CN103097875B - 改进的传感器测量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的方法，其特征在于，所述确定包括在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）的步骤，且还包括在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j），以及另外使所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的数量相互关联。本发明还提供了用于校准光学传感器的方法以及试剂盒和计算机程序产品。

Description

改进的传感器测量方法
本发明的技术领域
本发明涉及光学传感器测量的领域，且特别是涉及确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的方法以及用于光学传感器的校准方法。
背景技术
化学传感器和生物传感器的使用是已被接受的。这样的传感器通常由两个可区别的元件组成。一个元件提供传感器的化学或生物化学选择性；这个元件通常由附到固体表面的选择性层组成。该选择性可通过例如选择性地吸收的基质、螯合剂、抗体、选择性地结合的蛋白质、核酸链或受体来提供。样本中所关注的分析物的确定通常涉及分析物或影响一些其它物种的结合或释放的分析物分别到选择性层的结合或从选择性层的释放。第二元件提供物种分别结合到传感器表面或从传感器表面释放的监测。
一种重要类别的传感器基于结合事件的光学监测；这样的传感器称为光学传感器。光学读出机制可基于在例如吸光度、荧光性或折射率中的变化。许多这样的传感器基于内反射的现象；例如，这样的传感器可基于表面等离子体共振（SPR）、受抑全内反射、光波导、临界角量测折射术、干涉折射法、双偏振干涉测量法和其它方法。下面的讨论主要集中于SPR传感器，但是，正如对于技术人员明显的，本讨论的许多方面通常也适用于其它种类的光学传感器，且特别是基于内反射的传感器。
另外，有两种主要类别的SPR传感器。一种基于对应于在规定的波长处的谐振的特定角度的读出；另一种基于对应于在规定的角度处的谐振的特定波长的读出。也存在混合变体，其中角度和波长都被改变。下面的讨论集中于具有角读出的SPR传感器。此外，为简单起见，本讨论集中于所谓的KretschmannSPR配置，但本讨论也可适用于其它配置，例如Otto配置以及涉及光栅和波导的不同的配置。
SPR传感器的使用是已被接受的（参见例如L.MLechuga，“BiosensorsandModernBiospecificAnalyticalTechniques”中的第五章”OpticalBiosensors”，L.Gorton（ed.），Elsevier，Amsterdam，2005；J.Homola，Chem.Rev.2008，108，462）。通常，不同的物种可被实时地分析，且无需使用贴到分析物的任何标签。灵敏度对许多目的是足够的，且因此是可靠的。但是，也公知SPR传感器在某些应用中的使用是有问题的，且SPR传感器的性能对于一些目的可能是不足够的。例如，SPR传感器的灵敏度是有限的，并可能对小分子的分析是不够的。另一问题可能是当不使用标记时读出的普遍性质；SPR没有用于区分开分析物的结合和任何其它物种的结合的固有机制。特别有问题的是与生物化学起源的样本有关的蛋白质和其它或多或少定义明确的物种的所谓的“非特异性结合”。第三个问题是许多噪声源例如与传感器表面接触的介质的组分的温度变化、机械振动以及虚假变化的影响。作为这些问题的结果，对于SPR传感器，定量分析和传感器校准可能显示不足够的准确度和精密度。
SPR传感器通常用于测量样本介质的折射率，即，复折射率的实部。然而，公知SPR传感器也可用来间接测量吸光度（更正确的术语是消光系数，但是，本文中使用术语“吸光度”，因为它更容易理解），即，复折射率的虚部，因为光吸收影响SPR曲线的形状。另外，传感器表面上的吸附物的厚度可从SPR测量结果中减去。例如H.Kano和S.Kawata（Appl.Opt.1994，33，5166）、S.R.Karlsen等人（Sens.ActuatorsB1995，24-25，747）、Z.Salamon等人（Biochim.Biophys.Acta1997，1331，117）、A.A.kolomenskii等人（Appl.Opt.2000，39，3314）、S.Wang等人（Rev.Sci.Instr.2001，72，3055）以及S.Ekgasit等人（Sens.ActuatorsB2005，105，532）讨论了这三个参数的测量。
SPR传感器也已被应用于监测显色反应，即，伴随有颜色变化的化学反应。一些实例是由Y.Hur等人（Anal.Chim.Acta2002，460，133）报告的银离子探测，以及由P.Uznanski和J.Pecherz（Appl.Pol.Sci.2002，86，1459）报告的氢离子探测。然而，显色反应代表了一种特殊情况，因为化学物种到固体表面的简单的结合通常本身不伴随有颜色变化。
许多尝试已经做出以提高SPR传感器的性能。在US5,573,956中，描述了折射率增强的物种的使用可以如何提高SPR分析法的灵敏度。类似的方法后来由H.Komatsu等人（Sci.Tech.Adv.Mater.2006，7，150）和由M.Nakkach等人（Appl.Opt.2008，47，6177）提出。在US5,641,640中，描述了在一个以上的波长处的折射率的测量如何可以增加灵敏度以及减少一些噪声源。类似的方法后来被O.Esteban等人（Opt.Lett.2006，31，3089）讨论。在JP11118802中，讨论了如何可以通过使用等于标本的吸收波长的波长的光或结合到该标本的色素来确定具有低浓度和低分子量的该标本。在WO02073171中，简要指出了可通过SPR曲线的形状的变化（反射率最小值和浸渍宽度）来测量样本的吸光度。在JP2002090291中，讨论了SPR传感器可如何通过使用包含通过捕获低分子物质改变其光吸收特性的物质的传感层，即，通过使用显色指示剂来探测低分子物质例如离子。在JP2002357536中，指出了光吸收物质可用于以类似于上面提到的US5,573956和US5,641,640的方式增加SPR分析法的灵敏度。另外也以类似于上面提到的WO02073171的方式指出吸收物质可改变SPR曲线的形状。在JP2003215029中，讨论了用于表面等离子体共振和光吸收谱的测量的装置；注意，该装置利用了波长读出，而不是角读出，所以在这种情况下讨论角读出SPR曲线的形状是不切题的。
然而，尽管做了这些尝试，但是仍存在关于SPR传感器的信噪比、噪声水平和校准的问题。在理论上，SPR传感器的最终的噪声水平可取决于传感器***的光学和电子组件的性能（参见例如G.G.Nenninger等人,Meas.Sci.Technol.2002，13，2038；M.Piliarik和J.Homola,Opt.Express2009，17，16505）。然而，在最实际的实验情况下，噪声通过诸如温度波动、非特异性结合和虚假浓度变化的前面提到的因素来确定。以前未认识到，通过评估SPR曲线的一个以上的参数，这样的实际噪声因素可在很大程度上被消除。以前也未认识到，通过评估SPR曲线的一个以上的参数，可以开发用于光学传感器的新的和改进的校准程序。本发明提供了这样的改进的方法和程序。
发明概述
作为本发明的第一方面，提供了确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的方法，其特征在于，所述确定包括以下步骤：
a）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），且还包括
b）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j），且另外
c）使所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的数量相互关联。
因此，在广泛的意义上，本发明基于下面的理念：确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的方法可被改进，如果所述确定包括在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量，且还包括在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量，以及还包括使所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的数量相互关联。本发明还基于下面的见解：如何使用来自与折射率和吸收率相关的被测量或当在不同的波长（或规定的角）处测量时一个这样的被测量的信息，用于校准及减小光学传感器中的噪声以及用于量化结合到传感器的光学探针的数量。本文中公开了总的发明构思的几个方面和配置。
