CN103103236A - 一种制备麦白霉素的新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种以生米卡链霉菌发酵制备麦白霉素的方法。所述方法包括：采用新的发酵基配方发酵生米卡链霉菌，提高麦迪霉素A1和吉他霉素A6的含量，发酵完成后，利用萃取和反萃取的方法，采用新的混合萃取剂进行萃取，提高萃取率，经自动结晶后析出麦白霉素；本发明采用新的发酵基配方生产麦白霉素，简化麦白霉素提取工艺；具有操作简单方便、节能、等特点，采用本发明所生产出的麦白霉素符合中国药典2010版的相关要求，可适用于工业化大生产。

Description

一种制备麦白霉素的新工艺

一、技术领域

本发明属于微生物发酵新技术领域，特别涉及一种微生物生产麦白霉素的方法。

二、背景技术

麦白霉素属于大环内酯类多组分抗生素，有效成分主要为麦迪霉素A1和吉他霉素A6两个组分，根据中国药典2005版要求麦白霉素中麦迪霉素A1的组分不得低于35.0％，中国要求2010版将其要求提高到麦白霉素中麦迪霉素A1的组分不得低于48％，吉他霉素A6的组分不得低于12％。为此，给麦白霉素生产企业带来了新的要求。

麦白霉素系生米卡链霉菌在代谢过程中产生的16元环内酯抗生素，是临床上常用的一种广谱抗菌药，主要用于耐青霉素的葡萄球菌、链球菌和肺炎杆菌等感染的治疗。抗菌性能与红霉素相似，对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、肺炎链球菌、百日咳杆菌、支原体等有抗菌作用。口服吸收后，广泛分布于各器官中，以肝、肺、脾中较高，胆汁中有很高浓度，尿中浓度很低，不能透过正常脑膜。可作为红霉素的替代品，应用于敏感菌所致的口咽部、呼吸道、皮肤和软组织，胆道等部位感染。据估计现临床使用量在20亿元人民币左右。

现阶段，麦白霉素原料的生产主要采用微生物发酵法，但工业化生产工艺相对国外还比较落后，主要表现为：菌株发酵浓度低、发酵、提取工艺成本高、有机溶剂回收工艺复杂、能耗高、易造成环境污染等，难以满足制剂开发的需要。针对上述不足，本发明以生米卡链霉菌为出发菌株，采用籼米粉水解液替代原有的发酵工艺中的碳源，增加发酵浓度，同时选用多烷基醇和烃类混合物替代现有的提取溶剂，降低了麦白霉素的提取成本和溶剂使用量，增加了麦白霉素产品总收率，生物效价高于中国药典2010版要求。本发明解决了现行生产工艺产率低、生产成本高、环境污染严重等缺点，更加适合工业化生产。

三、发明内容

本发明提供一种新颖的麦白霉素制备方式，其中包括新的麦白霉素发酵培养基和简洁的麦白霉素提取方式。

通过研究发现，利用生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)发酵生产麦迪霉素A1，A2，A3，A4，吉他霉素A6等，其中麦迪霉素A1和吉他霉素A6为麦白霉素的主要有效物，本发明根据麦迪霉素A1和吉他霉素A6的合成原理，改变常用的发酵碳源，提高麦迪霉素A1和吉他霉素A6的含量，同时，通过改变萃取溶液和萃取方法得到高提取率的麦白霉素。

在本发明中，利用籼米粉水解液作为碳源，提高了菌丝生长速度，以及麦迪霉素A1和吉他霉素A6的单位发酵量；发酵结束后采用萃取和反萃取的方法，提高了有效物质的提取率。

四、具体实施方式

下面结合实例对本发明技术方案进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。实例中所描述的方法，一般本行业技术人员均能读懂。

实施例1

种子培养

培养基：籼米粉水解液13％，蔗糖1％，蛋白胨0.2％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，其余为蒸馏水。

①斜面种子培养

用接种针取保藏的菌株接种于斜面培养基上，于28℃下培养7d。

②一级种子培养液

250mL的摇瓶内加入50mL的种子培养基，灭菌冷却后接一环生长良好的斜面培养物，于28℃下，200r/min培养48h。

③二级种子培养液

5L的摇瓶内加入3L的种子培养基，灭菌冷却后接入60mL一级种子培养液，于28℃下，200r/min培养48h。

④三级种子培养液

15L的摇瓶内加入9L的种子培养基，灭菌冷却后接入2.7L二级种子培养液，于28℃下，200r/min培养48h。

发酵培养

发酵培养基：籼米粉水解液13％，硫酸铵0.1％，磷酸二氢钾0.1％，碳酸钙0.05％，其余为蒸馏水。

50L全自动发酵罐内加入25L发酵培养基和适量的消泡剂，0.1MPa下灭菌30min，冷却至28℃，接入8.0L三级种子培养液，通气量为0.8-1.0V/V/min，搅拌速度为500-700r/min，发酵温度为28℃，发酵48h后，离心获得麦白霉素发酵液。

麦白霉素的提取

①萃取

在萃取罐内加入定量的麦白霉素发酵液，用20％的NaOH溶解调节pH值至8.0-9.0，再加入2倍体积的异辛醇和异辛烷(V/V＝4∶1)的萃取溶液，升温至35-40℃振荡30min，使之充分混匀，静置分层，收集有机溶液部分，获得麦白霉素的萃取液。

