其可药用盐、溶剂化物或前药在制备治疗EGFR异常表达的疾病或在使用EGFR调节剂治疗期间具有获得性耐药性的疾病中的用途。

所述获得性耐药性是由EGFR外显子20编码的T790突变引起的耐药性，如T790M。

在本发明中，EGFR调节剂是指靶向EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼，厄洛替尼，埃克替尼，拉帕替尼。

本发明还提供一种药用组合物，包括上述任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药和选自：吉非替尼，厄洛替尼，埃克替尼，拉帕替尼，XL647，NVP-AEE-788，ARRY-334543，EKB-569，BIBW2992，HKI272，BMS-690514，CI-1033，凡德他尼，PF00299804，WZ4002，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，帕尼突单抗，马妥珠单抗，尼妥珠单抗，扎鲁木单抗，帕妥珠单抗，MDX-214，CDX-110，IMC-11F8，Zemab，Her2疫苗PX 1041和HSP90抑制剂，CNF2024，坦螺旋霉素，阿螺旋霉素，IPI-504，SNX-5422和NVP-AUY922的一种或多种的组合，用于治疗EGFR异常表达的疾病，如癌症，糖尿病，免疫***疾病，神经退行性疾病或心血管疾病。

用作治疗用途的式一化合物通常会以药物组合物的形式给药。

一方面，本发明提供作为药物的式(I)化合物或其药学可接受的盐。另一方面，本发明还提供药物组合物，其包括式(I)化合物，药学可接受的盐与药学上可接受的载体。

通常，本发明化合物或其药学可接受的盐可以与一种或多种药用载体形成适合的剂型施用。这些剂型适用于口服、直肠给药、局部给药、口内给药以及其他非胃肠道施用(例如，皮下、肌肉、静脉等)。例如，适合口服给药的剂型包括胶囊、片剂、颗粒剂以及糖浆等。这些制剂中包含的本发明的化合物可以是固体粉末或颗粒；水性或非水性液体中的溶液或是混悬液；油包水或水包油的乳剂等。上述剂型可由活性化合物与一种或多种载体或辅料经由通用的药剂学方法制成。上述的载体需要与活性化合物或其他辅料兼容。对于固体制剂，常用的无毒载体包括但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、葡萄糖、蔗糖等。用于液体制剂的载体包括水、生理盐水、葡萄糖水溶液、乙二醇和聚乙二醇等。活性化合物可与上述载体形成溶液或是混悬液。

具体的给药方式和剂型取决于化合物本身的理化性质以及所应用疾病的严重程度等。

本发明的化合物在某些疾病中可以与其他药物联合应用，以达到预期的治疗效果。一个联合应用的例子是用来治疗晚期NSCLC。例如，本发明式(I)所示化合物可以与mTOR抑制剂联用(例如雷帕霉素)；与Met抑制剂(包括Met抗体MetMAb和Met小分子抑制剂PF02341066)联用；与IGF1R抑制剂联用(例如OSI-906)；与热休克蛋白抑制剂联用等。

一方面，本发明的化合物或剂型适用于恒温动物；在另一方面，本发明的化合物和剂型适用于哺乳动物，比如人类。

本发明的组合物以符合医学实践规范的方式配制，定量和给药。给予化合物的“有效量”由要治疗的具体病症、治疗的个体、病症的起因、药物的靶点以及给药方式等因素决定。通常，一般经胃肠道外给药的剂量是1-100mg/kg。口服给药的剂型可以含有1-500mg/kg本发明的化合物。

术语定义：

“烷基”作为基团或是其他基团的一部分，例如卤素取代的烷基、羟基取代的烷基，可以是直链的或是支链的。例如，C1-6烷基表示1到6个碳的烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基。

“烷氧基”是指烷基与氧原子连结后的生成基团，包括但不限于甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基等。