在本发明的实施方式中，所述确定受测量噪声影响，且本方法的步骤c）包括使用所述被测量的值来区别开测量噪声和所述光学探针物种的结合或释放。从不同源发出的测量噪声以及光学探针本身的结合或释放分别将以不同的方式对该组被测量作贡献，且通过分析该组被测量的变化的模式，区别开分别来自噪声和来自光学探针的贡献是可能的。
因此，作为第一方面的备选方案或配置，提供了一种减小光学传感器中的噪声的方法，其包括以下步骤：
a）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与光学探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），且还包括
b）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j），以及另外
c）当确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的所述光学探针物种的数量时，使用来自步骤a）和b）的物理被测量x1i和x2j来减小噪声。
换句话说，或者作为第一方面的另一备选方案或配置，提供了一种用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的方法，所述方法包括使用从与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）以及从与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j）获得的信息。在本上下文中，措辞“光学探针”用来表示结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的物种，且该物种可被该传感器探测，并且具有在至少一个测量波长处的可探测的吸光度。在分析物自身满足这些条件的情况下，它可用作光学探针本身。光学探针还可具有荧光特性。然而，在大多数情况下，光学探针用来以更间接的方式确定分析物的数量或浓度；该分析物可以例如影响光学探针分别到光学表面的结合或从光学表面的释放。实现此的可设想的方式包括但不限于夹心分析法、竞争分析法、抑制分析法或置换分析法。在一些可设想的实施方式中，光学探针可用于化学地标记某些其它物种；例如分析物自身可被标记，与分析物的抵触或相似的物种可被标记，或者某种二级或三级试剂例如二级抗体可被标记。
措辞“噪声”或“测量噪声”应在广泛的意义上被解释。它用来表示对任何被测量的任何贡献，其使光学探针物种的确定不清楚、扰乱或干扰光学探针物种的确定，即，不仅是被测量的短期的随机变化。特别是，该术语用来表示与传感器表面接触的介质的组分的不想要的或不受控的温度变化、虚假变化以及任何其它化学物种分别到传感器表面的不想要的或不受控的结合或从传感器表面的不想要的或不受控的释放。所谓的“非特异性结合”包括在“噪声”的定义中。应理解，几种定义的或未定义的噪声源可同时作贡献。不同的噪声源可以用相似或不相似的方式对该组被测量作贡献。在大多数情况下，来自不同噪声源的贡献可以以相加的方式合计。
光学探针的光学特性由其复折射率描述。更短的术语“折射率”用来表示更严格的术语“复折射率的实部”。术语“消光系数”和“吸光度”用来表示“复折射率的虚部”。复折射率严格地是光学连续光谱的一种特性；当讨论离散的化学物种例如分子的特性时，术语如“摩尔折射率增量”和“吸收率”可被使用，因为它们可被更容易地理解。离散物种的光学连续光谱特性和光学特性之间的区分和关系对技术人员是公知的。
术语“一个波长”用来表示尖锐的波长峰值或窄的波长间隔，例如，其可从发光二极管或激光器或者宽带光源或发射几种波长的光源连同带通滤波器或单色仪获得。
“物理被测量”涉及一种物理特性，例如所研究的***的特性，其被在传感器表面处的光学探针的结合或释放影响，也可以用光学传感器来测量或估计。本发明包括实施方式，其中一个以上的被测量在步骤a）和b）中被确定，即，步骤a）可包括确定与折射率（x11-x1m）相关的一个以上的物理被测量，且步骤b）可包括确定与吸收率（x21-x2n）相关的一个以上的被测量。然后，步骤c）可包括使所有的x11-x1m和x21-x2n与结合到该表面或从该表面释放的所述光学探针物种的数量相互关联。
应理解，在本公开中，“m”指的是被确定的第一物理被测量（x1i）的数量，且“n”指的是被确定的第二物理被测量（x2j）的数量。
因此，根据本发明的任何方面确定的至少一个物理被测量（x1i）和至少一个物理被测量（x2j）可构成一组被测量：{x11,...,x1m;x21，...，x2n}，其中m≥1，n≥1。
此外，如果在步骤a）和b）中在不同的波长处被确定和/或如果被测量与光学探针的折射率和吸收率都相关，则步骤a）和b）的被测量可以是相同的被测量。
术语“与折射率相关的被测量”（及类似术语）不应被过于严格地解释：大多数被测量在较小或较大的程度上受折射率和吸光度的影响。该术语用来表示主要受折射率变化影响且较少受吸光度变化影响的被测量。术语“与吸收率相关的被测量”（及类似术语）以类似的方式被解释。被测量和复折射率之间的完全的定量关系通过光学的基本定律来描述。
从本发明的不同方面和实施方式的有益影响的下面讨论中，本发明的优点将被更好地理解。阐明的实例将主要涉及具有角读出的SPR传感器的使用，但是，如对于技术人员将明显的，本发明不限于这样的传感器。
因此，本发明的第一方面基于下面的见解：当确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量时测量与折射率相关的至少一个被测量和与吸收率相关的至少一个被测量以及使用这些被测量（或从被测量获得的信息）导致了较少受噪声影响的结果。
在第一方面的一个实施方式中，步骤c）中的所述相互关联涉及多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、偏最小二乘法或者任何线性代数或多变量数据分析方法。
这样的计算方法对于使用物理被测量x1i和x2j确定结合到传感器表面或从传感器表面释放的光学探针的数量的目的是非常有用的。作为实例，在步骤c）中，校准数据可以例如借助多元线性回归来评估，或在超定的数据集的情况下，通过主成分分析或偏最小二乘法来评估。例如结合到表面或从表面释放的光学探针的量化可通过例如对线性方程***求解来执行。未知因素可借助于因素分析从数据集中提取。也有对技术人员是已知的线性代数和多变量数据分析的其它方法，其可以根据本发明的方法用于数据评估。
另外，在第一方面的实施方式中，步骤c）包括使用所述被测量的值来区别开测量噪声（N）和所述光学探针物种的结合或释放。
因此，第一方面的所述方法提供了当确定光学探针和传感器表面之间的相互作用时更准确的结果。
作为补充或作为备选方案，步骤c）可包括以下步骤：
c1）使用用于减小光学传感器中的噪声的物理被测量x1i和x2j，以及
c2）确定结合到所述表面或从所述表面释放的所述光学探针物种的数量。
因此，相比于如果步骤a）和b）未被执行，步骤c2）的确定较少受噪声影响。另外，当在本公开中讨论步骤c）时，实施方式可以指上述步骤c1）。
作为实例，步骤c）（或步骤c1））可包括确定该组被测量的至少一个函数f：f({x11,...,x1m;x21,...，x2n})，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加，其中m≥1，n≥1。
技术人员理解如何确定使得信噪比增加的函数。这可以例如通过迭代过程来执行。
另外，这意味着f({x11,...,x1m;x21,...,x2n})可被确定，使得相比于任何x1i或x2j的S/N，{x11,...,x1m;x21,...,x2n})的S/N被增加。
然后，函数f({x11，...,x1m;x21,...，x2n})可以例如通过绘制f({x11，...,x1m;x21,...,x2n})随时间变化的曲线来进一步评估和分析，用于确定光学探针和传感器表面之间的相互作用。因此，相比于任何x1i或x2j随时间变化的曲线，f({x11,...,x1m;x21,...,x2n})随时间变化的曲线较少受噪声影响。这在本公开的实施例中被进一步论证。
作为实例，f可以是线性组合：f＝∑i=1 m(k1ix1i)+∑j=1 n(k2jx2j)。
此外，所述确定可涉及估计f＝∑i=1 m(k1ix1i)+∑j=1 n(k2jx2j)中的至少一个常数k1i或k2j，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。
