CN114317815A - 一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法 - Google Patents
一种用于扩增猪流行性腹泻病毒s基因n末端高变区的pcr方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及动物病毒学与动物传染病学技术领域，且公开了一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区PCR的引物，本发明依据猪流行性腹泻病毒S基因N端高变异区(V2)，在其两端序列分析获得的保守区域设计了一对引物，用于V2的片段扩增，并可对获得的产物进行后续的毒株分型测序。该方法进一步提供了对临床猪腹泻粪便和肠道组织样品的处理，总RNA的提取、逆转录、PCR、电泳跑胶和结果判定的整个过程。使用该方法，阳性样品可见1823bp片段。本发明所提供的扩增引物保守性好，该PCR方法特异性好、操作简便、迅速，便于临床上对猪流行性腹泻感染的检测，并可对获得产物进行后续序列的分析，用于毒株分型的鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及动物病毒学与动物传染病学技术领域，具体为一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法。
背景技术
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是一种急性、高度传播性疾病，引起该病的主要病原为猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)。该病以呕吐、水样腹泻、脱水等为主要临床特征，各年龄阶段的猪均易感。但对哺乳仔猪致病力强，发病率为100％，死亡率高达80％-100％。PED属alpha-冠状病毒属，为有囊膜、不分节段、单股正链RNA病毒，基因组全长约为28kb，包含5’cap结构和3’polyA尾。PEDV 全基因组由5’端非编码区、3’UTR和至少7个开放阅读框(Openreadingfram，ORF)组成，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b及非结构蛋白ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M 和N)，它们在基因组的顺序为5’UTR-P1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。
造成该疫情的为发生变异的PEDV变异株，动物试验已证实PEDV变异株的致病力更强，有经典毒株制备的传统疫苗无法提供有效的免疫保护力。与经典毒株相比，PEDV变异株所具有的的变异特征主要集中于S基因。
PEDVS基因作为该病毒最重要的结构蛋白之一，在病毒入侵和诱导中和抗体中发挥重要作用。S蛋白可划分为S1(第1-789位氨基酸)和S2(第790-1383位氨基酸)两个功能区：，其中S1包含了病毒关键的中和表位(COE)和受体结合域，S2主要负责病毒与宿主的膜融合过程。不同的冠状病毒S基因间的同源性较低；在PEDV内部，不同的毒株间S基因的变异性也很大。S基因也是PEDV病毒各蛋白基因中最易发生变异的基因，针对S基因的同源性分析也是区分病毒亚型的关键方法。
先前的研究已发现，PEDV主要具有4个变异区V1、V2、V3和V4，其中V2位于20,661至22,300碱基区域(参照PEDV变异株参照株AH2012)，而该区域主要集中于S基因的N 端，同时该区域具有诱导中和抗体的最重要结构-COE，所以对于该区域的准确快速扩增，以及后续的序列测定分析，将为临床中PEDV的诊断及其感染型的判断具有重要意义。
为此，申请人通过对多株不同型PEDV毒株的全基因组序列比对分析，在包含PEDVV2 区域的基因序列保守位置，设计合成了一对用于扩增PEDVS基因N末端高变区-V2的PCR 引物，建立了反转录PCR方法，可用于临床中PEDV感染毒株类型分析产物的获得。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，解决了上述的问题。
(二)技术方案
为实现上述所述目的，本发明提供如下技术方案：扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法的引物，其上、下游引物序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2：
上游引物PEDV-V2-F:5’-TGGTAAGTTGCTAGTGCGTAATAAT-3’
下游引物PEDV-V2-R:5’-AAAGACAGGTAATCATTAACAGATT-3’。
扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，包括以下步骤：
(1)临床猪腹泻病料RNA的提取：取100mg稀便或100mg的动物组织，使用组织剪剪碎，加入OMEGA公司RNA提取试剂盒中350μl的TRK裂解液，混匀后，室温放置5min；12000rpm/min离心5min，吸取350μl上清，加入250μl无水乙醇，混匀后，室温静置 5min；将上述液体全部转移到HibindRNAMinicolumn上，10,000g室温离心1min，弃掉废液；将柱子放入一个新的2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferI，10,000g室温离心 1min，弃掉废液；将柱子放到2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferII(乙醇稀释)， 10,000g室温离心30s，弃掉废液；重复上述操作一次；然后将RNA结合柱子放入空收集管中，13,000g室温离心2min,使HiBind基质完全干燥；转移柱子到一个新的1.5ml的Ep 管中，加入50μl的DEPC水洗脱柱子，13,000g室温离心2min，此时所收集液体为提取的总RNA；