“卤素”是指氟，氯，溴和碘。特别优选的是氟和氯。

“芳基”是指包含六到十个碳原子的单环或稠合的芳环(例如苯基和萘基)。

“杂芳基”是指任何稠合或非稠合的芳环***，其中至少一个环是含有1-4个选自氮、氧和硫的杂原子的五到八元环，优选至少一个杂原子选自氮。杂芳基包括但不限于噻吩基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、恶唑基、异恶唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、吲哚基等。

“环烷基”是指包含指定数目的碳原子的饱和的或部分不饱和的单环、稠环或桥环。例如，C3-8环烷基是指三到八个碳的环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

“杂环烷基”是指本发明中所定义的环烷基，其中一个或多个环上的碳原子被氧、氮、-NR-、硫、羰基、-S(O)-或-S(O)2等基团取代；杂环烷基包括但不限于吗啉基、哌嗪基、哌啶基、硫代吗啉基等。

“药学上可接受的盐”包括药学可接受的酸加成盐和药学可接受的碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指能够保留游离碱的生物有效性而无其他副作用的，与无机酸或有机酸所形成的盐。无机酸盐包括但不限于盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐包括但不限于甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙醇酸盐、葡糖酸盐、乳酸盐、草酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐和水杨酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。

药学可接受的碱加成盐，包括但不限于无机碱的盐如钠盐，钾盐，钙盐和镁盐等。包括但不限于有机碱的盐，比如铵盐，三乙胺盐，赖氨酸盐，精氨酸盐等。这些盐可通过本专业已知的方法制备。

抑制剂：是指能够和受体结合(比如EGFR)，并且抑制该受体发挥生理作用的化合物。

药用组合：是指一种组合，包含至少一种本发明所述的化合物以及至少一种的药学可接受的辅料或载体。药用组合可由本专业已知的方法制备。

治疗有效剂量：是指能够在动物或人类体内产生生理或药理作用的活性化合物或药用组合的量。有效剂量产生的效果通常包括预防疾病的发生，抑制疾病的进展或是缓解疾病的症状。有效剂量通常由研究者，医生或其他医疗人员来决定。

某些式(I)化合物可以存在多于一种晶型，本发明包括各种晶型及其混合物。

本发明中提及的“溶剂化物”是指本发明的化合物与溶剂形成的配合物。它们或者在溶剂中反应或者从溶剂中沉淀析出或者结晶出来。例如，一个与水形成的配合物称为“水合物”。式(I)化合物的溶剂化物属于本发明范围之内。

本发明式(I)所示的化合物可以含有一个或多个手性中心，并以不同的光学活性形式存在。当化合物含有一个手性中心时，化合物包含对映异构体。本发明包括这两种异构体和异构体的混合物，如外消旋混合物。对映异构体可以通过本专业已知的方法拆分，例如结晶以及手性色谱等方法。当式一化合物含有多于一个手性中心时，可以存在非对映异构体。本发明包括拆分过的光学纯的特定异构体以及非对映异构体的混合物。非对映异构体可由本专业已知方法拆分，比如结晶以及制备色谱。

本发明包括上述化合物的前药。前药包括已知的氨基保护基和羧基保护基，在生理条件下被水解或经由酶反应释放得到母体化合物。具体的前药制备方法可参照(Saulnier，M.G.；Frennesson，D.B.；Deshpande，M.S.；Hansel，S.B and Vysa，D.M.Bioorg.Med.Chem Lett.1994，4，1985-1990.Greenwald，R.B.；Choe，Y.H.；Conover，C.D.；Shum，K.；Wu，D.；Royzen，M.J.Med.Chem.2000，43，475.)。

具体实施方式

本发明公开了一类化合物以及化合物的制备方法、药物组成和治疗方案，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明阐述了一类化合物，它们对依赖EGFR过表达的癌症，具有治疗功效。此外，这些化合物的制备方法、药物组成和治疗方案也有阐述。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

