CN103142677A - 一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法。其步骤为：取忍冬叶原料适量，加水浸泡后煮提2-3次，合并滤液并浓缩，盐酸调pH值1-4，离心，取上清液过14-90目聚酰胺，分别用水和30%-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，得到含量在50%以上的酚酸类提取物。本发明的方法，具有良好的可重复性，提取物中酚酸类化合物含量稳定，并且操作简便、成本低廉、适合工业化生产。本发明所得到的产品可按常规方法制成临床常用的胶囊剂、片剂、冲剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、滴丸剂、口服液体制剂、皮下给药制剂或栓剂等剂型或它们的缓释形式。

Description

一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法

  

技术领域

本发明涉及一种提取酚酸类化合物的方法，更具体地说是一种采用聚酰胺吸附技术，提高忍冬叶提取物中酚酸类化合物含量的方法，属于医药技术领域。 

背景技术

忍冬叶为常用中药金银花同一植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的传统废弃部分。金银花为38种常用中药之一，具有较强的抗菌、抗病毒作用，广泛应用于传统和现代中成药名方和大量临床处方中。在忍冬种植过程中，为保证花蕾的生长，需多次修剪整形而废弃大量的忍冬叶（为同一植物金银花产量的10倍），资源浪费巨大。忍冬叶与金银花的主要有效成份均为酚酸类化合物，相同单位重量忍冬叶有机酸含量为金银花的70%，具有相当高的应用开发研究价值，但至目前国内外尚未发现以忍冬叶为药材制成中成药制剂的先例。研究证实，忍冬叶提取成分的抗病毒和抗菌药效优于金银花提取物。研究结果也表明，忍冬叶纯化产物对金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌和肺炎链球菌的抗菌活性高于金银花纯化产物，MBC值相差1-2个倍比稀释度，其可能原因是忍冬叶与金银花酚酸类化学成分的含量组成存在的差异。根据资料，金银花主要含绿原酸（Chlorogenicacid），忍冬叶的主要有效成分为异绿原酸（二咖啡酰基奎宁酸，Dicaffeoylquinic acids），其中4,5-二咖啡酰基奎宁酸（4,5－Dicaffeoyl quinic acid）含量较高。 

近年来，国内多家单位曾对忍冬叶成分进行了提取方法的研究，包括水提法、醇提法、微波辅助提取法、酶法和大孔树脂吸附法等（中国林副特产，2002,1:38-39；四川食品与发酵，2006,130:52-57；陕西中医，2008,6:734-735；江西农业大学学报，2008,1:137）；根据资料和重复验证试验，以上资料提供方法提取忍冬叶有效成分（主要是酚酸类成分）纯度较低，多在20-30%以下。公开号为101269107A的中国专利申请和《中成药》2007年第7期（附6-7）公开了采用D101大孔树脂提取忍冬叶绿原酸成分的研究结果；根据报告，采用本方法制备的忍冬叶提取物中绿原酸含量可达50%以上；但该方法存在实验条件较难控制、重复性较差的缺欠。公开号为CN1398845A的中国专利公开了大孔树脂吸附提高绿原酸含量的工艺方法；该工艺方法针对从金银花中提取绿原酸的工艺落后情况，对金银花中绿原酸成分的提取工艺方法进行了优化，提取金银花成分中绿原酸含量达到了80%以上；但是，由于金银花（主要含绿原酸）和忍冬叶中（主要有效成分为异绿原酸）酚酸类化合物的组成和含量存在明显差异，采用公开号为CN1398845A的中国专利提供的方法在忍冬叶酚酸类成分的提取中达不到类似效果；并且，该专利工艺方法中采用甲醇为大孔吸附树脂中异绿原酸的洗脱液，由于其可能导致的提取物中的甲醇残留及其环境污染，该工艺不适合在工业化生产中使用。 

发明内容

    本发明的目的是提供一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法，以提高忍冬叶提取物中酚酸类化合物含量，克服了现有技术的缺点。 

本发明的方法包括以下步骤： 

（1）忍冬叶切段或粉碎后加水浸泡0.5-1.5h，煮提2-3次，每次加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水，在80-100℃条件下提取50-100min，合并提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用；