作为实例，单个被测量x11在步骤a）中被确定，且单个被测量x21在步骤b）中被确定，并且步骤c）的确定涉及估计f(x11,x21)=x11+k*x21中的常数k，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。
在第一方面的实施方式中，测量噪声（N）是由于结合到所述表面或从所述表面释放的至少一种额外的化学物种，且步骤c）包括使用所述被测量的值来区分开所述光学探针物种的结合或释放和所述至少一种额外的化学物种。
本实施方式包括“非特异性结合”的情况。在这个方面中，如在其它方面中的，不排除几个噪声源可能以相似或不相似的方式同时作贡献。作为实例，未着色的蛋白质（例如白蛋白）到表面的非特异性结合主要对与折射率相关的被测量作贡献，且较少对与吸光度相关的被测量作贡献，而光学探针结合将主要对与吸光度相关的被测量作贡献。然而，交叉项（蛋白质对与吸光度相关的被测量的贡献以及光学探针对与折射率相关的被测量的贡献）可能不被完全忽略，且为了获得最高的信噪比，该交叉项也应被考虑。当然，吸收的化学物种的不想要的结合也将主要对与吸光度相关的被测量作贡献，但是，只要对不同被测量的贡献显示与光学探针的模式不同的模式，不同的贡献就可通过数学技术来解决。
作为实例，借助于改变额外的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放，可确定测量噪声（N）。
所述结合或释放可以以受控的方式被改变。
在第一方面的实施方式中，测量噪声（N）是由于温度变化，且步骤c）包括使用所述被测量的值来区分开所述光学探针物种的结合或释放和温度变化噪声。
温度变化主要对与折射率相关的被测量作贡献。例如，水的折射率例如对于每个1°C的温度增加有0.0001个折射率单位的减小。另一方面，温度变化对与吸光度相关的被测量的贡献明显更小，除非与光学探针表面接触的介质是强烈地吸收的。再次，为了最高的信噪比，在任何情况下，交叉项（温度变化对与吸光度相关的被测量的贡献和光学探针对与折射率相关的被测量的贡献）也应被考虑。
作为实例，借助于改变与所述光学传感器表面接触的介质的温度，可确定测量噪声（N）。
所述温度可以以受控的方式被改变。
在第一方面的实施方式中，测量噪声是由于与传感器表面接触的介质的组分的变化，以及步骤c）包括使用所述被测量的值来区分开所述光学探针物种的结合或释放和组分的所述变化。
再次，只要组分的变化是由于未着色的物种，影响就将主要是对与折射率相关的被测量，而着色的物种也将严重影响与吸光度相关的被测量。为了最高的信噪比，在任何情况下，交叉项（组分的变化对与吸光度相关的被测量的贡献和光学探针对与折射率相关的被测量的贡献）也应被考虑。
作为实例，借助于改变与所述光学传感器表面接触的介质的组分，可确定测量噪声（N）。
该组分可以以受控的方式被改变，且所述介质可以是例如缓冲剂。
作为本发明的第二方面，提供了一种用于校准用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的光学传感器的方法，所述确定受测量噪声影响，其中所述校准方法包括：
a）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），和
b）在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j），且另外
c）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量（x1i）或（x2j）中的至少一个的特定贡献。
在本发明的第二方面中使用的术语和定义如结合上文中本发明的第一方面所定义的。
本发明的第二方面基于下面的见解：用于校准用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的光学传感器的方法可被改进，所述确定受测量噪声影响，如果校准方法包括在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）和在单个波长处或在一个以上的波长处确定与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j）。
此处术语“校准”用来表示用于提高分析方法的定量的准确度或精确度的任何程序。校准通常作为在分析步骤本身之前（或之后）的一个单独的实验步骤来执行。在校准步骤期间，光学探针的结合或释放的特定贡献和/或至少一个噪声源对该组被测量的贡献以定量或半定量的方式来确定。在分析步骤期间，如此确定的特定贡献被用来通过数学程序提高准确度或精确度。
在一种简单的情况中，一个且同一被测量例如SPR曲线最小反射率的角位置可在两个不同的波长处被确定。在此实例中，被测量的总数是二，而关于被测量的不同种类的数量是一。
步骤c）的“量化”可与和上述第一方面相关的“相互关联”的步骤类似地执行。这在本公开的实施例例如在实施例1a-1b、2、8和10中进一步说明。
在第二方面的实施方式中，步骤c）的量化涉及多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、偏最小二乘法或者任何线性代数或多变量数据分析方法。
在第二方面的实施方式中，步骤c）包括改变额外的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放，且还包括量化所述额外的化学物种的结合或释放对被测量中的至少一个的特定贡献。
所述结合或释放可以以受控的方式被改变。
通过以这种方式定量地确定例如“非特异性结合”的具体贡献，可通过数学反演在随后的分析步骤中定量地补偿非特异性结合的影响。来自样本的非特异性结合可以例如在没有分析物或光学探针到表面的结合出现的情形下在单独的实验运转中被研究。可能不必在绝对意义上确定来自额外的化学物种的贡献（例如以pg/mm2的每表面浓度折射率单位），而只确定对该组被测量的贡献的模式。如上所述，为了获得最高可能的准确度和精确度，可能必须仔细量化光学探针和额外的物种分别对所有被测量的贡献，即，也考虑交叉项。
在第二方面的实施方式中，步骤c）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的温度，且还包括量化所述温度变化对被测量中的至少一个的特定贡献。
所述温度可以以受控的方式被改变。
改变温度可涉及借助于一些方式将或多或少确切地已知的温度增加（或降低）应用于与传感器表面接触的介质，以及确定该组被测量的变化的模式。然后，该信息可用来在分析步骤中补偿温度噪声。如上所述，可能必须也包括交叉项。
在第二方面的实施方式中，步骤c）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的组分，且还包括量化所述组分的变化对被测量中的至少一个的特定贡献。
所述组分可以以受控的方式被改变。
在一个简单的实验中，与传感器表面接触的介质中的盐或糖浓度可被改变，且对该组被测量的影响的模式可被确定。然后，该信息可用于在随后的分析步骤中补偿组分变化噪声。再次，可能必须还包括交叉项。
在第二方面的实施方式中，所述方法不涉及所述光学探针物种分别结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放。
这是有利的，因为它不需要来自实验的信息，在该实验中，光学探针结合到传感器表面，即，它提供了一种更简单且较不复杂的校准方式。
在这些实施方式中，光学探针物种可以简单地溶解在与传感器表面接触的介质中，且实验可以在没有到表面的结合的条件下被执行。以这种方式，被测量的变化的模式可被确定，且可用于校准的目的。在大多数情况下，假设被测量的变化的模式对于溶解的光学探针与对于表面结合的光学探针一样将是相同的。实际上，一些未受控制的量的结合可能发生，且来自溶解的探针和结合的探针的贡献可被假设以简单的相加方式合计。再次，可能足够的是，确定被测量的变化的模式而不是单独的被测量的变化的绝对值。
在第二方面的实施方式中，所述方法不涉及改变测量噪声。
作为实例，所述方法不涉及以受控的方式改变测量噪声。
这是有利的，因为它仅需要来自传感信号的基线的噪声，以便校准传感器，即，它提供了一种更简单且较不复杂的校准方式。
也可执行校准实验，其中允许噪声以不受控的方式作贡献。来自该不受控的噪声的对该组被测量的影响的模式可被确定并用于校准的目的。校准实验可以或可以不涉及光学探针对该组被测量的贡献的同时确定。不同贡献（分别来自光学探针和来自不同的噪声源）可以例如通过多变量因素分析的方法彼此分开。
在本发明的第一方面和第二方面的实施方式中，光学传感器的传感原理基于内反射。
通常结合化学传感器和生物传感器来使用内反射。内反射的光产生用于探测传感器表面及其目前环境的渐逝波。内反射方法的一个优点是探测光束不需要通过样本溶液，否则这可能导致与光的吸收和散射相关的问题。