制备路线

本发明中的化合物可以通过多种合成操作容易地制备，这些操作是所属领域技术人员当熟练掌握的。这些化合物的特定制备方法包括(但不限于)下文所述的流程。

流程1

嘧啶2位的氯以胺取代，需在一定温度下，使用合适的催化剂及适当的溶剂才能进行。使用酸催化，催化剂可以是但不限于TFA或对甲苯磺酸。使用Buchwald-Hartwig胺化法，所用的钯催化剂可以是但不限于Pd₂(dba)₃，所用的配体可以是但不限于BINAP，所用的碱可以是但不限于叔丁醇钾。

流程2

嘧啶4位以芳胺取代的衍生物与氮杂环烷基酮类进行氨化还原反应，所用的还原试剂可以是但不限于醋酸硼氢化钠，使用时需用冰浴控温。进一步的烷基化，可选相应的卤代烃，酰氯等作为原料，前提是保证R₂上无敏感基团参与反应。

流程3

该硝基化合物转化为相应的胺基化合物可在酸性条件下，用金属(可以是但不限于铁粉，锌粉)进行还原。

流程4

以2，4，5-三氯嘧啶为起始原料，可以在其4位以不同的条件引入多种官能团。酚和芳胺可以在缚酸剂(可以是但不限于DIEA)存在下，于醇中实现转化。酚类在室温下即可顺利完成反应，而芳胺的引入一般需要在一定温度下进行。嘧啶4位以芳环直接取代，可采用Suzuki偶联反应条件，与相应的苯硼酸进行偶联，催化剂可以是但不限于四(三苯基膦)钯。

流程5

对该类化合物的硝基进行还原，可通过催化氢化法实现。

流程6

对硝基卤苯与环仲胺，在适当温度(加热或微波)、溶剂条件下，进行取代反应。可供选择的方法还有Buchwald-Hartwig胺化法。

流程7

Boc保护的氮杂环烷基酮类在酸性条件下脱除Boc，形成盐酸盐，在碱性条件下，可以与相应的酰氯缩合成酰胺，该转化需要在合适的溶剂中完成。

实施例1、化合物的制备

1：3-(2，5-二氯嘧啶-4-基氧基)苯胺

将2，4，5-三氯嘧啶(3.67g，20mmol)，间羟基硝基苯(2.78g，20mmol)及二异丙基乙基胺(7mL，40mmol)分别加入到30mL无水乙醇中。室温下搅拌，体系逐渐变浑浊，可见大量米白色沉淀析出，2小时后，薄层色谱监测显示原料已基本完全转化。减压抽滤，滤饼用正己烷洗涤两次，晾干后得到5.32g(93％)米白色固体。

将此白色固体全部溶解于30mL四氢呋喃中，加入锌粉(6g，93mmol)，水(8mL)和氯化铵(5g，93mmol)加热回流5小时，薄层色谱监测显示无原料点，放冷，过滤除去过量的锌粉等固体残渣，滤液减压浓缩除有机溶剂后加50mL乙酸乙酯溶解，以饱和食盐水洗涤两次，分出有机层，用无水硫酸钠干燥后，浓缩，减压柱色谱纯化(正己烷/乙酸乙酯＝6/1)的白色固体产物4.0g(84.2％)。MS(m/z)256.1(M+1)。

2：1-丙烯酰基氮杂环丁-3-酮

将1-叔丁氧羰基氮杂环丁-3-酮(3.66g，21.4mmol)溶解于20mL二氧六环中，缓慢通入氯化氢气体2小时，过滤得白色固体，用少量正己烷洗涤，晾干后得白色固体2.07g(90.2％)。

将此白色固体(1g，9.3mmol)溶解于四氢呋喃(15mL)和水(10ml)的混合溶液中，缓慢加入碳酸氢钠(1.72g，20.5mmol)。冰浴下，30分钟内滴加丙烯酰氯(756μL，9.3mmol)的四氢呋喃溶液(20mL)。冰浴。反应5h后，减压蒸出有机溶剂，加乙酸乙酯稀释，以少量食盐水洗涤后，有机层用无水硫酸钠干燥后，浓缩得黄色油状产物1.1g(94.5％)，该纯度可直接用于下一步反应。

