CN103099805A

CN103099805A - 异甜菊醇衍生物h14在制备抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN103099805A
Application number: CN2011103617828A
Authority: CN
Inventors: 余龙; 胡立宏; 刘祖龙
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及一种异甜菊醇衍生物H14在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了H14在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括肝癌细胞、血癌细胞、肺腺癌细胞和胰腺癌细胞。H14属于天然产物，毒副作用小、生物利用度高、性质稳定，具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

异甜菊醇衍生物H14在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及一种异甜菊醇衍生物——H14在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

甜菊醇是20世纪60年代产生的天然甜味剂，由于其在肠道中的降解产物具诱变活性，其类似物异甜菊醇及其衍生物，由于保留了其药理活性而无诱变作用受到关注。异甜菊醇((4α，8β，16β)-13-甲基-16-氧代-17-去甲贝壳杉烷-18-酸，3)属于四环二萜类化合物，可将甜菊苷酸水解得到。

H14(4α-carboxy-13α-amino-13，16-seco-ent-19-norbeyeran-16-oic acid lactam)，为异甜菊醇衍生物，在本发明中简称为H14，其结构如下：

东南大学吉民等在其发明专利中详述了H14可以通过环戊酮的重排得到。如下式所示，

异甜菊醇通过与NH₂OH，HCl反应，环戊酮中的羰基被还原，后中间产物加入SOCl₂使之重排，得到H14(200810242955.2，异甜菊醇衍生物及其应用，吉民等)。

Chang Shwu-Fen等人于2009年运用生物学方法合成异甜菊醇内酰胺，并研究了其生物学功能。将异甜菊醇环己酮(Isosteviol oxime)与两种微生物Aspergillus niger BCRC 32720和Absidia pseudocylidrospora ATCC 24169进行生物转化，能够将D-环转变成内酰胺和内酯。在NF-κB和AP-1介导的荧光素酶报告基因试验中，发现H14等数十种异甜菊醇衍生物具有抑制NF-κB和AP-1活性的作用，尤其H14能够显著地抑制NF-κB的活性(Chang Shwu-Fen.Microbial transformation of isosteviol oxime and the inhibitory effects on NF-κB and AP-1activation in LPS-stimulated macrophages.Bioorgainc & Medicinal Chemistry.2009，17：6348-6353)。Militsina OI等2005年运用Beckmann反应合成异甜菊醇内酯的同时也得到了H14，反应过程将16-E-环己酮异甜菊醇与高浓度的盐酸(或25％硫酸)混合，加热到110摄氏度反应10h(Militsina OI et.Transformation of isosteviol oxime to a lactone under Beckmannreaction conditions.MENDELEEV COMMUNICATIONS.2005，1：27-29.)。

H14毒副作用小、生物利用度高、性质稳定，具有临床使用价值。随着人们对此类生物碱的化学和生物学研究的深入，其分子作用机制将逐步明确，这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究，并有助于提高此类化合物的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种异甜菊醇衍生物H14的药物用途。

本发明提供了H14在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物、抗肺腺癌药物或者抗血癌药物。该抗肿瘤药物可以是针剂或者片剂。

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将H14加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞、血癌细胞、肺腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是HGC。一般而言，加入H14的终浓度为1-150μM。例如，1-20μM，1-15μM，1-5μM，5-15μM，5-20μM，15-20μM；也可以采用较大的剂量，例如20-150μM，150-600μM，等等。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是H14。所述的肿瘤可以是肝癌、血癌、肺腺癌或者胰腺癌。

本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与H14发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的H14为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的H14可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的H14还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的H14被用作药物时，可将治疗有效剂量的H14施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了H14在制备抗肿瘤药物中的应用。H14是天然产物，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

具体实施方式

实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10％ Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，HGC和QGY细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％ DMSO，40％ DMEM和50％ Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

4.药物准备：

H14溶于DMSO(二甲基亚砜)，配制成100mM或50mM的母液备用。

实施例1 MTS法测定H14对肝癌细胞的生长抑制作用

HGC细胞(购自中国科学院细胞库)3×10³/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入H14(购自中国科学院上海药物研究所)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％ CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算H14对HGC细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HGC细胞数量为对照的一半时H14的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：H14对HGC细胞的IC50值为151.96μM。

实施例2 H14对人肺腺癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。

步骤：

1)将A549细胞(购自中国科学院细胞库)均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为3000个。

2)待贴壁，过夜后加药，加药(H14浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM，每个浓度有3个复孔。

3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10∶1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：H14对A549细胞的IC50值为3.48μM。

实施例3 H14对人胰腺癌细胞的作用

按照实施例2的方法，H14对PANC-1细胞的IC50值为600.14μM。

实施例4 H14对人白血病细胞的作用

按照实施例2的方法，每孔种10⁵个细胞，结果显示H14对K562细胞的IC50值为18.53μM。

Claims

1.H14在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的H14结构式如下：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、血癌、肺腺癌或者胰腺癌。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗白血病药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，该抗肿瘤药物为针剂或者片剂。

6.一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将H14加入肿瘤细胞的培养液中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞、肺腺癌细胞或者胰腺癌细胞。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加入H14的终浓度为1-150μM。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是H14。

10.如权利要求9所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、血癌或者肺腺癌。