在第一方面的实施方式中，光学传感器的传感原理基于光波导折射法，包括但不限于受抑全内反射（共振镜技术）、基于波导的表面等离子体共振和光栅耦合器折射法或干涉折射法，包括但不限于双偏振。
作为结果，光学传感器的传感原理可以基于光波导折射法、受抑全内反射、基于波导的表面等离子体共振、光栅耦合器折射法、干扰折射法或双偏振干涉测量法。
对这些方法所共同的是它们用来探测靠近传感器表面的折射率，该表面的紧邻区域上或中的光的吸光度也将影响测量。
作为另一实例，光学传感器的传感原理可以基于具有角读出的表面等离子体共振（SPR）。这可能是用于生物传感的使用最多的方法。另外，这种方法主要预定用于折射法，但测量也受表面的紧邻区域上或中的光的吸光度的影响。这种影响通常被认为是该方法的缺点，但是，如在本发明的描述中详细说明的，它也可被转变成明显的优点。
作为实例，与所述探针的折射率相关的至少一个被测量（x1i）可以在SPR曲线的最小反射率角度和重心之中选择。
这些被测量是最经常地用于监测SPR传感器中的折射率变化的被测量。也有描述在角域中的SPR曲线的运动的其它可设想的被测量。
另外，与所述探针的吸收率相关的至少一个被测量（x2j）可以在SPR曲线的最小反射率值、宽度、标准偏差、偏斜度和峰度之中选择。
众所周知，SPR曲线的最小反射率和形状与样本的吸光度相关。除了在此明确提及的被测量以外，还有可与SPR曲线的形状相关的其它可设想的被测量。
在本发明的任何方面的实施方式中，被测量（x1i和x2j）在SPR曲线中的规定的角度处的反射率值之中选择。
在本实施方式中，使用“原始的”反射率或光强度值，且不进行在曲线位置或形状方面的再计算。一个优点是不必须做出关于哪些被测量耦合到折射率以及哪些耦合到吸收率的假设。
可借助于各种多变量模式识别技术或软建模技术来评估数据。
因此，从本实施方式得出结论：当使用用于确定在步骤a）和b）中的被测量的不同的规定角度或不同的规定波长时，如果这个被测量与折射率和吸收率均相关，则第一和第二方面中的步骤a）和b）的被测量可以是相同的被测量，例如反射率值。作为实例，当使用具有角读出的SPR传感器时，原始的反射率值是与折射率和吸收率均相关的被测量。因此，在一个规定角度处确定物理被测量可以给出步骤a）中的x1i，且在另一规定角度处确定同一被测量可给出步骤b中的x2j。另外，相同的被测量可在两个以上的规定角度处被确定，且多变量数据分析可在步骤c）中用于例如确定结合到传感器表面或从传感器表面释放的光学探针的数量。
在本发明的第一方面和第二方面的实施方式中，与所述探针的折射率相关的所述至少一个物理被测量（x1i）的确定在单个波长处进行，且另外，与所述探针的吸收率相关的所述至少一个物理被测量（x2j）的确定在单个波长处进行。
这代表了一种简单的情况，其中测量波长的数目是有限的；它可能仍然足以提高该方法的性能。
在第一和第二方面的实施方式中，与所述探针的折射率相关的所述至少一个物理被测量（x1i）的确定以及与所述探针的吸收率相关的所述至少一个物理被测量（x2j）的确定在同一个单波长处进行。这代表在波长的数量方面的最简单的情况。这种变型的一个明显的优点是实验的简单性；单波长LED或激光器可用作光源，或者宽带光源可连同带通滤波器或固定的单色仪一起使用。
在本发明的第一和第二方面的实施方式中，与所述探针的折射率相关的所述被测量（x1i）的数量是一，且与所述探针的吸收率相关的所述被测量（x2j）的数量是一。
再次，这代表了一种简单的情况，其中被测量的数量被限制到二。两次测量可在两个不同的波长处或在单个波长处执行。在另一方面中，本发明提供了一种方法，其特征在于，被测量的总数大于二。这种情况可提供校准方法基于超定的数据集的优点，在这种情况下，噪声水平可进一步减小。
在本发明的第一和第二方面的实施方式中，所述被测量（x1i和x2j）的总数大于二。
另外，在本发明的第一和第二方面的实施方式中，选择接近所述探针的最大吸收率的波长、优选地在离最大吸收率的波长50nm的范围内且更优选地在离最大吸收率的波长20nm的范围内的至少一个测量波长。
这种实施方式的一个优点是，在接近吸收物质的吸收率最大值处对折射率的影响是小的。为了第一简化近似，光学探针对与折射率相关的被测量的贡献甚至可被忽略，且光学探针可被视为仅对与吸光度相关的被测量作贡献。
作为本发明的第三方面，提供了一种用于校准光学传感器的方法，所述光学传感器用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括如下步骤
a）在至少两个波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量中的至少一个的特定贡献，其中所述方法不涉及改变额外的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放。
结合第三方面使用的术语和定义如关于上述第一和第二方面所定义的。
本发明的第三方面基于下面的见解：通过在至少两个波长处确定与探针的折射率相关的至少一个物理被测量，校准可被执行，而没有来自额外的化学物种到传感器表面的结合的信息，如在本公开的实施例中所看到的。因此，这是有利的，因为它需要用于执行光学传感器的校准的更少的步骤。另外，额外的化学物种将不可逆地结合到该表面和/或改变该表面的化学特性的风险被消除。也可影响表面的化学特性的随后的洗涤步骤也可被排除。
如关于上面的第二方面所描述的，在本发明的第三方面的实施方式中，步骤b）的量化涉及多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、偏最小二乘法或者线性代数或多变量数据分析的任何方法。
在本发明的第三方面的实施方式中，步骤b）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的温度，且还包括量化所述温度的变化对被测量中的至少一个的特定贡献。
所述温度可以以受控的方式被改变。
在第三方面的实施方式中，步骤b）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的组分，且还包括量化所述组分的变化对被测量中至少一个的特定贡献。
所述组分可以以受控的方式被改变。
在第三方面的实施方式中，所述方法不涉及所述光学探针物种分别结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放。
在第三方面的实施方式中，所述方法不另外涉及改变测量噪声。
作为实例，所述方法不另外涉及以受控的方式改变测量噪声。
在第三方面的实施方式中，光学传感器的传感原理基于内反射。
作为实例，光学传感器的传感原理基于光波导折射法、受抑全内反射、基于波导的表面等离子体共振、光栅耦合器折射法、干扰折射法或双偏振干涉测量法。
作为另一实例，光学传感器的传感原理基于具有角读出的表面等离子体共振（SPR）。
作为本发明的第三方面的配置，提供了一种用于校准具有角读出的表面等离子体共振（SPR）传感器的方法，所述SPR传感器用于确定结合到所述SPR传感器表面或从所述SPR传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括以下步骤：
a）在至少两个波长处在SPR曲线中的规定角度处确定至少一个反射率值，及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对反射率值中的至少一个的特定贡献。
因此，校准的这种配置利用了用于校准SPR传感器的“原始”反射率或光强度值，且不需要在曲线位置或形状方面的再计算。一个优点是，不必做出关于哪些被测量耦合到折射率及哪些耦合到吸收率的假设。可借助于各种多变量模式识别技术或软建模技术来评估数据。
这种配置的实例参见实施例2和10。
作为第三方面的这种配置的实例，步骤b）的量化涉及多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、偏最小二乘法或者任何线性代数或多变量数据分析方法。
作为第三方面的这种配置的另一实例，步骤b）包括改变与所述SPR传感器表面接触的介质的温度，且还包括量化所述温度变化对反射率值中的至少一个的特定贡献。
所述温度可以以受控的方式被改变。
作为第三方面的这种配置的实例，所述方法包括改变与所述SPR传感器表面接触的介质的组分，且还包括量化所述组分的变化对反射率值中的至少一个的特定贡献。
所述组分可以以受控的方式被改变。
作为第三方面的这种配置的实例，所述方法不涉及所述光学探针物种分别结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放。
作为第三方面的这种配置的另一实例，所述方法不涉及改变测量噪声。
作为实例，所述方法不涉及以受控的方式改变测量噪声。