3：1-(3-(3-(2，5-二氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

将3-(2，5-二氯嘧啶-4-基氧基)苯胺(2.25g，8.8mmol)，1-丙烯酰基氮杂环丁-3-酮和无水硫酸钠(6.24g，44.0mmol)溶解于15mL乙酸中，冰水浴控温下缓慢加入醋酸硼氢化钠(2.05g，9.7mmol)，保持温度10℃以下，反应过夜。减压蒸出大部分乙酸后，体系加水15mL稀释，以饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH为7左右，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机相，以无水硫酸钠干燥，浓缩后常压柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝50/1)得白色固体2.68g(83.8％)。MS(m/z)365.2(M+1)，387.1(M+23)。

4：4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺

将对氯硝基苯(20g，127mmol)与甲基哌嗪(25.4g，254mmol)混合，搅拌使固体全部溶解后，于90℃下反应4小时后，将反应液倾入约200mL冰水中，析出大量黄色固体，抽滤，滤饼用水洗涤，晾干后得黄色固体27.9g(99.3％)。

该黄色固体(100mg，0.45mmol)溶解于甲醇(15mL)中，加入10％钯碳(10mg)，在氢气气氛下反应2小时，底物基本完全转化，过滤除去钯碳，滤液蒸干浓缩得黄色液体89mg(100％)。MS(m/z)192.0(M+1)。

5：1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

将1-(3-(3-(2，5-二氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮(170mg，0.465mmol)，4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(89mg，0.465mmol)，加入到2-丁醇(15mL)中，加入三氟乙酸(104μL，1.395mmol)后回流20小时。体系用饱和碳酸氢钠中和至中性后，加水稀释，以乙酸乙酯萃取(2×15mL)，合并有机相后，以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，浓缩，经常压柱色谱初步纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)后以高效液相色谱纯化，得白色固体42.77mg(17.7％)。¹HNMR 300MHz(CDCl₃)δ8.15(s，1H)，7.28-7.32(m，1H)，7.16(d，J＝8.7Hz，2H)，6.70(d，J＝8.7Hz，2H)，6.57(dd，J＝1.5Hz，J＝14.1Hz，1H)，6.62(d，J＝8.1Hz，1H)，6.31(d，J＝17.1Hz，1H)，6.15(s，1H)，6.10(dd，J＝14.1Hz，J＝10.2Hz，1H)，5.68(dd，J＝1.5Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.45(t，J＝8.1Hz，J＝15.9Hz，1H)，4.31-4.36(m，1H)，4.17-4.20(m，1H)，3.73-3.83(m，2H)，3.59-3.61(m，2H)，3.40-3.41(m，4H)，3.07-3.09(m，2H)，2.88(s，3H).MS(m/z)：520.3(M+1)。

实施例2、化合物的制备

1：4-胺基-N-(1-甲基哌啶-4-基)苯甲酰胺

将1-甲基哌啶-4-胺(228mg，2mmol)，对硝基苯甲酸(335mg，2mmol)和二异丙基乙基胺(1.04mL，6mmol)溶解于N，N-二甲基乙酰胺(10mL)中，另将HATU(1.14g，3.0mml)溶解于N，N-二甲基乙酰胺(10mL)后，加入到上述反应液中，室温下反应3小时。减压蒸出N，N-二甲基乙酰胺，加入饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)，过滤除去不溶物，水相用2N盐酸中和后以二氯甲烷萃取，有机相用和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，常压柱色谱纯化得浅黄色固体500mg(95.0％)。