(2)总RNA的逆转录：参照invitrogen公司SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase 产品说明书，以OligodT(18)为反转录引物，将RNA反转录为cDNA。
模版体系为：RNA模板12μl，10mMdNTPs1μl，下游引物1μl总体积14μl，混匀后， 65℃水浴5min，然后置于冰浴至少1min。然后配制反应体系：5×First-strandbuffer4 μl，0.1MDTT1μl，反转录酶1μl，总体积6μl。
将上述两个体系混合，置于55℃水浴1h，反应结束后70℃水浴灭活15min，再冰浴3min，将合成完的cDNA保存于-20℃。
(3)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品cDNA；
(3)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；
(4)取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳；
结果判定：有扩增产物约为1823bp条带，为阳性；无扩增产物约为1823bp为阴性。
步骤(2)所述的PCR混合物包括：采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(2.5mM)1.0μl，MgCl2(25mM)1.5μl，上、下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl，DNA模板1μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀。步骤(3)的扩增条件为：94℃,5min，进行预变性；然后94℃,30s，55℃,30s， 72℃,90s共循环35次；最后72℃延伸10min。
本发明用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，阳性对照品为含有PEDV-V2基因的标准阳性质粒，浓度为1.5×1011copies/μl。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，具备以下有益效果：
1、该用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，本发明根据GenBank 中发表的多个猪PEDV经典株和变异株的基因组序列，经过序列比对分析，选取包含高变异区V2的在内的两端保守区域设计并合成一对特异性引物，对猪PEDV阳性样品进行PCR 扩增，得到1823bp的特异性条带。
2、该用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，本研究建立的扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法对其他常见猪冠状病毒：猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒，以及其他常见猪病原体：猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒均无反应。
3、该用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，通过针对临床中猪感染PEDV的粪便和肠组织样品，使用本发明建立的PCR方法检测，均扩增出大小约1823bp的DNA片段，适用于临床病原的检测，获得的扩增片段可用于PEDV感染毒株类型的测序分析。
附图说明
图1为扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法引物的设计示意图；
图2为检测猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法特异性试验电泳结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，包括以下步骤：
(1)临床猪腹泻病料RNA的提取：取100mg稀便或100mg的动物组织，使用组织剪剪碎，加入OMEGA公司RNA提取试剂盒中350μl的TRK裂解液，混匀后，室温放置5min；12000rpm/min离心5min，吸取350μl上清，加入250μl无水乙醇，混匀后，室温静置 5min；将上述液体全部转移到HibindRNAMinicolumn上，10,000g室温离心1min，弃掉废液；将柱子放入一个新的2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferI，10,000g室温离心 1min，弃掉废液；将柱子放到2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferII(乙醇稀释)， 10,000g室温离心30s，弃掉废液；重复上述操作一次；然后将RNA结合柱子放入空收集管中，13,000g室温离心2min,使HiBind基质完全干燥；转移柱子到一个新的1.5ml的Ep 管中，加入50μl的DEPC水洗脱柱子，13,000g室温离心2min，此时所收集液体为提取的总RNA；
(2)总RNA的逆转录：参照invitrogen公司SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase 产品说明书，以OligodT(18)为反转录引物，将RNA反转录为cDNA。模版体系为：RNA模板12μl，10mMdNTPs1μl，下游引物1μl总体积14μl，混匀后，65℃水浴5min，然后置于冰浴至少1min。然后配制反应体系：5×First-strandbuffer4μl，0.1MDTT1μl，反转录酶1μl，总体积6μl。将上述两个体系混合，置于55℃水浴1h，反应结束后70℃水浴灭活15min，再冰浴3min，将合成完的cDNA保存于-20℃。