本发明的第三方面的配置的实施方式和实例的优点如关于上述本发明的第一方面和第二方面所描述的。
在本发明的第三方面的另一配置中，提供了一种用于校准光学传感器的方法，所述光学传感器用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括以下步骤：
a）在至少两个波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），以及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量中的至少一个的特定贡献，其中步骤b）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的温度，且还包括量化所述温度变化对被测量中的至少一个的特定贡献。
在本发明的第三方面的另一配置中，提供了一种用于校准光学传感器的方法，所述光学传感器用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括以下步骤：
a）在至少两个波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量中至少一个的特定贡献，其中步骤b）包括改变与所述光学传感器表面接触的介质的组分，且还包括量化所述组分的变化对被测量中的至少一个的特定贡献。
在本发明的第三方面的另一配置中，提供了一种用于校准光学传感器的方法，所述光学传感器用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括以下步骤：
a）在至少两个波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量中的至少一个的特定贡献，其中，所述方法不涉及所述光学探针物种分别结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放。
在本发明的第三方面的另一配置中，提供了一种用于校准光学传感器的方法，所述光学传感器用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，该方法包括以下步骤：
a）在至少两个波长处确定与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i），及
b）量化所述光学探针物种的结合或释放对被测量中的至少一个的特定贡献，其中所述方法不涉及改变测量噪声。
在这些配置中，光学传感器的传感原理可以基于内反射。
作为实例，光学传感器的传感原理基于光波导折射法、受抑全内反射、基于波导的表面等离子体共振、光栅耦合器折射法、干扰折射法或双偏振干涉测量法。
作为另一实例，光学传感器的传感原理基于具有角读出的表面等离子体共振（SPR）。
另外，应理解，在本发明的所有校准方面中，量化的步骤可以包括与关于根据本发明的第一方面的相互关联的步骤所描述的相同的数学过程。
作为实例，量化的步骤可以包括确定该组被测量的至少一个函数f：f({x11,...,x1m;x21,...，x2n})，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加，其中m≥1，n≥1。
技术人员理解如何确定函数，使得信噪比增加。这可以例如通过迭代过程来执行。
另外，这意味着f({x11,...,x1m;x21,...，x2n})可被确定，使得与任何x1i或x2j的S/N相比，f({x11,...,x1m;x21,...,x2n})的S/N增加。
作为实例，f可以是线性组合：f＝∑i=1 m(k1ix1i)+∑j=1 n(k2jx2j)。
此外，所述量化可涉及估计f＝∑i=1 m(k1ix1i)+∑j=1 n(k2jx2j)中的至少一个常数k1i或k2j，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。
作为实例，被测量x11和x21被确定，量化的步骤涉及估计f(x11,x21)=x11+k*x21中的常数k，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。
这在本公开的实施例中被进一步论证。
作为本发明的第四方面，提供了与光学探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）和与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j）在用于确定结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的所述光学探针的数量的方法中的用途。
作为本发明的第五方面，提供了在用于减小光学传感器中的噪声的方法中与光学探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）和与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j）的用途。
作为本发明的第六方面，提供了与用于校准光学传感器的光学探针的折射率相关的至少一个物理被测量（x1i）和与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量（x2j）的用途。
在本发明的第四至第六方面中使用的术语和定义如结合上文中本发明的其它方面所定义的。本发明的第四至第六方面是有利的，因为它们提供了结合到光学传感器表面或从光学传感器表面释放的光学探针物种的数量的确定，所述确定较少受噪声影响。
作为本发明的第七方面，提供了光学探针在根据上面的第一至第三方面的任何方法中的用途。
因此，这样的使用是有利的，因为例如，它规定根据上述第一、第二和/或第三方面执行所述方法。
作为本发明的第八方面，提供了一种计算机程序产品，所述计算机程序产品包括计算机可执行组件，当计算机可执行组件在包括在设备中的处理单元上运行时，所述组件用于使设备执行在本发明的方面或实施方式的任何一个中描述的步骤中的任何一个或全部。
作为实例，计算机程序产品可包括用于执行根据本发明的方面的任何方法中的至少步骤c）的软件。因此，计算机程序产品可包括一种软件，其例如用于确定或估计该组被测量的函数f：f({x11,...,x1m;x21，...，x2n})，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加，其中m≥1，n≥1。
作为实例，所述软件可用于估计f＝∑i=1 m(k1ix1i)+∑j=1 n(k2jx2j)中的至少一个常数k1i或k2j，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。因此，所述软件可用于估计f(x11,x21)=x11+k*x21中的常数k，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的光学探针的信噪比（S/N）增加。
另外，所述计算机程序产品还可包括用于实现本发明的实施方式中的不同噪声源的受控的变化的软件。所述软件可带来与光学传感器表面接触的介质的受控的温度变化或受控的组分变化，或实现光学探针或额外的结合物种或其它液体组分的注射。
为了提供本公开的方法和使用的准确实现以及结合到传感器表面或从传感器表面释放的光学探针的确定，本发明人认识到将至少一种光学探针物种与例如关于如何根据本公开的方法和使用在单个试剂盒中使用光学探针的指示组合的价值。
因此，作为本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，其包括至少一种光学探针物种和关于在根据本发明的任何方面的方法中如何使用它的指示。
所述试剂盒还可包含一种或几种试剂、缓冲剂或其它化学制剂，其中至少一种是光学探针物种。光学探针物种可以是例如天然或合成的染料分子、活性染料分子、耦合到另一物种的染料分子、着色的微粒或珠或者着色的蛋白质。因此，所述试剂盒适合用于预期的方法。如以上结合本公开的方法方面所述的，所述试剂盒的各种组件也可被选择及指定。
所述指示包括如何对预期的方法使用所述试剂盒的描述。
另外，作为本发明的第十方面，提供了一种用在光学传感器中的试剂盒，其包括至少一个光学探针和第一组分，该组分引起所述传感器中的可测量的折射率增量（△RI1），且具有约为0的吸收率（ε）。
本发明人也认识到将至少一个光学探针和合适的组分例如缓冲剂组合在单个试剂盒中的价值，该缓冲剂组合引起折射率的增加（△RI1>0），且在所关注的波长处具有低的吸收率（ε）。该组分可以是例如碳水化合物溶液或盐溶液，其可以是无色的。
在第十方面的一种实施方式中，所述试剂盒还包括第二组分，其在所述传感器中引起可测量的折射率增量（△RI2），使得△RI2≠△RI1。