将上述得到的浅黄色固体(500mg)溶解于甲醇(25mL)中，加入10％钯碳(50mg)，在氢气气氛下反应2小时，底物基本完全转化，过滤除去钯碳，滤液蒸干浓缩得黄色液体440mg(99.3％)。MS(m/z)234.0(M+1)。

2：4-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-N-(1-基基哌嗪-4-基)苯甲酰胺

将1-(3-(3-(2，5-二氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮(186mg，0.51mmol)，4-胺基-N-(1-甲基哌啶-4-基)苯甲酰胺(120mg，0.51mmol)，加入到2-丁醇(15mL)中，加入三氟乙酸(76μL，1.02mmol)后回流20小时。体系用饱和碳酸氢钠中和至中性后，加水稀释，以乙酸乙酯萃取(2×15mL)，合并有机相后，以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，浓缩，经常压柱色谱初步纯化(二氯甲烷/甲醇＝15/1)后以高效液相色谱纯化，得白色固体10.4mg(3.6％)。¹HNMR 300MHz(CDCl₃)δ8.43(s，1H)，8.25(s，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H)，7.32(m，2H)，6.71(d，J＝6.6Hz，1H)，6.67(d，J＝7.8Hz，1H)，6.59(dd，J＝1.8Hz，J＝17.1Hz，1H)，6.28(s，1H)，6.25(m，1H)，6.09(dd，J＝10.2Hz，J＝17.1Hz，1H)，5.67(dd，J＝1.8Hz，J＝10.2Hz，1H)，4.46-4.52(m，1H)，4.35-4.38(m，1H)，4.23-4.25(m，2H)，3.83-3.90(m，2H)，3.62(d，J＝11.2Hz，2H)，2.84-2.85(m，2H)，2.83(s，3H)，2.29-2.33(m，2H)，2.16-2.21(m，2H).MS(m/z)：562.5(M+1).

实施例3、细胞生长抑制实验

1.材料与方法

细胞生长培养基：RPMI1640(Gibco，22400089)加10％FBS(Gibco，10099141)

检测试剂盒：CCK-8检测试剂(DojinDo，CK04-20)

细胞系：A431(EGFR WT，中科院上海细胞库)，NCI-H1975(EGFRL858R/T790M，中科院上海细胞库)，HCC827(EGFR Del E746_A750，

韩国韩美药品)，Hs-27(人皮肤成纤维细胞，韩国韩美药品)

TECANIF200酶标仪

Invitrogen Countess细胞计数仪(C10227)

2.细胞接种

用0.25％胰酶消化对数生长期的细胞。用含10％FBS的RPMI1640培养基配成单细胞悬液。Invitrogen Countess进行细胞计数。A431，NCI-H1975，HCC827及Hs-27均以5000细胞/孔/100uL接种于96孔板(实验板和对照板)。空白对照组加入100uL培养基。将培养板放于培养箱内，37℃，5％CO₂培养过夜。

3.对照板细胞生长测定

自培养箱内取出对照板，弃去孔内培养基，加入含10％CCK-8的新鲜培养基，100uL/孔。加完后，将96孔板放回培养箱内，继续培养1-4h，直至呈现明显的橙红色。450nm测定光吸收值，即为药物处理前OD值。

4.药物处理

每个待测样品从10uM开始，10倍稀释，设置6个药物浓度，每个浓度做复孔测试。对于A431，NCI-1975，HCC827细胞系，用含0.1％胎牛血清的培养基梯度稀释待测样品，并使其为终浓度的2倍。对于Hs-27细胞，用含10％胎牛血清的培养基稀释为终浓度的2倍。取出实验板加入含2倍待测药物终浓度的培养基，100uL/孔取出实验板，弃去孔内培养基，加入新鲜含0.1％胎牛血清的培养基100uL/孔；再加入含2倍待测药物终浓度的培养基，100uL/孔。将96孔板放回培养箱，37℃，5％CO₂作用72小时。对照组加入不含药物的培养基。