（2）在所得上清液中加入盐酸调整PH值为1-4，离心分离，上清液用聚酰胺吸附后，用纯化水洗至中性，再用质量浓度为30%-95%的乙醇解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥，即得所需产品。

本发明中，步骤（1）所述的提取方法还可以采用水温浸法或乙醇回流法或乙醇温浸法或超声提取法等方法提取忍冬叶中酚酸类化合物。 

其中，水温浸提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加水加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水，在40-80℃条件下浸泡2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用。 

其中，乙醇回流提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的60%-80%乙醇回流提取2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用。 

其中，乙醇温浸提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的70%-95%乙醇，于50-70℃浸泡2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得清液备用。 

其中，超声提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水超声提取3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用。 

本发明的方法，步骤（2）中，吸附忍冬叶提取物中酚酸类化合物所用聚酰胺的粒度为14-90目，用量与药材质量比值为0.5-1:1。 

本发明的方法，步骤（2）中，吸附忍冬叶提取物的聚酰胺吸附后以1.0-3.0BV（BV-柱床体积，全文同）的水冲洗，然后加5.0BV（柱床体积）的质量浓度为30%-95%的乙醇洗脱。 

本发明所得到的忍冬叶提取物中酚酸类化合物的含量在50%以上。 

    本发明所得到的产品可按常规方法制成临床常用的胶囊剂、片剂、冲剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、滴丸剂、口服液体制剂、皮下给药制剂或栓剂等剂型或它们的缓释形式。 

本发明取得的有益效果在于： 

1、本发明方法提取的忍冬叶提取物中物中酚酸类化合物含量较高，在50%以上。

2、本发明工艺方法简便、条件可控，具有良好的可重复性。 

3、本发明适合忍冬叶中酚酸类化合物的提取，工艺方法无环境污染和提取物甲醇残留缺点，有利于环境保护和用药安全。 

4、按本发明的方法从忍冬叶中提取的酚酸类化合物的主要药效学试验结论为：忍冬叶提取的酚酸类化合物对金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌和肺炎链球菌的抗菌活性优于相同方法提取以及酚酸类化合物含量相同或相近的金银花提取物，最小杀菌浓度（MBC值）相差1-2个倍比稀释度。详见实施例5。 

具体实施方式

以下实施例仅代表本发明的说明性实施方案，但本发明不受这些实施例的限制。 

实施例1 

忍冬叶干燥药材切段或粉碎后加水浸泡0.5h，煮提2次，每次加入忍冬叶原料质量的15倍的水，在100℃条件下提取75min，合并上述2次提取液，60℃减压或常压浓缩至4倍药材量，离心分离，得上清液，加入盐酸调整PH值为1，离心分离，上清液上聚酰胺柱，以2.0BV/h吸附，用1BV纯化水以3.0BV/h流速洗至中性，再用浓度为30%的乙醇以2.0BV/h流速解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥至干，即得。产品经检验，总酚酸含量为51.92%，收率1.61%。

总酚酸含量的检测方法：采用HPLC方法，Discovery C₁₈分析色谱柱，水-甲酸(100 : 0.5)和乙腈为流动相，流量1.0 ml/min，采用梯度程序，328 nm波长检测峰面积。25min之前的峰以绿原酸为对照，25min之后的峰以4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为对照，计算酚酸类化合物的含量。 

收率（%）=出膏率×总酚酸含量。 

出膏率（%）=（制备终产品质量 / 提取用药材（忍冬叶）质量）×100%。 

实施例2 

忍冬叶干燥药材切段或粉碎后加水浸泡0.5h，煮提2次，每次加入忍冬叶原料质量的15倍的水，在100℃条件下提取75min，合并上述2次提取液，60℃减压或常压浓缩至5倍药材量，离心分离，得上清液，加入盐酸调整PH值为1，离心分离，上清液上聚酰胺柱，以2.0BV/h吸附，用2BV纯化水以3.0BV/h流速洗至中性，再用浓度为50%的乙醇以2.0BV/h流速解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥至干，即得。产品同实施例1方法检验，总酚酸含量为52.53%，收率1.68%。