这是有利的，因为它提供了独立于***的折射率的已知的且可测量的折射率。作为实例，△RI2>0且△RI2>△RI1。
在另一实施方式中，所述试剂盒还包括关于如何在上述发明的任何方法方面中使用它的指示。
在又一实施方式中，所述试剂盒还包括根据上述本发明的第八方面的计算机程序产品。
此外，本发明的所述试剂盒还可包含除了光学探针以外的各种辅助物质，以使所述试剂盒能够容易且有效地被使用。辅助物质的实例包括用于溶解所述试剂盒的光学探针的溶剂和洗涤缓冲剂。
附图简述
图1是在两个不同的波长处的两个相同的被测量的SPR测量的实例。在图1a中，分别在670nm和785nm处的SPR最小角的加权差分被绘制为时间的函数。在图1b中，分别在670nm和785nm处的SPR最小角的加权差分被绘制为染料HITCI的浓度的函数。在图1c中，在线性化校准步骤被执行之后，染料HITCI的预测浓度被绘制为实际浓度的函数。
图2是在单个波长处的两个不同的被测量的SPR测量的实例。在图2a中，在785nm处的SPR峰宽和SPR最小角的加权差分被绘制为时间的函数。在图2b中，在785nm处的SPR峰宽和SPR最小角的加权差分被绘制为染料HITCI的浓度的函数。在图2c中，在线性化校准步骤被执行之后，染料HITCI的预测浓度被绘制为实际浓度的函数。
图3是在单个波长处的单个被测量的SPR测量的实例。在图3a中，在785nm处的SPR峰宽被绘制为时间的函数。在图3b中，在785nm处的SPR峰宽被绘制为染料HITCI的浓度的函数。在图3c中，在线性化校准步骤被执行后，染料HITCI的预测浓度被绘制为实际浓度的函数。
图4是在两个不同的波长处的两个相同的被测量的SPR测量的另一实例。在图4a中，分别在785nm和670nm处在恒定的角度处的反射光强度和光强度的加权和被绘制为时间的函数。在图4b中，分别在785nm和670nm处的反射光强度的加权和被绘制为染料HITCI的浓度的函数。在图4c中，在线性化校准步骤被执行后，染料HITCI的预测浓度被绘制为实际浓度的函数。
图5针对三种样本示出了（峰宽-0.1*最小角度）在670nm处测量的度数的计算的值。面板a/示出了在大约14分钟时的蔗糖样本峰值，面板b/示出了在636nm处的染料吸收，且面板c/示出了在740nm处的染料吸收。
图6针对两个样本示出作为时间的函数的光强度，其中流体***中的色散被最小化。面板a/示出了蔗糖样本，且面板b/示出了在636nm处的染料吸收。
图7示出了用于生物素到链霉抗生素蛋白表面上的吸附的传感图，即，作为时间的函数的所测量的SPR光强度。图7a示出了染料标记的生物素的注射，图7b示出了未标记的生物素的注射，而图7c再次示出了标记的生物素的传感图，但现在被重新计算为在两个不同波长处的所测量的光强度的线性组合。
实施例
现将通过下面的非限制性实施例说明本发明的方法。
实施例1
本实施例在具有角读出的SPR仪器上执行，且在670nm和785nm处全角扫描被连续记录。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片。缓冲剂的连续流动用于基线读数。在0.001-0.2mg/ml的范围内的不同浓度的染料HITC碘化物（Aldrich252034）以及在2-8％范围内的不同浓度的乙醇被注射。染料具有接近740nm的强的吸光度最大值。乙醇注射用作故意的总组分干扰，且还用作模拟的非特异性结合干扰——这被很好地激励，因为对被测量的相对影响预期对于分别溶解和结合的相同种类的分子是相同的。另外，通过将仪器调温器升高了+4°C来引入故意的热干扰。从角扫描中，根据表1的被测量被提取和记录为时间的函数。
表1
与基线相比，Theta=SPR最小角，与基线相比，在25％强度处的峰宽PW=SPR，根据实施例1a计算Thetadiff，根据实施例1b计算Anglediff。
实施例1a
使用在两个不同的波长处的两个相同的被测量的评估。在这个实施例中，使用了在670nm和在785nm处的Theta的值。在第一校准步骤中，通过形成如下差分来最小化乙醇干扰：
Thetadiff＝Theta(670nm)-1.25*Theta(785nm)在这种情况下，校准因子为-1.25。在第二校准步骤中，通过再次形成加权差分来最小化热干扰；结果是，校准因子-1.25在这种情况下也很好地起作用，且因此该因子自始至终被使用。在图1a中，绘制Thetadiff相对于时间的关系曲线。在112分钟及以上时组分和热干扰在很大程度上被消除。在图1b中，绘制Thetadiff相对于HITCI浓度的关系曲线。被定义为接近零浓度的曲线的斜率并校正无色的碘化物平衡离子的权重的灵敏度（HITC离子的基于质量的差分折射率增量）为大约30ml/g（使用转换因子0.01RIU/°，其在该波长区域内对SPR近似有效。RIU=折射率单位）。相比于共同的参照物质，例如蔗糖（其折射率增量为0.145ml/g），增强为因子200。结果是，响应是有些非线性的。通过使用HITC样本的一个子集（77、83、95min）作为校准集并计算校准曲线来执行第三校准步骤。然后，通过使用该校准曲线来估计其余HITC样本——模拟未知样本——的浓度。在图1c中，绘制如此估计的浓度相对于真实浓度的关系曲线。该曲线在很大程度上是线性的。这个实施例表明，通过应用适当的校准过程，可以获得高灵敏度，可在很大程度上消除实验噪声且响应可成为线性的。
用在与实施例1a类似的过程中的合适的试剂盒可以例如包括1-3种不同浓度的参照化合物（如乙醇、甘油、蔗糖或蛋白质）的溶液、2-4种不同浓度的染料（例如HITC）的溶液以及用于分析的问题的适当的染料标记的试剂，其使用与用于校准的染料相同或光谱上相似的染料来被人工标记。染料标记的试剂可包括例如标记的分析物、标记的分析物类似物、具有与分析物相似的结合特性的标记的物质、标记的二级或三级试剂或者可结合到分析物的标记的物质。
实施例1b
在单个波长处使用两个不同的被测量的评估。在这个实施例中，使用了在785nm处的Theta和PW（在25%强度处的峰宽）的值。在第一校准步骤中，通过形成如下差分来最小化乙醇干扰：
Anglediff＝PW(785nm)-0.05*Theta(785nm)
在这种情况下，校准因子为-0.05。在第二校准步骤中，通过再次形成加权差分来最小化热干扰；结果是，校准因子-0.05在这种情况下也很好地起作用，且因此这个因子自始至终被使用。在图2a中，绘制Anglediff相对于时间的关系曲线。在112分钟及以上时，组分和热干扰基本上被消除。在图2b中，绘制Anglediff相对于HITCI浓度的关系曲线。被定义为接近零浓度的曲线的斜率并校正无色的碘化物平衡离子的权重的灵敏度（HITC离子的基于质量的差分折射率增量）为大约30ml/g（使用转换因子0.01RIU/°，其在该波长区域内对SPR近似有效）。相比于共同的参照物质，例如蔗糖（其折射率增量为0.145ml/g），增强为因子200。结果是，响应更确切地是非线性的。通过使用HITC样本的一个子集（77、83、95min）作为校准集并计算校准曲线来执行第三校准步骤。然后，通过使用该校准曲线来估计其余HITC样本——模拟未知样本——的浓度。在图2c中，绘制如此估计的浓度相对于真实浓度的关系曲线。该曲线在很大程度上是线性的。这个实施例表明，通过应用适当的校准过程，可以获得高灵敏度，可在很多程度上消除实验噪声，且响应可成为线性的。
用在与实施例1b类似的过程中的合适的试剂盒可以例如包括1-3种不同浓度的参照化合物（如乙醇、甘油、蔗糖或蛋白质）的溶液、2-4种不同浓度的染料（例如HITC）的溶液以及用于分析的问题的适当的染料标记的试剂，其使用与用于校准的染料相同或光谱上相似的染料来被人工标记。染料标记的试剂可包括例如标记的分析物、标记的分析物类似物、具有与分析物相似的结合特性的标记的物质、标记的二级或三级试剂或者可结合到分析物的标记的物质。
实施例1c
在单个波长处使用单个被测量的评估。在这个实施例中，使用了在785nm处的峰宽的值。在图3a中，绘制峰宽（785nm）相对于时间的关系曲线。峰宽（785nm）显示了对HITC浓度的很强的依赖性，但对乙醇浓度和温度只有非常弱的依赖性。在112分钟及以上时组分和热干扰如与Theta值相比大大减小。在图3b中，绘制峰宽（785nm）相对于HITCI浓度的关系曲线。被定义为接近零浓度的曲线的斜率并校正无色的碘化物平衡离子的权重的灵敏度（HITC离子的基于质量的差分折射率增量）是约30ml/g（再次使用转换因子0.01RIU/°，其原则上对SPR最小角差分是有效的，但在此为了比较的目的而被使用）。相比于共同的参照物质，例如蔗糖（其折射率增量为0.145ml/g），增强是因子200。结果是，响应是强烈地非线性的。通过使用HITC样本的一个子集（77、83、95min）作为校准集并计算校准曲线来执行校准步骤。然后，通过使用该校准曲线来估计其余HITC样本——模拟未知样本——的浓度。在图3c中，绘制如此估计的浓度相对于真实浓度的关系曲线。该曲线在很大程度上是线性的。这个实施例表明，通过应用适当的校准过程，可以获得高灵敏度，可在很多程度上消除实验噪声，且响应可以成为线性的。