5.显色及GI₅₀的计算

72小时作用完毕后，自培养箱内取出96孔板，弃去孔内培养基，加入含10％CCK-8的新鲜培养基，100uL/孔。加完后，将96孔板放回培养箱内，继续培养1-4h(与对照板显色时间一致)。450nm测定光吸收。细胞生长率％＝[(给药组OD值-实验板空白对照OD值)-(药物处理前OD值-对照板空白对照OD值)]/[(对照组OD值-实验板空白对照组OD值)-(药物处理前OD值-对照板空白对照OD值)]×100。用origin8进行logistic拟合，计算对应样品的GI₅₀值，GI₅₀越低说明药物对细胞的生长抑制越明显。

#表中GI₅₀值所处的区间由星号的数目表示：1nM≤GI₅₀≤10nM：****(活性非常强)；10nM＜GI₅₀≤100nM：***(活性较强)；100nM＜GI₅₀≤1000nM：**(活性中等)；1000nM＜GI₅₀≤10000nM：*(活性较弱)。

按照上述的实验方法进行细胞毒性实验，考察本发明实施例的化合物对正常人皮肤成纤维细胞Hs-27的生长抑制作用。其中，部分实施例化合物表现出较低的细胞毒性，例如实施例1、实施例2和实施例19的化合物，它们对Hs-27细胞的GI₅₀分别为1032、1584和1992nM。

实施例4、激酶抑制测试

激酶抑制测试采用下表所示浓度：

^#Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，同一种酶与不同底物反应Km值也不同。Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。

1.用双蒸水对化合物进行系列稀释为终浓度的4倍。

2.制备测试所需溶液(1X RB：40mM Tris，7.5；20mM MgCl₂；0.1mg/mlBSA；2mM MnCl₂，50μM DTT)。

3.对照组所加成分：

CK-：10uL ddH₂O+5uL 4X R.B.(EGFR)+ATP&S(EGFR)

CK+：5uL ddH₂O+10uL 2X EGFR(WT)in 2X R.B.+ATP&S(EGFR)

4.加入用双蒸水稀释为终浓度4倍的化合物5uL/孔。

5.2X EGFR(WT/T790M/T790M&L858R/L858R)in 2X R.B.，10uL/孔，混匀后在室温下孵育10分钟。

6.4X ATP+S.in 1X ddH₂O，5uL/，室温下分别孵育60分钟(WT，T790M)和120min(T790M/L858R，L858R)

7.加入ADP-Glo试剂，20uL/孔，混匀后，室温下孵育40分钟。

8.加入激酶检测试剂，40uL/孔，混匀后室温下孵育40分钟。

9.测荧光酶值。

按照以上实验方法，本发明中部分化合物显示出较好的EGFR突变选择性抑制效果。

表中IC₅₀值越小，表示相对抑制能力越强。

实施例5、化合物在肝微粒体中的稳定性研究

1.待测化合物溶解在乙腈中，制成浓度为0.5mM的储备液。

2.2μL储备液加入1.5mL离心管中，然后加入148μL磷酸缓冲液(100mM，pH7.4)和10μL肝微粒体(蛋白浓度为20mg/mL)悬液；对照组加入158μL磷酸缓冲液(100mM，pH 7.4)。

3.步骤2中制备好的混合体系，于37℃水浴中预孵3分钟，然后加入40μLNADPH发生体系(含有NADP⁺：6.5mM，Glucose-6-phosphate：16.5mM，MgCl₂：16.5mM，Glucose-6-phosphate dehydrogenase：2U/mL)启动反应，并于37℃水浴中孵育1小时。

4.反应进行1小时后，将离心管从水浴中取出，并加入400μL乙腈终止反应，然后涡旋震荡3分钟，最后离心(13000rpm，4℃)5分钟，取上清液用HPLC检测剩余药物浓度Cr。

