CN103083329B - 苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用。苦玄参苷元1是天然产物，民间用于治疗肺炎、感冒、咽喉炎、跌打损伤、***炎等炎症。实验表明，苦玄参苷元1还能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明提供了苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤可以是肝癌、血癌、***、乳腺癌或者胰腺癌。苦玄参苷元1可以作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用。还包括以苦玄参苷元1为主要活性成分的抗肿瘤药物。

背景技术

苦玄参，通常是指玄参科(Scrophulariaece)植物苦玄参(Picriafel-terrae)的干燥全草,又名苦草、熊胆草、四环素草,为多年生草本植物。全草均可用药,民间用于治疗肺炎、感冒、咽喉炎、跌打损伤、***炎等炎症(广西壮族自治区卫生厅,1992，广西中药材标准[S].南宁，广西科学技术出版社，225)。

已有较多的学者对苦玄参的化合物成分进行了较为***的研究,从中分离到了三萜类、黄酮类及苯乙醇苷类等不同类型的化合物；黄燕等对苦玄参的抗菌消炎活性进行了研究(黄燕,肖艳芬,甄汉深,等.2008.苦玄参体外抗菌作用的实验研究[J].广西中医药,31(1):46-47)；同时,方宏等对苦玄参苷IA和IB的含量进行了分析(方宏,梁小燕,宁德生,etal.2008.苦玄参药材中苦玄参苷IA和IB的含量分析.广西植物,28(5):708-710)；梁小燕等(2007)对苦玄参的指纹图谱进行了研究(梁小燕，方宏，宁德生,et al.2007.桂南地区苦玄参药材RP2HPLC指纹图谱研究[J].广西植物,27(6):948-951)。苦玄参提取物分对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等多种细菌都有一定的抑菌作用。

苦玄参苷元1是苦玄参普元的主要成分,含量约为全草的25％,对四硝基甲烷显淡黄色,示有孤立双键,对三苯基四氮哇、三氯化铁和过碘酸钠皆呈负反应，似无邻羟酮、邻烯醇酮和邻二醇的结构单元。成桂仁等将苦玄参经酸水解后得一系列苦玄参昔元，再通过硅胶柱层析分离得一系列苷元，其中之一便是苦玄参苷元1(成桂仁,金静兰,文永新,陈毓群,甘立宪,周维善.苦玄参化学成分的研究——Ⅰ.苦玄参苷元Ⅰ的结构[J].化学学报,1982,(08))。周维善等则通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、质谱、X-射线衍射等对苦玄参苷元1作了进一步的分析(周维善,甘立宪.苦玄参甙元Ⅰ—Ⅵ(1—6)和苦玄参酮(7)的结构[J].有机化学,1982,(02))。

但是，迄今为止，尚未有关于苦玄参苷元Ⅰ的具体功能报道。

发明内容

本发明的目的是提供苦玄参苷元1的药物用途。

本发明提供了苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤可以是肝癌、血癌、肺腺癌、乳腺癌或者胰腺癌，效果较好有肝癌和白血病等。所述的抗肿瘤药物为针剂或者片剂。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物或者抗白血病药物。

本发明所称的苦玄参苷元1，即文献中的苦玄参苷元1，其结构式如下：

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将苦玄参苷元1加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞是肝癌细胞、血癌细胞、肺腺癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的是肝癌细胞Focus,另一个实施例采用的是血癌(白血病)细胞K562。一般而言，加入苦玄参苷元1的终浓度为0.5-100μM，例如1-50μM,1-12μM，或者采用0.8μM,1.2μM,3,5μM,10μM,15μM,20μM,30μM,40μM等浓度。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是苦玄参苷元1。所述的肿瘤可以是肝癌、肺腺癌、血癌或者胰腺癌。

实验表明，苦玄参苷元1可以抑制肿瘤细胞增殖。例如，苦玄参苷元1对肝癌细胞抑制的IC50在11-45μM。

本发明的小分子化合物苦玄参苷元1可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。也可以从自然界生物中提取。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与苦玄参苷元1发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳的pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的苦玄参苷元1为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的苦玄参苷元1可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的苦玄参苷元1还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的苦玄参苷元1被用作药物时，可将治疗有效剂量的苦玄参苷元1施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用。苦玄参苷元1是天然产物，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。苦玄参苷元1是广西传统中药苦玄参的重要成分，因此，本发明为苦玄参的进一步利用开发提供了一条新渠道。

具体实施方式

实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。K562细胞培养在含10％胎牛血清的1640培养基中，Sk-hep1和Focus细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2..细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合(贴壁细胞)时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3..细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4.药物准备

苦玄参苷元1(购自中国科学院药物研究所)用DMSO溶解，配制成1、10、100μM等浓度待用。

实施例1MTS法测定苦玄参苷元1对K562细胞的生长抑制作用

K562细胞(购自中国科学院细胞库)1×10⁴/孔接种至96孔板,培养24小时使之贴壁后加入苦玄参苷元1(购自中国科学院上海药物研究所)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算苦玄参苷元1对K562细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为K562细胞数量为对照的一半时苦玄参苷元1的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：苦玄参苷元1对K562细胞的IC50值为11.5μM。

实施例2苦玄参苷元1对人肝癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。

步骤：

1)将Focus细胞(购自中国科学院细胞库)均匀的种在96孔板里，每孔细胞数约为3000个。

2)待贴壁，过夜后加药。

3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10：1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：苦玄参苷元1对Focus细胞的IC50值为44.5μM。

实施例3苦玄参苷元1对人Sk-hep1细胞的生长抑制作用

同实施例2的方法，测得苦玄参苷元1对Sk-hep1细胞的IC50值为91.7μM。

实施例4苦玄参苷元1对人胰腺癌细胞的生长抑制作用

同实施例2的方法，测得苦玄参苷元1对PANC-1细胞的IC50值为275μM。

Claims (9)

1.苦玄参苷元1在制备抗肿瘤药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌或者白血病。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗白血病药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，将苦玄参苷元1加入体外培养的肿瘤细胞的培养液中。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞者白血病细胞。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，加入苦玄参苷元1的终浓度为1-100μM。

8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是苦玄参苷元1。

9.如权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌或者白血病。