用在与实施例1c类似的过程中的合适的试剂盒可例如包括0-3种不同浓度的参照化合物（如乙醇、甘油、蔗糖或蛋白质）的溶液、2-4种不同浓度的染料（例如HITC）的溶液以及用于分析的问题的适当的染料标记的试剂，其使用与用于校准的染料相同或光谱上相似的染料来被人工标记。染料标记的试剂可包括例如标记的分析物、标记的分析物类似物、具有与分析物相似的结合特性的标记的物质、标记的二级或三级试剂或者可结合到分析物的标记的物质。
实施例2
该实施例在具有角读出的SPR仪器上执行，但在670nm和785nm处在固定角处的反射光强度被记录。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片。缓冲剂的连续流动用于基线读数。在0.2-50ppm（mg/l）范围内的不同浓度的染料HITC碘化物（Aldrich252034）以及在2-4％范围内的不同浓度的乙醇被注射。乙醇注射用作故意的总组分干扰，且也用作模拟的非特异性结合干扰。另外，通过将仪器调温器升高了4°C来引入故意的热干扰。强度被测量被记录为时间的函数并在表2中被总结。
表2使用因子1.7计算的Intdiff
时间(min) HITCI浓度(ppm) -Intdiffdiff
45 50 0,05655
56 20 0,0321
69 5 0,0234
91 2 0,01175
109 1 0,0075
130 0,5 0,0094
152 0,2 0,00415
164 0,2 0,0043
181 0,5 0,0067
191 1 0,0075
213 2 0,01545
227 5 0,03295
245 20 0,03705
260 50 0,06685
265 2%EtOH
300 4%EtOH
310 △T 4°C
在第一校准步骤中，通过形成如下差分来最小化乙醇干扰（其中Int是相比于基线的强度）：
Intdiff＝Int(670nm)+1.54*Int(785nm)
在这种情况下，校准因子为1.54。在第二校准步骤中，通过再次形成加权差分来最小化热干扰：
Intdiff＝Int(670nm)+1.88*Int(785nm)。
在这种情况下，校准因子为1.88。因为对于这两种情况都很好地起作用的单个因子可能未被发现，所以使用相当任意的中间因子1.7。在图4a中的下部曲线中，绘制Intdiff相对于时间的关系曲线。（为了比较的目的，分别在670nm和785nm处的强度被示为具有偏移量的两个上部曲线）。在265分钟及以上时组分和热干扰减小了约80%。在图4b中，绘制Intdiff相对于HITCI浓度的关系曲线。被定义为接近零浓度的曲线图的斜率并校正无色的碘化物平衡离子的权重的灵敏度是约0.0063强度单位/ppm。当二阶多项式被拟合到在HITC峰值之间的基线的多个约10分钟部分时被估计为残余均方根误差的短期基线噪声是0.000047强度单位。通过用灵敏度除以噪声获得的浓度单位中的噪声水平为7.5ppb（μg/l）。被定义为噪声水平的3倍的探测限制是23ppb。噪声水平也可转换成类似的无标记的情况。对应于7.5ppb的无色物质的噪声水平——再次使用具有0.145ml/g的折射率增量的参照化合物蔗糖作为实例——是1nRIU。作为对比，商业SPR仪器的噪声水平通常在100-10000nRIU范围内。结果是，响应是强烈地非线性的。通过使用HITC样本的一个子集（130、245、260min）作为校准集并计算校准曲线来执行第三校准步骤。然后，通过使用该校准曲线来估计其余HITC样本——模拟未知样本——的浓度。在图4c中，绘制如此估计的浓度相对于真实浓度的关系曲线。该曲线在很大程度上是线性的。这个实施例表明，通过应用适当的校准过程，可以获得高灵敏度，可在很多程度上消除实验噪声且响应可成为线性的。
用在与实施例2类似的过程中的合适的试剂盒可例如包括1-3种不同浓度的参照化合物（如乙醇、甘油、蔗糖或蛋白质）的溶液、2-4种不同浓度的染料（例如HITC）的溶液以及用于分析的问题的适当的染料标记的试剂，其使用与用于校准的染料相同或光谱上相似的染料来被人工标记。染料标记的试剂可包括例如标记的分析物、标记的分析物类似物、具有与分析物相似的结合特性的标记的物质、标记的二级或三级试剂或者可结合到分析物的标记的物质。
实施例3
竞争分析法经常用在SPR中。这是一个概念性实施例，其描述了这样的分析法。SPR传感表面涂有对分析物具有亲和力的抗体，且SPR现象被监测。首先，使用具有不同的但已知的浓度的分析物以及用合适的染料标记的分析物或分析物类似物的混合物，校准曲线延续。用实施例1和2中概述的任何方法来评估数据。例如SPR最小角在稍高于染料的最大吸收波长的波长处和稍低于如实施例1a中的最大吸收波长的波长处被监测，噪声的影响被去除，且校准曲线被确定。通过校准，进行对所标记的分析物类似物特定的测量，即只监测标记的数量。可选地，SPR最小角和峰宽在染料的最大吸收波长的附近的单个波长处被评估，且该数据如实施例1b所陈述的被评估。可选地，SPR峰宽仅仅在染料的最大吸收波长附近的单个波长处被评估，且该数据如实施例1c所陈述的被评估。在这种情况下，测量对于染料标记不是完全特定的，但来自标记的分析物的信号比来自未标记的分析物的信号更强，因此来自未标记的分析物的信号可在第一近似程度上被忽略。可选地，反射光强度在稍高于染料的最大吸收波长的固定波长处和稍低于最大吸收波长的固定波长处被监测，且该数据如实施例2所陈述的被评估。其次，未知的样本与已知浓度的标记的分析物类似物混合，从染料发出的SPR信号被确定，且未知样本中的分析物的浓度从校准曲线确定。
适合于这个实施例的试剂盒如实施例1和2中所概述的。
实施例4
抑制分析法经常用在SPR中。这是一个概念性实施例，其描述了这样的分析法。SPR传感表面涂有分析物或分析物类似物，且SPR现象被监测。首先，使用具有不同的但已知的浓度的抗体的预平衡的混合物，校准曲线延续，所述抗体用合适的染料标记，对分析物具有亲和力。用实施例1和2中所概述的任何方法评估数据。其次，未知的样本与已知浓度的标记的抗体混合，且被允许平衡。从染料发出的SPR信号被确定，且未知样本中分析物的浓度从校准曲线确定。
适合于这个实施例的试剂盒如实施例1和2中所概述的。
实施例5
夹心分析法经常用在SPR中。这是一个概念性实施例，其描述了这样的分析法。SPR传感表面涂有对分析物具有亲和力的抗体，且SPR现象被监测。首先，使用不同但已知浓度的分析物，校准曲线延续。在每次分析物注射之后，用合适的染料标记的对分析物具有亲和力的二级抗体被注射。从染料发出的SPR信号被确定并通过实施例1或2中所概述的任一校准过程来评估。其次，包含未知浓度的分析物的样本被注射，其后跟随标记的二级抗体的注射，且浓度从校准曲线确定。
实施例6
分子间的相互作用的动力学和平衡常数的确定经常使用SPR来完成。这是使用了由本发明提议的方法的竞争动力学分析法的概念性实施例。SPR传感表面涂有对配位体具有亲和力的受体，且SPR现象被监测。首先，不同但已知浓度的配位体或用合适的染料标记的配位体类似物在使用中（run），从染料发出的SPR信号被确定，且动力学常数kon和koff及平衡常数KD被确定。配位体类似物具有与对配位体相同的对受体的亲和力。数据评估方法涉及实施例1或2中所描述的任一方法。其次，待研究的配位体和标记的配位体类似物的混合物在使用中。现在，配位体和配位体类似物竞争表面上的相同的亲和力位置。从染料发出的特殊信号被实时监测，且配位体-受体的相互作用的动力学和平衡常数通过竞争动力学的数学方法来计算（R.Karlsson，Anal.Biochem.1994，221，142；R.Karlsson，A.Falt，J.Immunol.Methods1997，200，121）。
通过使用本实施例中概述的方法，对相同的受体具有亲和力的许多不同的配位体的动力学和平衡常数可通过与相同的标记的配位体类似物，即参照化合物的竞争和比较来确定。另外，可执行不同配位体的快速的亲和力排序。本方法在药物筛选和片段筛选内可能是特别有用的，其中通常研究具有大量不同的配位体的受体的相互作用。使用本实施例中概述的方法的优点包括：来自染料分子的信号比来自低分子量配位体的信号更强，通过校准，不同噪声源和背景的影响被去除，且通过校准程序，进行相对于染料的存在特定的测量。
实施例7
直接结合分析法经常用在SPR中。这是一个概念性实施例，其描述了这样的分析法。SPR传感表面涂有单链DNA寡核苷酸，且SPR现象被监测。该表面与包含用合适的染料标记的互补DNA链的样本接触。首先，使用实施例1或2中所概述的任一`方法来执行校准。然后，通过分析染料特有的SPR信号，DNA链的相互作用被研究。该相互作用包括结合和重排动力学及浓度的确定。
