CN103127051A - 莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化工领域及医药领域，涉及莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括肝癌细胞、白血病和胰腺癌细胞。莪术醇属于天然产物，生物利用度较高、性质稳定，具有临床使用价值。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手段。

Description

莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于化工领域及医药领域，涉及莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

莪术醇又名姜黄环奥醇，是姜科植物莪术的提取物，为无色针状结晶，易溶于***、氯仿，溶于乙醇，微溶于石油醚，几乎不溶于水，在水中溶解度仅为0.3％。

相应参数为：

M.Wt：236.35

Formula：C₁₅H₂₄O₂

Solubility：Unknown

Purity：＞99％

Storage：at-20℃ 2years

CAS No.：4871-97-0

传统的从蓬莪术、温郁金中提取莪术醇的方法，基本上是用甲醇或水提取，然后进行蒸汽蒸馏，再经乙酸乙酯或者无水乙醇重结晶得到莪术醇[Hiroshi H，Kanji M，Yojiro S，etal.Structure of curcumol.[J].Chem Pharm Bull，1965，13(12)：1484，许洪霞，郑淑忱，左士贤，等.温莪术抗肿瘤有效成分的研究-莪术醇和莪术二酮的分离和鉴定[J].中草药通讯，1979，10(10)：11.]，得到的产率和纯度较低，需经硅胶柱分离等后续纯化。

最近，莪术醇结晶制备工艺有所改进。孟昭珂等直接对莪术油进行真空分馏，得到的馏分不经硅胶柱分离而直接重结晶制备莪术醇，收率可达30％，纯度可达96％[孟昭珂，付美珍.莪术醇的提取工艺[P].中国专利：CN-1704417，2005-12-07.]。王鎏祥等用超临界萃取联用溶胀结晶法从莪术饮片中提取到含量高于90％的细粉末状莪术醇晶体[王鎏祥，张朝晖，马朝阳.莪术醇超临界结晶的研究[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2007，28(3)：81.]。王婷等建立了以莪术油为原料，减压蒸馏提取莪术醇的新方法[王婷，李铁福，林绍强，等.莪术醇的分离鉴定及含量测定[J].中华中医药学刊，2008，26(5)：1 018.]。

基因芯片技术研究发现，莪术醇可降低肝星状细胞转化生长因子β1、细胞色素P450a表达，提示其具有抗肝纤维化的潜能[江远，李泽松，江福生，等.莪术醇对肝星状细胞-T6细胞基因表达的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2005，13(3)：144.]。在激素加肾上腺素制作的大鼠血瘀模型中，莪术醇显示出一定的抗血栓作用[唐泽耀，宗成国，林原.莪术醇的活血化瘀活性实验研究[J].中药药理与临床，2003，19(5)：15.]。此外，莪术醇还具有较明显的抗生育作用，用于作饵剂，降低雌鼠繁殖率和平均胎仔数，以防控农田鼠害[马金宝，张丹华，庄文君，等.莪术醇饵剂防治农田害鼠示范[J].中国植保导刊，2007，27(1)：34.王庭林，张慧娣，赵日良，等.抗生育剂莪术醇对区域性害鼠的控制效应研究[J].山西农业科学，2007，35(9)：53.]。此外，莪术醇还被证明有一定的细胞毒性。

莪术醇是天然产物，生物利用度较高、性质较稳定，具有临床使用价值。随着人们对此类生物碱的化学和生物学研究的深入，其分子作用机制将逐步明确，这将进一步推动此类化合物的化学结构修饰和构效关系研究，并有助于提高此类化合物的药用价值。

发明内容

本发明的目的是提供莪术醇的新的药物用途。

本发明提供了莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤可以是肝癌、白血病、肺腺癌或者胰腺癌。所述的抗肿瘤药物为针剂或者片剂。所述的抗肿瘤药物可以是抗肝癌药物或者抗肺腺癌药物。

本发明提供了一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，将莪术醇加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞是肝癌细胞、血癌细胞、肺腺癌细胞、乳腺癌细胞或者胰腺癌细胞。本发明的一个实施例中采用的肝癌细胞是QGY和HepG2，采用的胰腺癌细胞是PANC-1，采用的血癌细胞是K562。一般而言，加入莪术醇的终浓度为0.5-100μM，较好的，可以采用1-10μM，1-100μM，甚至0.5-1μM。例如，0.1-5μM，0.1-10μM，0.1-20μM，0.1-30μM，1-5μM，0.3-60μM，0.3-50μM，0.3-30μM，0.3-20μM，0.3-10μM，0.3-5μM，0.5-5μM，等等。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物的活性成分是莪术醇。所述的肿瘤可以是肝癌、血癌或者胰腺癌。