②反萃取

在反萃取罐内加入定量的麦白霉素萃取液，后加入2倍体积的盐酸溶液(pH＝1.2-1.5)，常温下振荡30min，使之充分混匀，静置分层，去有机溶液层，收集获得麦白霉素反萃取液。

③制备

取定量麦白霉素反萃取液，加入碱液静置过夜进行结晶，后抽滤获得麦白霉素结晶，干燥后获得麦白霉素成品，麦白霉素的总收率为67％，麦白霉素的生物效价为1100u/mL。

根据中国药典2010版检测，麦迪霉素A1含量为49％，吉他霉素A6含量为13％。

实施例2

种子培养同实例1

发酵培养

发酵培养基：籼米粉水解液15％，硫酸铵0.3％，磷酸二氢钾0.1％，碳酸钙0.08％，其余为蒸馏水。

100L全自动发酵罐内加入50L发酵培养基和适量的消泡剂，0.1MPa下灭菌30min，冷却至28℃，接入16.0L三级种子培养液，通气量为1.1-1.2V/V/min，搅拌速度为500-700r/min，发酵温度为28℃，发酵72h后，离心获得麦白霉素发酵液。

麦白霉素的提取

①萃取

在萃取罐内加入定量的麦白霉素发酵液，用碳酸氢钠饱和溶液调节pH值至8.0-9.0，再加入1.5倍体积的异丙醇和丙烷(V/V＝5∶1)的萃取溶液，升温至35-40℃振荡30min，使之充分混匀，静置分层，收集有机溶液部分，获得麦白霉素的萃取液。

②反萃取

在反萃取罐内加入定量的麦白霉素萃取液，后加入1.8倍体积的盐酸溶液(pH＝1.2-1.5)，常温下振荡30min，使之充分混匀，静置分层，去有机溶液层，收集获得麦白霉素反萃取液。

③制备

取定量麦白霉素反萃取液，加入碱液静置过夜进行结晶，后抽滤获得麦白霉素结晶，干燥后获得麦白霉素成品，麦白霉素的总收率为66％，麦白霉素的生物效价为1050u/mL。

根据中国药典2010版检测，麦迪霉素A1含量为50％，吉他霉素A6含量为12％。

实施例3

种子培养同实例1

发酵培养

发酵培养基：籼米粉水解液17％，硫酸铵0.5％，磷酸二氢钾0.7％，碳酸钙0.2％，其余为蒸馏水。

100L全自动发酵罐内加入50L发酵培养基和适量的消泡剂，0.1MPa下灭菌30min，冷却至28℃，接入16.0L三级种子培养液，通气量为1.0-1.2V/V/min，搅拌速度为500-700r/min，发酵温度为28℃，，离心获得麦白霉素发酵液。

麦白霉素的提取

①萃取

在萃取罐内加入定量的麦白霉素发酵液，用碳酸氢钠饱和溶液调节pH值至8.0-9.0，再加入3倍体积的辛醇和航空煤油(V/V＝5∶2)的萃取溶液，升温至35-40℃振荡30min，使之充分混匀，静置分层，收集有机溶液部分，获得麦白霉素的萃取液。

②反萃取

在反萃取罐内加入定量的麦白霉素萃取液，后加入3倍体积的磷酸溶液(pH＝1.2-1.5)，常温下振荡30min，使之充分混匀，静置分层，去有机溶液层，收集获得麦白霉素反萃取液。

③制备

取定量麦白霉素反萃取液，加入碱液静置过夜进行结晶，后抽滤获得麦白霉素结晶，干燥后获得麦白霉素成品，麦白霉素的总收率为69％，麦白霉素的生物效价为1050u/mL。

根据中国药典2010版检测，麦迪霉素A1含量为49％，吉他霉素A6含量为12％。

Claims (7)

1.一种制备麦白霉素的新工艺，具体包括：将生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)以8％-15％接种至发酵培养基，在含有水溶性较强的氮源和碳源培养基中，在24-28℃、自然pH，转速500-700rpm下培养2-8天，得到麦白霉素发酵液；发酵液经萃取和反萃取后得到麦白霉素，其麦迪霉素A1含量≥49％，吉他霉素A6含量≥12％。

2.如权利要求1所述的生米卡链霉菌在发酵制备麦白霉素的应用中，其特征在于所述的培养基中有效成分含量如下：

其余为蒸馏水。

3.如权利要求1所述的萃取过程包括：发酵完成后，过滤，调节发酵液pH值在7.0-9.0的范围，加入数倍体积的多烷基醇和烃类的萃取溶剂，升温、振荡，收集有机相，得到麦白霉素萃取液。

4.权利要求1所述的反萃取过程包括：在反萃取罐中加入定量的麦白霉素萃取液，加入数倍体积的无机酸溶液，振荡、静置，收取无机相，加入碱液静置过夜结晶，得麦白霉素结晶，干燥后得麦白霉素成品。

5.权利要求3所述的多烷基醇包括：异丙醇、异辛醇、辛醇、异丁醇等。

6.权利要求3所述的烃类包括但不局限于丁烷、异辛烷、航空煤油、苯、甲苯等。

7.权利要求3所述的多烷基醇和烃类所组成的萃取溶剂的体积比为1∶6-4∶1。