实施例3 

忍冬叶干燥药材切段或粉碎后加水浸泡0.5h，煮提2次，每次加入忍冬叶原料质量的15倍的水，在100℃条件下提取75min，合并上述2次提取液，60℃减压或常压浓缩至6倍药材量，离心分离，得上清液，加入盐酸调整PH值为1，离心分离，上清液上聚酰胺柱，以2.0BV/h吸附，用3BV纯化水以3.0BV/h流速洗至中性，再用浓度为95%的乙醇以2.0BV/h流速解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥至干，即得。产品同实施例1方法检验，总酚酸含量为52.74%，收率1.71%。

实施例4 

本实施例为对比实例，即采用水提、大孔树脂吸附纯化忍冬叶中酚酸类化合物。具体过程如下：

  （1）忍冬叶干燥药材50g，切段或粉碎后加水浸泡0.5h，煮提2次，每次加入忍冬叶原料质量的15倍的水，在100℃条件下提取75min，合并上述2次提取液，60℃减压或常压浓缩至5倍药材量，离心分离，得上清液，加入盐酸调整PH值为1，离心分离，制备忍冬叶提取物样品液。

  （2）试验比较了非极性的SP-700、HPD-700、X-5、D101，弱极性的AB-8和极性的NKA-9等6种适合酚酸类化合物和黄酮类化合物分离的大孔吸附树脂。分别称取6种型号大孔吸附树脂各50g，按乙醇浸泡、醇洗、酸洗、碱洗程序进行预处理，将样品液分别加入以上处理后的大孔树脂吸附，吸附速度2.0BV/h，用2BV纯化水以3.0BV/h流速洗至中性，再用浓度为95%的乙醇以2.0BV/h流速解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥，即得到纯化产品。     

    按实施例1方法计算提取物酚酸类化合物的含量和收率结果如下：

试验结果，SP-700型大孔树脂对忍冬叶中酚酸类化合物的吸附能力明显高于其他类型的树脂，收率2.30%，产物酚酸类化合物含量为25.79%，但SP-700型大孔树脂对酚酸类化合物的选择性不高，而且为进口树脂，价格较高，不适于工业化生产。选择对忍冬叶中酚酸类化合物吸附能力仅次于SP-700型大孔树脂的AB-8型大孔树脂（收率1.20%，产物酚酸类化合物含量为25.75%）进行纯化工艺的进一步试验。

  （3）试验考察了AB-8型大孔树脂的泄漏曲线、上样浓度、样品液PH值、吸附流速、洗脱用水流速、乙醇洗脱剂浓度、洗脱剂用量、洗脱速度，优化AB-8型大孔吸附树脂纯化忍冬叶总酚酸工艺如下： 

提取液浓缩至料液比为1:5，调pH为2，以流速为3.0BV/h的流速通过AB-8大孔吸附树脂，加2BV水以3.0BV/h的流速冲洗树脂，然后加5BV的50%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩收膏。按实施例1方法计算提取物酚酸类化合物的含量。试验结果，以上工艺纯化忍冬叶提取物收率平均约为2.0%，总酚酸含量稳定在27.12%-28.17%（平均27.47%），未达到50%以上。

实施例5 

    本实施例为按本发明方法提取的忍冬叶及其同一植物不同药用部位金银花中的酚酸类化合物的主要抗菌药效试验结果比较。

  1、实验材料 

  （1）受试药物

    提取物1（粗提物）：忍冬叶水煎煮提取，含量12.1%，原液50mg/ml（总酚酸6.05mg/ml）；

提取物2（纯化物）：忍冬叶粗提物经聚酰胺树脂吸附纯化，含量51.92%，原液50mg/ml（总酚酸26mg/ml）；

提取物3（粗提物）：金银花水煎煮提取，含量11.1%，原液50mg/ml（总酚酸5.56mg/ml）；

提取物4（纯化物）：金银花粗提物经聚酰胺树脂吸附纯化，含量50.39%，原液50mg/ml（总酚酸25.1mg/ml）。

  （2）试验菌株 

    2、实验方法

  （1）试验菌液的配制：用10%FCS-营养肉汤培养基分别对肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌37°С18小时增菌培养，试验菌液用相同培养基1:10稀释而成。其它细菌分别用营养肉汤培养基37°С18小时增菌培养，相同培养基1:100稀释为试验菌液。