5.平行制备的0分钟反应样品制备方法：步骤2中制备好的混合体系，于37℃水浴中预孵3分钟后取出，加入400μL乙腈，然后加入40μL NADPH发生体系。斡旋震荡3分钟后，离心(13000rpm，4℃)5分钟，取上清液用HPLC检测药物浓度C0。

6.经60分钟孵育后，药物在孵育体系中的剩余百分比按照下式计算：

药物剩余(％)＝Cr÷C0×100％

按照上述的实验方法，本发明中的部分实施例化合物表现出良好的微粒体稳定性。例如实施例2和实施例19的化合物在孵育60分钟后的剩余百分比(％，依次在人/大鼠/狗/小鼠的肝微粒体酶中)分别为：76.24/84.67/48.33/67.67和79.2/87.55/62.54/61.82。

实施例6、评价化合物对CYP酶抑制作用

方法：本实验使用BD Gentest公司的CYP Inhibitor Screening Kit试剂盒完成。所有实验操作按照试剂盒内的产品使用指导进行。实验步骤如下：

1.去离子水和缓冲盐水浴中预热至37℃。

2.制备NADPH发生***。

3.黑色96孔板的第一列，加入步骤2配制的NADPH发生***144μL。

4.按照试剂盒的使用指导，配制cofactor-ACN溶液。

5.96孔板的第二列至第十二列，加入100μL步骤4中配制的cofactor-ACN。

6.6uL阳性抑制剂、待测化合物加到各自检测组的第一孔。使用排枪吹打混合后，50μL系列稀释至第八列。第八列经吹打混合后，取出50μL溶液丢弃。

7.将96孔板用封板膜封好，37℃孵育10min。

8.按照试剂盒的使用指导配制酶-底物混合物。

9.步骤7中孵育10min的96孔板，第一列至第十列每孔加入100μL酶-底物混合物(加入速度稍快，以保证充分混合溶液)。

10.再次盖好封板膜，按照试剂盒的使用指导37℃孵育一定时间(不同的CYP亚型孵育时间不同)。

11.孵育之后的96孔板，每孔加入75μL反应终止液。

12.96孔板的第十一列和第十二列，加入100μL酶-底物混合物。

13.按照试剂盒的使用指导，用酶标仪检测每孔的荧光强度，并计算IC₅₀。

按照上述的实验方法，本发明中的部分实施例化合物对各种CYP酶均只有微弱的抑制或无抑制。例如实施例2和实施例19的化合物对各种CYP亚型(1A2，2D6，2C9，2C19，3A4)的半数抑制浓度均高于或接近20μM。

实施例7、化合物在大鼠体内的药物代谢动力学研究

1.雄性SD大鼠买入后，在本实验室适应性饲养7天。

2.6只SD大鼠随机分为2组，每组3只，一组用于灌胃给药，另一组用于尾静脉注射给药。灌胃给药组的大鼠，给药前需过夜禁食。

3.大鼠给药后，采用眼眶静脉丛采血的方法在以下时间点采集血样：0min(给药前)，5min，15min，30min，1h，2h，3h，5h，7h，24h。每个采血时间点采血量约为300μL。

4.采集的血样在4℃以12000rpm的转速离心5min，然后采集上层血浆样品，并于-20℃冰箱中保存待测。

5.实验操作总结见下表：

6.使用本实验室的LC-MS/MS检测血浆中的化合物浓度。

7.使用本实验室的药代动力学专业软件WinNonlin计算药代动力学参数。

按照上述的实验方法，本发明的化合物表现出良好的生物利用度，如实施例1的化合物表现出5.7％的生物利用度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，X选自于O，NR₈或缺失；

m选自于1或2；

n选自于1，2或3；

A环选自于六元芳环或8-14元稠环，且六元芳环可以不被取代或者被一个或多个卤素，C_1-6烷氧基所取代，B环选自于六元芳环；

R₁选自于氢，N(R₄)(R₅)，C(O)N(R₄)(R₅)；

R₂选自于

R₃选自于氢；

R₄和R₅独立地选自于氢，C_1-6烷基-C_3-8杂环烷基，其中，R₄和R₅亦可连接形成5-8元杂环烷基，环上可以不被取代或者被一个或多个卤素，氰基，胺基，C_1-6烷基取代的胺基，C_1-6烷基，卤素取代的C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤素取代的C_1-6烷氧基所取代；