(3)采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP(2.5mM)1.0μl，MgCl2(25mM)1.5μl，上、下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA 聚合酶0.5μl，DNA模板1μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀。
(4)PCR扩增条件为：94℃,5min，进行预变性；然后94℃,30s，56℃,30s，72℃,1min共循环35次；最后72℃延伸10min。
(4)取10μl上述的PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳，结果稀便和肠道组织扩增产物均约为1823bp，结果大小相符，判为PEDV阳性。
实施例2
按实施例1方法，以猪PEDV阳性病料作为阳性对照，分别对猪其他常见猪冠状病毒：猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒，以及其他常见猪病原体：猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒进行检测，结果均未能扩增出任何条带，而猪PEDV阳性病料扩增出约1823bp的条带，见图1。其序列为SEQIDNO.3：
根据图2，其中泳道1为阴性对照，泳道2为猪PEDV阳性样品；泳道3-8分别为：猪传染性胃肠炎病毒、猪丁型冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒；M表示DNAMarker(DL2000)。
引物序列：
SEQIDNO.1：5’-TGGTAAGTTGCTAGTGCGTAATAAT-3’
SEQIDNO.2：5’-AAAGACAGGTAATCATTAACAGATT-3’
扩增目的基因参考序列：
SEQIDNO.3：PEDV变异株参考株AH2012，20566-22388bp区域
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区PCR的引物，包括上、下游引物，其特征在于：上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.根据权利要求1所述的一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区PCR的引物，其特征在于：所述上游引物PEDV-V2-F:5’-TGGTAAGTTGCTAGTGCGTAATAAT-3’；
下游引物PEDV-V2-R:5’-AAAGACAGGTAATCATTAACAGATT-3’。
3.一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)临床猪腹泻病料RNA的提取：取100mg稀便或100mg的动物组织，使用组织剪剪碎，RNA提取试剂盒中350μl的TRK裂解液，混匀后，室温放置5min，12000rpm/min离心5min，吸取350μl上清，加入250μl无水乙醇，混匀后，室温静置5min，将上述液体全部转移到HibindRNAMinicolumn上，10,000g室温离心1min，弃掉废液，将柱子放入一个新的2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferI，10,000g室温离心1min，弃掉废液，将柱子放到2mL收集管中，加入500μlRNAwashbufferII(乙醇稀释)，10,000g室温离心30s，弃掉废液，重复上述操作一次，然后将RNA结合柱子放入空收集管中，13,000g室温离心2min,使HiBind基质完全干燥，转移柱子到一个新的1.5ml的Ep管中，加入50μl的DEPC水洗脱柱子，13,000g室温离心2min，此时所收集液体为提取的总RNA；
(2)总RNA的逆转录，将样品总RNA逆转录获得cDNA模板；
(3)将上、下游引物与PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待检样品cDNA；
(4)将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；
(5)取PCR产物于质量比为1％的琼脂糖凝胶上电泳；
(6)结果判定：有扩增产物约为1823bp条带，为阳性，即PEDV存在，无扩增产物约为1823bp条带为阴性，即PEDV不存在。
4.根据权利要求3所述的一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR混合液包括：采用25μl的PCR反应体系，在0.2mlPCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5μl，2.5mM的dNTP1.0μl，25mM的MgCl21.5μl，上、下游引物各0.5μl，5U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl，DNA模板1μl，用灭菌超纯水加至总体积，混匀。
5.根据权利要求3所述的一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，其特征在于，步骤(3)的扩增条件为：94℃,5min，进行预变性，然后94℃,30s，55℃,30s，72℃,90s共循环35次，最后72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，其特征在于，所述阳性对照品为含有PEDV-V2基因的标准阳性质粒，浓度为1.5×1011copies/μl。
7.根据权利要求3所述的一种用于扩增猪流行性腹泻病毒S基因N末端高变区的PCR方法，其特征在于，所述的扩增产物约1823bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
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