本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学合成的方法。

利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与莪术醇发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明及其抑制剂、拮抗剂等，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的莪术醇为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的莪术醇可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的莪术醇还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的莪术醇被用作药物时，可将治疗有效剂量的莪术醇施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明提供了莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是首次公开了对于肝癌和白血病细胞的具体抑制效果。莪术醇属于天然产物，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物或者其辅助成分进行开发，抑瘤效果明显，绿色环保，将为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径。同时，也为进一步开发我国传统中草药提供了一个手段。

具体实施方式

实验方法：

1.细胞复苏

1)从液氮罐中取出冻存管，直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2)从37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并加入10倍以上培养液，混合后低速离心，弃上清，再重复用培养液洗一次。

3)用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。培养至一定浓度时进行传代。PANC-1细胞培养在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培养基中，Hep G2和QGY细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中，K562细胞培养在含10％胎牛血清的1640培养基中。培养基中含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2.细胞传代培养

每天观察细胞生长的情况，当细胞在培养瓶中长至约90％汇合(贴壁细胞)时传代，约每隔2-4天传代一次。一瓶传代成三瓶，或一个25cm²传代于一个75cm²的培养瓶中。方法：

1)用1×磷酸缓冲液洗涤细胞一次。

2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培养箱中数分钟。用手拍打细胞培养瓶，使细胞分离。

3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合适培养基终止胰酶消化。将细胞分装于新的培养瓶中，继续培养。

3.细胞冻存

1)取培养至对数生长期的细胞胰蛋白酶消化，收集于离心管中并计数，离心。

2)弃除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配置好的冻存培养液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，冻存液中细胞的最终浓度为0.5-1×10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每管加1-1.5ml。

3)将冻存管放入冻存盒置-80℃速冻，5小时后移入液氮罐中保存。

实施例1MTS法测定莪术醇对肝癌细胞的生长抑制作用

HepG2细胞(购自中国科学院细胞库)1×10³/孔接种至96孔板，培养24小时使之贴壁后加入莪术醇(购自selleckchem公司，S2407，Curcumol，公司网址http://www.selleckchem.com/products/Curcumol.html)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在37℃，5％CO₂条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞存活率。

测试方法为：将细胞用无血清培养基洗一遍，按照100μl/well的量加入预先配制好的MTS显色溶液(10ml无血清培养基中加入2ml溶液1和100μl溶液2，充分混匀)。将一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继续培养2～4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)，计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。根据细胞存活率，计算莪术醇对HGC细胞的IC50值。

IC50是指被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为HepG2细胞数量为对照的一半时莪术醇的浓度。IC50的计算一般需要测定5个以上的剂量效应，再通过曲线拟合得到函数计算而得。

结果：莪术醇对Hep G2细胞的IC50值为0.96μM。

使用同样方法，测得莪术醇对QGY细胞(购自中国科学院细胞库)的IC50值为0.60μM。

实施例2莪术醇对人胰腺癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。

步骤：

1)将PANC-1细胞(购自ATCC)均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为3000个。

2)待贴壁，过夜后加药，加药浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM，每个浓度有3个复孔。

3)培养48小时，将完全培养基替换成无血清培养基与CCK8的混合物(10∶1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：莪术醇对PANC-1细胞的IC50值为1429μM。

实施例3莪术醇对人血癌细胞的生长抑制作用

利用cck-8试剂盒(日本同仁化学研究所)检测。

步骤：

1)将K562细胞均匀的种在96孔板里，每孔细胞数为一万个。

2)过夜后加药，加药浓度分别为50、16.67、5.56、1.85、0.62μM，每个浓度有3个复孔。

3)培养48小时，加入CCK8的混合物(培养基与cck8的比例为10∶1)，于37℃培养箱孵育2小时。

4)以450nm为测量波长，以650nm为对照波长，于酶标仪上测出读数。

结果：测得莪术醇对K562细胞(购自中国科学院细胞库)的IC50值为1.70μM。

Claims (9)

1.莪术醇在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌或者白血病。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗白血病药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是片剂或者针剂。

5.一种抑制体外肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将莪术醇加入肿瘤细胞的培养液中。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞或者白血病细胞。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，加入莪术醇的终浓度为0.5-100μM。

8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物的活性成分是莪术醇。

9.如权利要求8所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌、或者白血病。