R₆和R₇独立地选自于氢，C_1-6烷基；

R₈选自于氢。

2.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐，其中化合物选自于式(Ⅱ)：

其中A环和B环独立地选自于六元芳环；

R₁选自于氢，N(R₄)(R₅)，C(O)N(R₄)(R₅)；

R₂选自于

R₃选自于氢；

3.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物结构式选自：

7-(4-(3-(1-丙烯酰基氮杂环丁烷-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-4,5-二氢-1H-苯并[b]氮杂卓-2(3H)-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(3,4-二甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基-1,4-二氮卓-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(2,6-二甲基吗啉基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(3,5-二甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮

6-(4-(3-(丙烯酰基氮杂环丁-3-基胺基)苯氧基)-5-氯嘧啶-2-基胺基)-3,4-二氢萘-1(2H)-酮

3-(3-(5-氯-2-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)-N,N-二甲基氮杂环丁-1-氨甲酰

1-(3-(3-(2-(3-溴苯胺基)-5-氯嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮。

4.1-(3-(3-(5-氯-2-(4-(4-(2-(二甲胺)乙基)哌嗪-1-基)苯胺基)嘧啶-4-基氧基)苯胺基)氮杂环丁-1-基)丙-2-烯-1-酮。

5.药用组合物，包括权利要求1-4任一项所述化合物或药学可接受的盐以及药学可接受的载体。

6.权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备调控EGFR酪氨酸激酶活性的药物中的用途。

7.权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗EGFR相关疾病的药物的用途。

8.权利要求7所述的用途，其特征在于，所述EGFR相关疾病为EGFR异常表达的疾病。

9.权利要求8所述的用途，其特征在于，所述EGFR异常表达的疾病为癌症，糖尿病，免疫***疾病，神经退行性疾病或心血管疾病。

10.权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症为非小细胞肺癌、头颈癌，乳腺癌，肾癌，胰腺癌，子***，食道癌，胰腺癌，***癌，膀胱癌，结肠直肠癌，卵巢癌，胃癌，成胶质细胞瘤，或它们的任何组合。

11.权利要求7所述的用途，其特征在于，所述EGFR相关疾病还包括使用EGFR调节剂治疗期间具有获得性耐药性的疾病。

12.权利要求11所述的用途，其特征在于，所述获得性耐药性是由或包括EGFR外显子20编码的T790突变所引起的。

13.权利要求12所述的用途，其特征在于，所述EGFR外显子20编码的T790突变为T790M。

14.权利要求11所述的用途，其特征在于，所述EGFR调节剂为靶向EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂。

15.权利要求14所述的用途，其特征在于，所述靶向EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂为自吉非替尼，厄洛替尼，埃克替尼，拉帕替尼。

16.一种药用组合物，包括权利要求1-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和选自：吉非替尼，厄洛替尼，埃克替尼，拉帕替尼，XL647，NVP-AEE-788，ARRY-334543，EKB-569，BIBW2992，HKI272，BMS-690514，CI-1033，凡德他尼，PF00299804，WZ4002，西妥昔单抗，曲妥珠单抗，帕尼突单抗，马妥珠单抗，尼妥珠单抗，扎鲁木单抗，帕妥珠单抗，MDX-214，CDX-110，IMC-11F8，Zemab，Her2疫苗PX 1041和HSP90抑制剂，CNF2024，坦螺旋霉素，阿螺旋霉素，IPI-504，SNX-5422和NVP-AUY922的一种或多种的组合。