  （2）最小杀菌浓度（MBC）的测定：忍冬叶、金银花提取物分别50mg/ml（原料）为起始浓度，用培养基倍比稀释其至10个浓度。其中，肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌稀释时选择营养肉汤培养基（含10%FCS），其它细菌实验用普通营养肉汤培养基稀释。在24孔培养板中，每孔加入1ml稀释药液，每个稀释度药液设2个复孔，分别加入实验菌液50μl，恒温培养箱18小时37°С培养，用肉眼和显微镜观察有无细菌生长。 

以上观察无细菌生长的培养物，取50ul在普通琼脂平板培养基上接种，其中，肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌接种于血琼脂平板培养基。18小时37°С培养，计数菌落的个数。 

    以菌落数少于5个（2平板平均值）的药物最高稀释度为药物对细菌的最小杀菌浓度（MBC）。 

    3、实验结果（MBC值，其中药物浓度：mg/ml） 

    4、结果分析

  （1）金银花和忍冬叶提取物的细菌敏感性比较：

    金银花和忍冬叶提取物对细菌的敏感性相近，排序如下：

    痢疾志贺氏菌＞金黄色葡萄球菌＞乙型溶血性链球菌＞伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌＞肺炎链球菌。

  （2）金银花、忍冬叶粗提物与纯化产物的抗菌活性比较： 

金银花和忍冬叶纯化产物抗菌活性（MBC值）的滴度（稀释倍数）表现均高于粗提物，提示纯化产物临床有效剂量优于（低于）粗提物。

    金银花和忍冬叶纯化产物以总酚酸计算的MBC值与粗提物比较无明显优势，提示金银花和忍冬叶中尚有除总酚酸外的其他成分（如黄酮等）也在粗提物中发挥抗菌作用。 

  （3）金银花和忍冬叶提取物的抗菌活性比较： 

忍冬叶纯化产物对所试除伤寒沙门氏菌外的其他5个菌种的杀菌活性（稀释倍数、原药浓度和总酚酸浓度的MBC值）均优于金银花纯化产物，其中稀释倍数高1-4个滴度。分析原因与金银花和忍冬叶中酚酸类成分和含量比例不同有关。其中金银花主要含绿原酸，忍冬叶主要含异绿原酸，并且异绿原酸是忍冬植物不同部位提取物的主要抗菌成分。

本发明优选的实施例中，忍冬叶药材采自河北省巨鹿县，经河北师范大学生命科学学院赵建成教授鉴定为忍冬科（Capriroliaceae）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥叶片；对照品绿原酸（批号110753-200413，纯度> 99.3%）和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号3245-88-0，纯度> 99.0%）由中国中国药品生物制品检定所提供；聚酰胺为浙江台州市路桥四甲生化塑料厂产品；HPLC用流动相乙腈和甲醇均为色谱纯试剂，为天津市康科德科技有限公司产品；高效液相色谱仪（600-2489型）为Waters产品。 

Claims (4)

1.一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）忍冬叶切段或粉碎后加水浸泡0.5-1.5h，煮提2-3次，每次加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水，在80-100℃条件下提取50-100min，合并提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用；

（2）在所得上清液中加入盐酸调整PH值为1-4，离心分离，上清液用聚酰胺吸附后，用纯化水洗至中性，再用质量浓度为30%-95%的乙醇解吸附，收集解析液，回收乙醇并浓缩，最后减压或常压干燥，即得所需产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）提取时采用水温浸法或乙醇回流法或乙醇温浸法或超声提取法；

其中，水温浸提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加水加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水，在40-80℃条件下浸泡2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用;

乙醇回流提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的60%-80%乙醇回流提取2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用;

乙醇温浸提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的质量浓度70%-95%乙醇，于50-70℃浸泡2-3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得清液备用;

超声提取方法为：忍冬叶切段或粉碎后加入忍冬叶原料质量的10-20倍的水超声提取3次，每次0.5-1.5h，合并上述几次提取液，50-70℃减压或常压浓缩至4-6倍药材质量，离心分离，得上清液备用。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：吸附忍冬叶提取物中酚酸类化合物所用聚酰胺的粒度为14-90目，用量与药材质量比值为0.5-1:1。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：聚酰胺吸附后以1.0-3.0倍柱床体积的水冲洗，然后加5.0倍柱床体积的质量浓度30%-95%的乙醇洗脱。