实施例8
本实施例在具有角读出的SPR仪器上执行，且完整的角扫描在670nm处被连续记录。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片。缓冲剂的连续流动用于基线读数。首先，缓冲剂中的1％蔗糖被注射作为未着色的参照。然后，溶解在缓冲液中的在636nm处具有最大吸收率200000M-1cm-1的36ppm染料被注射，作为具有稍低于SPR波长的最大吸收波长的染料的实例。最后，在740nm处具有最大吸收率215000M-1cm-1的58ppm的染料被注射，作为具有稍高于SPR波长的最大吸收波长的染料的实例。在25％强度处的SPR最小角和SPR峰宽被监测。对于蔗糖样本，最小角的变化为约0,18°。对于所有样本，加权差分（峰宽-0.1*最少角）被计算。该加权差分在图5中被绘制。对于636nm染料，加权差分等于约0,06°，其在每单位质量的基础上与蔗糖的最小角位移相比对应于约90x的增强。对于740nm的染料，加权差分等于约0,075°，其在每单位质量的基础上与蔗糖的最小角位移相比对应于约75x的增强。对于蔗糖样本，加权差分在很大程度上是可忽略的。
实施例9
与实施例8中类似的设置被使用，但SPR信号被读作在恒定的角度76°处的光强度。蔗糖和636nm染料再次被使用。流速为40μΙ/min。样本通过用该样本填充100μΙ的注射回路（loop）并将注射阀转到注射位置来引入。然而，在仅60s后，即，在大部分样本已离开注射回路之前，注射阀被转回到装载位置，从而中断了注射。这被完成，以便最小化流体***中的样本塞子的色散（拖尾）。所得到的注射峰值在图6中示出。如预期的，在没有拖尾的情况下，蔗糖峰值立即返回到基线。染料峰值立即下降到接近基线的值，但有轻微的拖尾，其可能由染料到金表面上的吸附所导致。解释是，染料信号的主要部分由溶液中的染料贡献，且只有可忽略的部分由可能已被吸附的染料贡献。
实施例10
与实施例8中类似的设置被使用，但SPR信号被顺序地读作在两个固定的角度76°和71,5°处的光强度。蔗糖和636nm染料再次被使用。流速为40μΙ/min。首先，缓冲液中的1%的蔗糖被注射作为未着色的参照。然后溶解在缓冲液中的36ppm的636nm染料被注射。在76°处，蔗糖峰值的强度为低于基线的0,024个强度单位，且染料峰值的强度为低于基线的0,018个强度单位。在71,5°处，蔗糖峰值的强度为高于基线的0,045个强度单位，且染料峰值的强度为低于基线的0,004个强度单位。加权和[(在76°处的强度变化)+0533×(在71,5°处的强度变化)]被计算。对于蔗糖，这个加权和为零。对于染料，加权和等于0,020个强度单位。在每单位质量的基础上且相比于蔗糖在71,5°处的强度变化，这对应于约120x的增强。
实施例11
在本实施例中，在两个不同的波长670nm和785nm处在固定的角处读取反射的光强度的SPR仪器被使用。SPR芯片是金覆盖的玻璃芯片，一层抗生蛋白链菌素已集中到了玻璃芯片的表面上。在第一流动通道中，该芯片与含有使用在751nm处吸收的染料标记的1000ng/ml的生物素的溶液接触。在第二流动通道中，该芯片与含有10000ng/ml的未标记的生物素的溶液接触。在670nm处所得到的传感图在图7中示出。在注射期间的脉冲形状的信号主要是由于所注射的溶液的体积折射率不同于基线缓冲剂的体积折射率。生物素实际上不可逆地结合到抗生蛋白链菌素，因此吸附的生物素的数量分别在注射脉冲之前和之后被测量作为基线移动。图7a表明，所标记的生物素的吸附——尽管有强的基线漂移——引起了-0,0004个强度单位的完全可量化的信号。另一方面，图7b表明，即使在10倍强的浓度时，未标记的生物素也不引起可探测的信号。注意，在670nm处，预期染料标记会导致负移动（强度减小），而预期无色物质会导致正移动（强度增加）。图7c再次示出了所标记的生物素的传感图，但其现在被绘制为线性组合[强度（760nm）+4*强度（785nm）]。来自体积折射率差分脉冲的贡献被有效地去除，且生物素的吸附动力学和不可逆的结合被清楚地示出。因此，实施例11清楚地论证了在使用本公开的方法时的优点。
当然，本发明不限于上面具体描述的方面、实施方式及变形或具体的实施例，而是可进行许多变化和修改，而不偏离如以下权利要求中所限定的总的发明构思。

Claims (11)

1.一种确定结合到光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的一种光学探针物种的数量的方法，所述光学传感器基于具有角读出的表面等离子体共振(SPR)，所述方法特征在于，所述确定包括以下步骤：
a)在单个波长处确定主要与所述探针的折射率相关的一个物理被测量x1，其中所述物理被测量x1从SPR曲线的最小反射率角度和重心中选择，且还包括
b)在单个波长处确定主要与所述探针的吸收率相关的一个物理被测量x2，其中所述物理被测量x2从SPR曲线的宽度、标准偏差、偏斜度和峰度中选择，及另外
c)确定该组被测量的至少一个函数f(x1,x2)，该函数f使所述被测量的值与分别结合到所述表面或从所述表面释放的所述一种光学探针物种的所述数量相互关联；
其中步骤c)包括使用所述被测量的值来区别开测量噪声(N)和来自所述光学探针物种的结合或释放的信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述确定至少一个函数f涉及线性代数或多变量数据分析的方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤c)的所述确定至少一个函数f涉及线性回归、多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、或者偏最小二乘法。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)包括确定一组被测量的至少一个函数f(x1,x2)，使得结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的所述光学探针的信噪比(S/N)增加。
5.根据权利要求4所述的方法，其中f是线性组合：f＝k1x1+k2x2，并且k1和k2是常数。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述测量噪声(N)是由于结合到所述表面或从所述表面释放的至少一种额外的化学物种导致的，以及步骤c)包括使用所述被测量的值来区别开所述光学探针物种的结合或释放和所述至少一种额外的化学物种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述测量噪声是由于与所述传感器表面接触的介质的组分的变化造成的，以及步骤c)包括使用所述被测量的值来区别开所述光学探针物种的结合或释放和所述组分的变化。
8.一种用于提高基于具有角读出的表面等离子体共振(SPR)的光学传感器的定量的准确度或精密度的方法，所述光学传感器用于确定结合到所述光学传感器表面或从所述光学传感器表面释放的一种光学探针物种的数量，所述确定受测量噪声影响，其中所述方法包括：
a)在单个波长处或在一个以上的波长处确定主要与所述探针的折射率相关的至少一个物理被测量x1i，其中所述至少一个物理被测量x1i从SPR曲线的最小反射率角度和重心中选择，以及
b)在单个波长处或在一个以上的波长处确定主要与所述探针的吸收率相关的至少一个物理被测量x2j，其中所述至少一个物理被测量x2j从SPR曲线的最小反射值、宽度、标准偏差、偏斜度和峰度中选择，及另外
c)量化所述光学探针物种的结合或释放对所述被测量x1i或x2j中的至少一个的贡献；
其中步骤c)包括改变额外的化学物种分别到所述光学传感器表面的结合或从所述光学传感器表面的释放，且还包括量化所述额外的化学物种的结合或释放对所述被测量中的至少一个的贡献。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤c)的所述量化涉及线性代数或多变量数据分析的方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)的所述量化涉及多元线性回归、主成分分析、因素分析、主成分回归、或者偏最小二乘法。
11.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中对与所述探针的折射率相关的所述至少一个物理被测量x1i的确定和对与所述探针的吸收率相关的所述至少一个物理被测量x2j的确定在同一个单波长处进行。
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